顏 研,李旭東,裴 超,孔祥會

( 1.河南師范大學(xué) 水產(chǎn)學(xué)院,河南 新鄉(xiāng) 453007; 2.河南省水產(chǎn)技術(shù)推廣站,河南 鄭州 450008 )

近年來,細菌性疾病頻發(fā),抗生素不規(guī)范使用導(dǎo)致細菌耐藥性問題日益嚴(yán)重[1]。研發(fā)新的抗菌藥物,替代抗生素是解決細菌耐藥性問題的一個方向。抗菌肽是具有抗菌作用的小分子多肽,相比于抗生素,不易產(chǎn)生耐藥性,可作為抗生素耐藥細菌治療的潛在藥物[2-3]。其中魚類鐵調(diào)素(Hepcidin)具有廣譜的抗菌活性,抗菌效果明顯,已成為當(dāng)前抗菌肽研究的熱點。筆者對魚類鐵調(diào)素的分子結(jié)構(gòu)、鐵調(diào)控作用、抗菌、抗病毒和抗腫瘤功能,以及其在原核、真核及植物表達系統(tǒng)中體外表達的研究進行了綜述,并對鐵調(diào)素在食品、醫(yī)藥及水產(chǎn)領(lǐng)域中的應(yīng)用現(xiàn)狀及前景進行了總結(jié)與展望,以期為魚類鐵調(diào)素抗菌機制及在漁業(yè)上的應(yīng)用提供參考和指導(dǎo)。

2002年,Shike等[4]第一次從雜交條紋鱸(Moronechrysops×M.saxatilis)鰓中分離出鐵調(diào)素,它與人類和其他物種的鐵調(diào)素序列同源,并研究發(fā)現(xiàn)細菌感染可誘導(dǎo)Hepcidin基因的表達。隨后,國內(nèi)外學(xué)者從團頭魴(Megalobramaamblycephala)[5]、尼羅羅非魚(Oreochromisniloticus)[6]、大彈涂魚(Boleophthalmuspectinirostris)[7]、斑馬魚(Daniorerio)[8]、舌齒鱸(Dicentrarchuslabrax)[9]、點帶石斑魚(Epinepheluscoioides)[10]、大菱鲆(Scophthalmusmaximus)[11]、卵形鯧鲹(Trachinotusovatus)[12]、大黃魚(Larimichthyscrocea)[13]和太平洋鱈(Gadusmacrocephalus)[14]等多種魚類中分離和鑒定了Hepcidin基因,并進行了分子結(jié)構(gòu)和功能的一系列研究。

1 魚類鐵調(diào)素的分子結(jié)構(gòu)

魚類鐵調(diào)素屬于肝臟表達抗菌肽LEAP家族,又稱LEAP-1。Shike等[8]研究了鐵調(diào)素在幾種不同物種中的序列和分子結(jié)構(gòu),發(fā)現(xiàn)鐵調(diào)素的基因組結(jié)構(gòu)在硬骨魚中高度保守,由2個內(nèi)含子和3個外顯子組成。外顯子編碼氨基酸序列分為3部分,包括信號肽、前體肽和成熟肽。第1個外顯子編碼信號肽和前體肽的一小部分,其他2個外顯子編碼剩余的前體肽和成熟肽。信號肽含有24個氨基酸,具有抗菌功能[15]。鐵調(diào)素前體肽含有典型的RX(K/R)R序列,用于招募前肽轉(zhuǎn)化酶形成由19～31個氨基酸組成的成熟肽,該成熟肽中第1個Cys殘基之前的N-末端6個殘基QSHLSL,對于鐵調(diào)節(jié)活性至關(guān)重要[16]。成熟肽含有較多的堿性氨基酸,使得鐵調(diào)素帶正電荷,屬于陽離子抗菌肽。從魚類到哺乳動物的鐵調(diào)素成熟肽序列進行比較分析,顯示成熟肽中8個半胱氨酸殘基具有高度保守性,這些半胱氨酸殘基通常形成4個分子內(nèi)二硫鍵,其中1個相鄰的二硫鍵橋形成發(fā)卡結(jié)構(gòu),有助于鐵調(diào)素折疊成親水和疏水側(cè)鏈,是鐵調(diào)素發(fā)揮抗菌活性的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)[17]。在Hepcidin基因的上游區(qū)域,普遍具有TATA框結(jié)構(gòu)及珠蛋白轉(zhuǎn)錄因子(GATA)、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子(STAT)、CCAAT增強子結(jié)合蛋白α(C/EBPα)、CCAAT增強子結(jié)合蛋白β(C/EBPβ)、激活蛋白(AP)、核因子激活的B細胞的κ-輕鏈增強(NF-κB)和肝細胞核因子4(HNF4)等轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合位點,說明鐵調(diào)素可能受這些轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)節(jié)表達[9]。

大多數(shù)魚類有2個或2個以上的同源Hepcidin基因,如斑馬魚、大菱鲆、黑點青鳉(Oryziasmelastigma)、點帶石斑魚、舌齒鱸和大彈涂魚等均有2個基因變體,在尼羅羅非魚中發(fā)現(xiàn)了3種類鐵調(diào)素的抗菌肽,在大黃魚基因組中發(fā)現(xiàn)了6種Hepcidin基因[6-11,13,18]。不同的基因亞型,在表達和功能上具有差異,如舌齒鱸1型Hepcidin基因主要發(fā)揮鐵調(diào)節(jié)的作用,2型Hepcidins基因參與宿主的抗菌防御[9]。大彈涂魚鐵調(diào)素-2與鐵調(diào)素-1相比具有更強的抗菌活性和更廣的抗菌譜[19]。大黃魚中6種鐵調(diào)素亞型,雖然具有相似的分子特征,但每個亞型均具有獨特的表達模式、轉(zhuǎn)錄調(diào)控和生物學(xué)功能[13]。

2 魚類鐵調(diào)素的表達調(diào)控

在病毒、細菌及其類似物刺激下,魚體Hepcidin基因表達可快速上調(diào),表明魚類鐵調(diào)素是一種急性期蛋白,參與類似于哺乳動物中的炎癥反應(yīng)[20-24]。魚類Hepcidin基因的表達受到許多刺激的單獨調(diào)節(jié),感染/炎癥、鐵水平、貧血和缺氧等刺激均能引起Hepcidin基因表達變化[9, 25]。不同刺激誘導(dǎo)魚類產(chǎn)生鐵調(diào)素的細胞通路不同,如在炎癥反應(yīng)中,Hepcidin基因的表達通常是通過酪氨酸激酶/信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子途徑介導(dǎo)的[26]。鐵可通過參與骨形態(tài)發(fā)生蛋白/果蠅MAD相關(guān)蛋白通路對Hepcidin基因的表達進行調(diào)控[27]。貧血和缺氧分別通過抑制C/EBPα和STAT3與Hepcidin基因啟動子結(jié)合,或抑制BMP/SMAD4依賴性信號傳導(dǎo),從而負調(diào)控Hepcidin基因的表達[28-29]。

環(huán)境污染物和高溫的刺激也能夠調(diào)節(jié)Hepcidin基因的表達。黑點青鳉在17α-乙炔基雌二醇(EE2)刺激后,17α-乙炔基雌二醇首先與雌激素受體α(ERα)結(jié)合,雌激素受體α識別并與Hepcidin基因啟動子區(qū)域上新發(fā)現(xiàn)的調(diào)控元件雌激素反應(yīng)元件結(jié)合,從而下調(diào)Hepcidin基因的表達[30]。大菱鲆皮膚中的Hepcidin基因表達水平較高,并且隨著溫度的升高而升高,在28 ℃時Hepcidin基因的表達量顯著增加[31]。

這些研究結(jié)果表明,魚類鐵調(diào)素對多種病原和環(huán)境脅迫都有響應(yīng),這些刺激通過不同的分子途徑來調(diào)節(jié)Hepcidin基因的表達,因此,鐵調(diào)素在魚類先天免疫反應(yīng)中起著關(guān)鍵作用。

3 魚類鐵調(diào)素的生物學(xué)功能

3.1 魚類鐵調(diào)素抗菌功能

魚類鐵調(diào)素是一種鐵穩(wěn)態(tài)的調(diào)節(jié)劑,可以通過細胞鐵轉(zhuǎn)運蛋白的內(nèi)化和降解,阻止肝細胞系中鐵釋放,并抑制細胞外細菌對鐵的攝取與利用,從而抑制細菌的生長和繁殖[32]。網(wǎng)箱養(yǎng)殖中,飼糧中添加不同劑量的草魚(Ctenopharyngoaonidellus)重組鐵調(diào)素,能夠控制體內(nèi)鐵的分布,從而防止細菌感染,具有保護作用[33]。

魚類鐵調(diào)素除了通過調(diào)節(jié)鐵代謝以抑制細菌生長外,還具有直接殺傷細菌的作用。在體外,魚類鐵調(diào)素能破壞病原菌的細胞膜結(jié)構(gòu),顯示其廣泛的殺菌活性[15,17,34]。鐵調(diào)素可通過非膜裂解機制進入到胞內(nèi)干擾細菌的正常代謝[35]。舌齒鱸鐵調(diào)素通過與某些細胞內(nèi)靶點結(jié)合或與細菌膜結(jié)合而對鰻鱺弧菌的復(fù)制產(chǎn)生影響[36]。魚類鐵調(diào)素還能通過其N-末端的Cu2+和Ni2+結(jié)合性(ATCUN)基序,以促進細菌DNA水解[37]。研究顯示,魚類鐵調(diào)素在體內(nèi)具有抗菌活性。體內(nèi)注射合成的大菱鲆鐵調(diào)素,可以大大降低受感染魚腎臟、脾臟和肝臟中的細菌數(shù)量[11]。

魚類鐵調(diào)素可以作為免疫調(diào)節(jié)劑,誘導(dǎo)細胞因子和趨化因子產(chǎn)生,從而調(diào)節(jié)和平衡病原引起的炎癥反應(yīng)。在創(chuàng)傷弧菌(Vibriovulnificus)感染斑馬魚后,轉(zhuǎn)入魚體的Hepcidin基因表達可誘導(dǎo)白介素10(IL-10)、白介素26(IL-26)、溶菌酶、Toll樣受體4(TLR-4)和髓樣分化因子88(Myd88)基因的表達,從而有效抑制細菌生長[38]。腹腔注射100 μg合成的中華烏塘鱧(Bostrychussinensis)鐵調(diào)素成熟肽,不僅可以提高中華烏塘鱧肝臟中免疫相關(guān)基因的表達,還能提高中華烏塘鱧感染副溶血性弧菌(V.parahaemolyticus)的存活率[39]。

以上研究表明,鐵調(diào)素功能主要有:(1)在免疫反應(yīng)期間通過調(diào)節(jié)鐵代謝,阻隔鐵對細菌的供應(yīng),以限制病原菌生長;(2)利用其抗菌活性將病原體直接殺死;(3)利用與宿主免疫系統(tǒng)相互作用來調(diào)節(jié)宿主免疫。這三者共同作用,最終限制感染性病原菌的增殖和傳播(圖1)。

3.2 魚類鐵調(diào)素在鐵代謝中的功能

魚類鐵調(diào)素在機體鐵穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)、感染后降低宿主血鐵含量、抵御入侵病原等方面發(fā)揮關(guān)鍵性作用。與哺乳動物類似,魚類鐵調(diào)素通過抑制膜鐵轉(zhuǎn)運蛋白1(FPN1)調(diào)節(jié)體內(nèi)鐵離子的動態(tài)平衡。在試驗性鐵超載情況下,斑馬魚肝臟中Hepcidin基因的表達顯著增加[40]。Hepcidin mRNA水平增高后,可以使血清鐵含量降低。大菱鲆肝臟中Hepcidin基因表達水平增加,可以降低FPN1基因的表達水平,表明鐵調(diào)素在鐵代謝中具有重要作用[41]。鱖(Sinipercachuatsi)注射硫酸亞鐵后,肝臟中Hepcidin基因的表達顯著增加,同時白介素1β(IL-1β)、白介素8(IL-8)、腫瘤壞死因子α(TNF-α)和Toll樣受體22(TLR22)基因的表達增加,FPN1基因表達減少,表明鐵調(diào)素除了參與鐵平衡的調(diào)節(jié),還在免疫系統(tǒng)中具有重要作用[42]。魚類鐵調(diào)素通過調(diào)節(jié)鐵代謝,導(dǎo)致鐵重新分布,降低血清鐵水平,增加肝胰腺中的鐵積累,并調(diào)節(jié)免疫基因的表達,從而保護魚體免受病原菌的感染[33]。

3.3 魚類鐵調(diào)素抗病毒功能

魚體感染傳染性脾腎壞死病毒、神經(jīng)壞死病毒和病毒性出血性敗血癥病毒后,宿主通過上調(diào)體內(nèi)Hepcidin基因的表達,以抑制病毒感染[42-44]。尼羅羅非魚鐵調(diào)素1-5對神經(jīng)壞死病毒和日本腦炎病毒具有抗病毒活性,還能夠提高感染傳染性胰腺壞死病毒的大鱗大馬哈魚(Oncorhynchustshawytscha)胚胎細胞的存活率[45-47]。魚類鐵調(diào)素對鱖魚彈狀病毒、大口黑鱸呼腸孤病毒和腫大細胞病毒也具有抗病毒活性[11,48]。鐵調(diào)素還可顯著抑制新加坡石斑魚虹彩病毒和白斑綜合征病毒的復(fù)制[10,13,18]。最近研究發(fā)現(xiàn),包括冠狀病毒在內(nèi)的病毒,需要含鐵酶參與才能完成其復(fù)制過程,通過操縱鐵調(diào)節(jié)的關(guān)鍵因子鐵調(diào)素,以限制鐵的利用,已成為治療病毒感染的一種輔助策略[49]。魚類鐵調(diào)素可作為病毒感染治療的一種新型藥物,這將拓展現(xiàn)有的抗病毒藥物。魚類鐵調(diào)素的抗病毒活性及其作用機制見表1。

表1 魚類鐵調(diào)素抗病毒活性及作用機制

3.4 魚類鐵調(diào)素抗腫瘤功能

魚類鐵調(diào)素的抗腫瘤活性已有較多報道。在軟瓊脂試驗中,尼羅羅非魚鐵調(diào)素有效抑制了人纖維肉瘤細胞、人宮頸癌細胞和人肝癌細胞的生長并減少了集落生成[50]。黑點青鳉鐵調(diào)素對培養(yǎng)的人肝癌細胞也同樣具有抗腫瘤活性,大約有40%的腫瘤細胞受到了明顯抑制[18]。這些研究表明,魚類鐵調(diào)素對人類腫瘤細胞表現(xiàn)出較好的抑制活性,這為開發(fā)新型抗癌抗腫瘤藥物指明了新途徑。

3.5 魚類鐵調(diào)素抗寄生蟲功能

卡氏錐蟲(Trypanosomacarassii)、卵圓鞭毛蟲(Amyloodiniumocellatum)、魚虱(Argulussiamensis)和刺激隱核蟲(Cryptocaryonirritans)通常黏附在魚體表面,引起持續(xù)的炎癥反應(yīng),誘導(dǎo)Hepcidin基因表達顯著上調(diào)[22,51-53]。研究發(fā)現(xiàn),重組大黃魚鐵調(diào)素可導(dǎo)致刺激隱核蟲膜破裂和內(nèi)容物泄漏[34]。以上研究表明,魚類鐵調(diào)素在抗寄生蟲感染時發(fā)揮了重要作用。

4 魚類Hepcidin基因的體外表達

4.1 原核表達系統(tǒng)

大腸桿菌(Escherichiacoli)原核表達系統(tǒng)可利用多種表達載體表達魚類Hepcidin基因,如利用pGEX-KG載體,在16 ℃下,用1 mmol/L IPTG誘導(dǎo),可表達黃顙魚(Pelteobagrusfulvidraco)Hepcidin基因,并通過谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶融合系統(tǒng)進行純化,可獲得較高純度的鐵調(diào)素,并證實鐵調(diào)素可以通過鐵調(diào)節(jié)有效地抵抗細菌感染[54]。利用pET系列載體,可原核表達黑點青鳉、南亞野鯪(Labeorohita)、泥鰍(Misgurnusanguillicaudatus)和大黃魚重組鐵調(diào)素,對主要魚類病原體均顯示有抗菌活性[18,22,34,55](表2)。

表2 魚類鐵調(diào)素的體外表達和抗菌譜

原核表達系統(tǒng)中,表達菌株為大腸桿菌,細菌中表達的蛋白不能進行轉(zhuǎn)錄和翻譯后的修飾,包括糖基化、磷酸化和形成二硫鍵,但這些修飾有利于蛋白質(zhì)的正確折疊和組裝[56]。原核表達系統(tǒng)表達的鐵調(diào)素由于不能夠正確折疊,從而會導(dǎo)致其失去直接殺菌活性。因此,采用真核表達系統(tǒng)表達Hepcidin基因,或合成鐵調(diào)素多肽,更易于研究鐵調(diào)素的生物學(xué)功能。

4.2 真核表達系統(tǒng)

真核表達系統(tǒng)中,最常用的表達菌株為畢赤酵母(Pichiapastoris),由于它自身集合了原核表達系統(tǒng)和真核表達系統(tǒng)的諸多優(yōu)點,成為當(dāng)前真核表達系統(tǒng)中最為理想的一種宿主菌。魚類鐵調(diào)素含有4對二硫鍵,由于特殊的結(jié)構(gòu),難以正確折疊其構(gòu)型。采用畢赤酵母真核表達系統(tǒng)更有利于二硫鍵橋的形成,更容易獲得大量具有活性的鐵調(diào)素[57]。畢赤酵母真核表達的松江鱸(Trachidermusfasciatus)鐵調(diào)素,具有模式識別功能和對多種細菌的凝集活性[58]。為進行尼羅羅非魚鐵調(diào)素的大規(guī)模生產(chǎn),將小體積重組畢赤酵母的過夜培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移到發(fā)酵罐,甲醇誘導(dǎo)發(fā)酵1 d,就能產(chǎn)生大量的鐵調(diào)素,這些蛋白可作為石斑魚養(yǎng)殖的膳食補充劑,通過飼料添加可提高石斑魚免疫力[59](表2)。

真核表達系統(tǒng)雖然解決了原核表達系統(tǒng)表達蛋白活性較低問題,但重組蛋白質(zhì)通常是高糖基化的,這會改變免疫原性表位,并且在此類系統(tǒng)中的高甘露糖基化會導(dǎo)致蛋白質(zhì)在體內(nèi)的半衰期較低,這兩個因素都會影響產(chǎn)品的治療活性[60]。

4.3 植物表達系統(tǒng)

植物表達系統(tǒng)具有許多優(yōu)勢,主要優(yōu)勢為:低生產(chǎn)成本、低運輸成本(無需冷藏運輸)、快速擴大規(guī)模、簡單的種子分發(fā)、易于基因操作、口服遞送以及低健康風(fēng)險等[61]。He等[62]將大黃魚Hepcidin基因與擬穴青蟹(Scyllaparamamosain)性腺素(Scy)基因進行融合表達,獲得能穩(wěn)定高效表達Scy-hepcidin融合基因的小球藻(Chlorella),其產(chǎn)生的重組性腺素-鐵調(diào)素融合蛋白在體外具有較強的殺菌活性。喂食轉(zhuǎn)基因的小球藻后,可以有效保護魚類免受嗜水氣單胞菌的感染(表2)。魚類和對蝦的幼體階段,其主要以微藻(如小球藻)等為開口飼料,所以,在養(yǎng)殖中可根據(jù)養(yǎng)殖品種或生長階段的不同,采取不同的飼料制備技術(shù)來取得更經(jīng)濟、更高效的健康養(yǎng)殖模式。

5 魚類鐵調(diào)素在食品、醫(yī)藥及水產(chǎn)領(lǐng)域中的應(yīng)用

魚類鐵調(diào)素在食品、醫(yī)藥及水產(chǎn)領(lǐng)域中都有較大的實際應(yīng)用價值。外源重組表達的大黃魚鐵調(diào)素,可用于食品添加劑,這種添加劑能夠影響腸道微生物群落而不引起炎癥[68]。尼羅羅非魚鐵調(diào)素對人纖維肉瘤細胞有較好的殺傷力,并且可特異性抑制人纖維肉瘤細胞的增殖和遷移,這表明鐵調(diào)素是一種應(yīng)用前景較好的抗人纖維肉瘤細胞的化療藥物[50,69]。魚類鐵調(diào)素還可作為口腔癌治療的輔助或主要化療藥物,將尼羅羅非魚鐵調(diào)素納入脂質(zhì)體制劑中,并增強了“表阿霉素”對人類舌鱗狀細胞癌、人類胚胎癌細胞和人宮頸癌細胞的治療效果[70,71]。水產(chǎn)養(yǎng)殖中,鐵調(diào)素可作為一種潛在的免疫調(diào)節(jié)劑和抗菌治療劑。星斑川鰈(Platichthysstellatus)鐵調(diào)素,無論是單獨使用還是與常規(guī)抗生素聯(lián)合應(yīng)用,對大部分菌株均有協(xié)同作用[72]。表達鐵調(diào)素的魚卵可作為一種新型飼料補充劑,能夠提高斑馬魚對病原感染的免疫力[73]。Ting等[59]研究了尼羅羅非魚鐵調(diào)素在石斑魚養(yǎng)殖中的應(yīng)用效果,結(jié)果發(fā)現(xiàn),在飼料中添加1%的鐵調(diào)素,可提高石斑魚的免疫力,從而保護石斑魚免受細菌感染。盡管鐵調(diào)素具有替代抗生素的潛力,但在實際應(yīng)用中仍面臨較多挑戰(zhàn),如溶血和蛋白水解的不穩(wěn)定性[74]。今后,還需要不斷深入研究鐵調(diào)素功能,并不斷優(yōu)化其表達體系,以獲得更易于應(yīng)用的抗菌肽。

6 總結(jié)與展望

魚類鐵調(diào)素是一個富含半胱氨酸的小分子抗菌肽,也是鐵代謝的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子,具有抗細菌、抗病毒、抗腫瘤、抗寄生蟲等多種功能。魚類鐵調(diào)素不僅可作為飼料添加劑應(yīng)用于水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè),而且也可作為抗生素的替代藥物,以用于疾病防控。多種魚類中存在鐵調(diào)素,但魚體內(nèi)含量較少。由于化學(xué)合成鐵調(diào)素價格高昂,因此,采用基因工程技術(shù),選擇適宜的表達體系,高效表達Hepcidin基因,通過優(yōu)化發(fā)酵工藝,以進行工業(yè)化生產(chǎn),從而獲得大量具有生物活性的鐵調(diào)素。目前魚類鐵調(diào)素的基礎(chǔ)研究還有待深入,關(guān)于魚類Hepcidin基因表達的信號調(diào)控、鐵代謝調(diào)節(jié)和殺菌機理的研究還需開展更多試驗,以弄清相關(guān)機制。魚類鐵調(diào)素在臨床應(yīng)用方面還不夠成熟和完善,其在體內(nèi)的穩(wěn)定性、毒性等方面研究還不全面,有效性及安全性的研究需要進一步加強。水產(chǎn)養(yǎng)殖上鐵調(diào)素的應(yīng)用還需不斷優(yōu)化,以系統(tǒng)評價其免疫防控效果,從而使鐵調(diào)素作為抗生素替代藥物或免疫增強劑在漁業(yè)生產(chǎn)上更好地應(yīng)用,以確保生態(tài)養(yǎng)殖和漁業(yè)可持續(xù)發(fā)展。