李石磊,楊慧花,張 乾,王旭達(dá),董 穎,葉 博,趙振軍,王笑月,劉丹妮,曹 琛,周遵春

( 遼寧省海洋水產(chǎn)科學(xué)研究院,遼寧 大連 116023 )

仿刺參(Apostichopusjaponicus)養(yǎng)殖是我國(guó)海水養(yǎng)殖的特色支柱產(chǎn)業(yè)。20世紀(jì)80年代中期突破苗種規(guī)?；庇夹g(shù),90年代初池塘養(yǎng)殖和海區(qū)增殖開(kāi)始,目前仿刺參養(yǎng)殖區(qū)域遍布遼寧、山東、河北、福建等地沿海。仿刺參營(yíng)底棲生活并以沉積物為食,腸道內(nèi)的大量微生物發(fā)揮重要作用,腸道菌群與宿主仿刺參之間存在著相互影響、相輔相成的關(guān)系,腸道微生物在宿主提供的環(huán)境內(nèi)存活生長(zhǎng),同時(shí)腸道微生物對(duì)仿刺參起到輔助消化、營(yíng)養(yǎng)吸收、免疫刺激、致病拮抗等作用,因此對(duì)仿刺參腸道菌群多樣性的研究十分重要[1-3]。目前對(duì)仿刺參腸道菌群的研究較多,包括仿刺參腸道菌群與養(yǎng)殖環(huán)境關(guān)系[4-5]、不同季節(jié)不同溫度下仿刺參腸道菌群結(jié)構(gòu)與功能特點(diǎn)[6-7]、不同地域仿刺參腸道菌群結(jié)構(gòu)差異[8-10]、不同養(yǎng)殖時(shí)期不同個(gè)體規(guī)格的仿刺參腸道菌群分析[11-12]、外源物投入對(duì)仿刺參腸道菌群結(jié)構(gòu)的影響[13-15]等研究。

浸泡(藥浴)法是一種常見(jiàn)的水產(chǎn)動(dòng)物疾病治療方法。在魚(yú)病防治中,針對(duì)寄生蟲(chóng)引起的各種疾病,采用藥液浸泡法能獲得良好的效果。由于仿刺參體表缺少堅(jiān)硬外殼保護(hù),在仿刺參保苗過(guò)程中的倒池操作容易造成仿刺參苗種體表機(jī)械損傷,為防止傷口出現(xiàn)細(xì)菌繼發(fā)性感染,部分養(yǎng)殖從業(yè)人員通常會(huì)采用抗生素對(duì)仿刺參苗種進(jìn)行藥浴。為確定抗生素藥浴對(duì)仿刺參苗種腸道菌群結(jié)構(gòu)的影響,筆者對(duì)倒池時(shí)未藥浴和經(jīng)氟苯尼考藥浴的仿刺參幼參腸道菌群結(jié)構(gòu)進(jìn)行比較分析,旨在為仿刺參保苗提供數(shù)據(jù)參考和技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)用仿刺參幼參為當(dāng)年5月中旬產(chǎn)卵繁育,培育地點(diǎn)在遼寧省海水養(yǎng)殖引育種中心。幼參投喂的餌料為40%馬尾藻(Scagassumsp.)和60%海泥,隔天潑灑地衣芽孢桿菌(Bacilluslicheniformis)和嗜酸乳桿菌(Lactobacillusacidophilus)各3～5 mL/m3,根據(jù)幼參狀態(tài)和池底情況每15～20 d倒池1次,試驗(yàn)選用仿刺參幼參單體質(zhì)量為(5.21±0.42) g。

1.2 藥浴方法

倒池時(shí)將幼參收至塑料盆中,平均分為2組,設(shè)置普通組和藥浴組。普通組直接將幼參潑灑至1#池,藥浴組采用水產(chǎn)用氟苯尼考對(duì)幼參進(jìn)行藥浴,藥浴質(zhì)量濃度0.1 g/L,藥浴15 min,藥浴后將幼參潑灑至2#池。倒池后當(dāng)日開(kāi)始投喂飼料和益生菌,試驗(yàn)期間水溫14～15 ℃,pH 8.0～8.2,鹽度32。

1.3 樣品采集

倒池前取幼參腸道樣品標(biāo)記為A,在倒池后24、48、72 h取普通組幼參樣品標(biāo)記為A1、A2、A3,取藥浴組幼參樣品標(biāo)記為B1、B2、B3。每次2組各隨機(jī)取10只幼參置于過(guò)濾海水中24 h,保證其腸道內(nèi)含物排空,然后在無(wú)菌環(huán)境下用滅菌剪刀剪開(kāi)幼參體腔,用0.9%的無(wú)菌生理鹽水沖洗腸道外壁,將采集的幼參腸道混合置于無(wú)菌的研缽內(nèi)研磨得到勻漿,用細(xì)菌DNA提取試劑盒完成基因組DNA抽提,利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)基因組DNA。

1.4 細(xì)菌16S rDNA擴(kuò)增和測(cè)序

Illumina PE250文庫(kù)制備和高通量測(cè)序工作由上海凌恩生物科技有限公司完成。細(xì)菌16S rDNA 基因V4～V5區(qū)擴(kuò)增引物為515F(5′-GTGCCAGCMGCCGCGG-3′)和907R(5′-CCGTCAATTCMTTTRAGTTT-3′)。

1.5 數(shù)據(jù)分析

利用Usearch(vsesion 10 http://drive5.com/uparse/)軟件以97%相似性對(duì)非重復(fù)序列(不含單序列)進(jìn)行運(yùn)算分類(lèi)單元聚類(lèi),在聚類(lèi)過(guò)程中去除嵌合體,得到運(yùn)算分類(lèi)單元的代表序列。將所有優(yōu)化序列比對(duì)至運(yùn)算分類(lèi)單元代表序列,選出與運(yùn)算分類(lèi)單元代表序列相似性在97%以上的序列,生成運(yùn)算分類(lèi)單元表格。采用RDP數(shù)據(jù)庫(kù)貝葉斯分類(lèi)法對(duì)運(yùn)算分類(lèi)單元代表序列進(jìn)行分類(lèi)學(xué)分析,并分別在各分類(lèi)水平統(tǒng)計(jì)各樣本的群落組成。利用MOTHUR軟件做稀釋性曲線分析,計(jì)算菌群豐富度(Chao指數(shù))、香農(nóng)指數(shù)、辛普森指數(shù)、測(cè)序深度指數(shù)。利用OriginPro 9.0軟件制作多樣本柱形圖。

2 結(jié) 果

2.1 稀釋性曲線

以97%相似性水平標(biāo)準(zhǔn)劃分運(yùn)算分類(lèi)單元,基于隨機(jī)選取一定數(shù)量的測(cè)序序列及其對(duì)應(yīng)的運(yùn)算分類(lèi)單元種類(lèi)得到的稀釋性曲線,當(dāng)曲線趨向平坦時(shí),說(shuō)明測(cè)序數(shù)據(jù)量合理,測(cè)序結(jié)果能夠真實(shí)地反映樣品中優(yōu)勢(shì)細(xì)菌的數(shù)量關(guān)系(圖1)。

圖1 稀釋性曲線Fig.1 The dilution curve

2.2 菌群多樣性分析

通過(guò)樣品測(cè)序序列計(jì)算各樣品中細(xì)菌多樣性指數(shù)(表1)。各組樣品數(shù)據(jù)有效序列數(shù)為29 767～40 038,文庫(kù)覆蓋率均逾99.8%,可分別劃分為159、165、160、162、349、189、160個(gè)運(yùn)算分類(lèi)單元。倒池藥浴后24 h幼參腸道樣品組菌群豐富值最高,倒池藥浴后48 h幼參腸道樣品組其次,其余樣品菌群豐富值比較接近。倒池藥浴后24 h幼參腸道樣品組香農(nóng)指數(shù)最大,為3.3,辛普森指數(shù)最小,為0.1258。倒池藥浴后48 h幼參腸道樣品組和倒池藥浴后72 h幼參腸道樣品組香農(nóng)指數(shù)分別為2.12和0.69,高于倒池前幼參腸道樣品組和倒池未藥浴的各幼參腸道樣品組;辛普森指數(shù)分別為0.3817和0.7351,低于倒池前幼參腸道樣品組和倒池未藥浴的各幼參腸道樣品組。倒池后24 h幼參腸道樣品組細(xì)菌多樣性最高,倒池藥浴后48 h幼參腸道樣品組和倒池藥浴后72 h幼參腸道樣品組次之,倒池前幼參腸道樣品組和倒池未藥浴的各幼參腸道樣品組細(xì)菌多樣性較低。

表1 細(xì)菌多樣性指數(shù)

2.3 運(yùn)算分類(lèi)單元相似性分析

基于樣品運(yùn)算分類(lèi)單元數(shù)制作韋恩圖并進(jìn)行相似性分析(圖2)。倒池前幼參腸道樣品組和倒池未藥浴的各組幼參腸道樣品的運(yùn)算分類(lèi)單元相似性高達(dá)99%,未列入圖2中。倒池前幼參腸道樣品組與倒池藥浴后24 h幼參腸道樣品組共有運(yùn)算分類(lèi)單元數(shù)91個(gè),占二者總數(shù)的23.8%;倒池前幼參腸道樣品組與倒池藥浴后48 h幼參腸道樣品組共有運(yùn)算分類(lèi)單元數(shù)71個(gè),占二者總數(shù)的25.6%;倒池前幼參腸道樣品組與倒池藥浴后72 h幼參腸道樣品組共有運(yùn)算分類(lèi)單元數(shù)98個(gè),占二者總數(shù)的44.3%。隨時(shí)間推移,倒池藥浴后各幼參腸道樣品組與倒池前幼參腸道樣品組的相似性逐漸升高。

圖2 樣品運(yùn)算分類(lèi)單元的韋恩圖Fig.2 The Venn diagram of operational taxonomic unit

2.4 基于門(mén)水平上的菌群結(jié)構(gòu)分析

對(duì)全部樣品的有效序列進(jìn)行基于門(mén)水平上的菌群結(jié)構(gòu)分析,得到各組樣品的細(xì)菌門(mén)類(lèi)及相對(duì)豐度(表2)。各組樣品的優(yōu)勢(shì)菌均以變形菌門(mén)為主,相對(duì)豐度超過(guò)90%。倒池前幼參腸道樣品組和各倒池未藥浴幼參腸道樣品組的變形菌門(mén)相對(duì)豐度超過(guò)98%,倒池藥浴后24 h幼參腸道樣品組的變形菌門(mén)相對(duì)豐度為90.51%、放線菌門(mén)為3.08%、浮霉菌門(mén)為2.12%、擬桿菌門(mén)為1.35%,倒池藥浴后48 h幼參腸道樣品組的變形菌門(mén)為92.99%、放線菌門(mén)為2.62%、擬桿菌門(mén)為1.75%,倒池藥浴后72 h幼參腸道樣品組的變形菌門(mén)為96.63%、放線菌門(mén)為1.14%、擬桿菌門(mén)為1%。相比于未藥浴組,酸桿菌門(mén)、綠彎菌門(mén)、疣微菌門(mén)、厚壁菌門(mén)和藍(lán)細(xì)菌相對(duì)豐度在藥浴組均有所提高,但均不超1%。達(dá)達(dá)菌門(mén)、德潘菌門(mén)和芽單胞菌門(mén)均未在普通組樣品檢測(cè)到,為藥浴組樣品獨(dú)有。

2.5 基于屬水平上的菌群結(jié)構(gòu)分析

基于屬水平上的菌群結(jié)構(gòu)分析結(jié)果顯示,藥浴組與普通組幼參的腸道菌群結(jié)構(gòu)存在較大的差異(圖3)。無(wú)論是倒池前還是倒池后,未藥浴幼參腸道中新草螺菌屬(Noviherbaspirillum)均占主要優(yōu)勢(shì),相對(duì)豐度達(dá)95%。倒池藥浴后24 h幼參腸道樣品中新草螺菌屬相對(duì)豐度降至2.46%,新的優(yōu)勢(shì)菌屬葉桿菌屬(Phyllobacterium)和CandidatusCompetibacter相對(duì)豐度分別為43.4%和16.9%,相對(duì)豐度1%以上的菌屬包括:鞘氨醇單胞菌屬(Sphingomonas)(5.9%)、叢毛單胞菌屬(Curvi-bacter)(3.6%)、Pelagibacterium(2.3%)、Rudaea(2.0%)、慢生根瘤菌屬(Bradyrhizobium)(1.8%)、不動(dòng)桿菌屬(Acinetobacter)(1.4%)、Lutibacter(1.3%)、Defluviicoccus(1.2%);倒池藥浴后48 h幼參腸道樣品組中新草螺菌屬相對(duì)豐度恢復(fù)至36.7%,葉桿菌屬和CandidatusCompetibacter相對(duì)豐度分別為26.6%和11.8%,相對(duì)豐度1%以上的菌屬包括:鞘氨醇單胞菌屬(4.6%)、叢毛單胞菌屬(1.65%)、Pelagibacterium(1.6%)、慢生根瘤菌屬(1.17%)、Lutibacter(1.1%);倒池藥浴后72 h幼參腸道樣品組中新草螺菌屬相對(duì)豐度恢復(fù)至69.9%,葉桿菌屬和CandidatusCompetibacter相對(duì)豐度分別為10.5%和8.5%,相對(duì)豐度1%以上的菌屬僅有鞘氨醇單胞菌屬(3.7%)。

圖3 屬水平上幼參腸道菌群組成Fig.3 The intestinal microbiota composition of the juvenile sea cucumber A. japonicus at genus level

3 討 論

3.1 工廠化培育幼參腸道優(yōu)勢(shì)菌門(mén)特征

仿刺參腸道菌群結(jié)構(gòu)受到環(huán)境中微生物、溫度、餌料、發(fā)育階段、生理狀況等條件的影響[16]。有研究表明,黃、渤海仿刺參腸道、養(yǎng)殖池塘海水和底泥樣品中優(yōu)勢(shì)菌門(mén)均為變形菌門(mén)[4,17-18],這與本試驗(yàn)中幼參腸道菌群優(yōu)勢(shì)菌門(mén)結(jié)果一致,但本試驗(yàn)中幼參腸道變形菌門(mén)相對(duì)豐度較高,藥浴前在98%以上,藥浴后也在90%以上,遠(yuǎn)高于之前研究報(bào)道的60%～87%,僅與秋季河北省樂(lè)亭縣仿刺參腸道變形菌門(mén)相對(duì)豐度[19]相似。在以往的研究中,仿刺參樣品規(guī)格較大,且均取自野外池塘或淺海水域,而本試驗(yàn)所用仿刺參樣品為室內(nèi)培育的幼參,培養(yǎng)環(huán)境相對(duì)穩(wěn)定單一,諸多因素均可能導(dǎo)致本試驗(yàn)仿刺參腸道變形菌門(mén)豐度與以往結(jié)果相比偏高。腸道細(xì)菌能夠合成分泌出一些宿主生長(zhǎng)發(fā)育所必需的維生素、酶、調(diào)節(jié)因子等,它們將一些不易被宿主吸收的物質(zhì)分解成易吸收的小分子物質(zhì),促進(jìn)宿主對(duì)某些營(yíng)養(yǎng)成分的吸收,提高宿主消化酶的活性,對(duì)促進(jìn)宿主的新陳代謝有著重要的作用[20]。相比室外散養(yǎng)的仿刺參,工廠化培育的仿刺參苗種具有較快的生長(zhǎng)速度,在人工投喂餌料及水質(zhì)環(huán)境等較好的條件下,仿刺參幼參腸道菌群可能會(huì)形成其特有的高效促消化結(jié)構(gòu)模式。工廠化培育的仿刺參苗種是否普遍具有腸道變形菌門(mén)相對(duì)豐度較高的特點(diǎn),該特點(diǎn)是否與仿刺參的生長(zhǎng)速度有所關(guān)聯(lián),還需要進(jìn)一步驗(yàn)證。

3.2 藥浴后幼參腸道菌群結(jié)構(gòu)變化

藥浴后仿刺參腸道細(xì)菌多樣性先升后降,結(jié)合運(yùn)算分類(lèi)單元相似性分析和門(mén)屬水平結(jié)構(gòu)分析,氟苯尼考藥浴將幼參腸道菌群結(jié)構(gòu)原有平衡打破,部分原有細(xì)菌被抗生素消滅,多種新細(xì)菌出現(xiàn)。在藥浴后72 h時(shí)間段,仿刺參腸道菌群結(jié)構(gòu)變化較大,屬水平分析顯示,原優(yōu)勢(shì)菌屬新草螺菌屬在藥浴后相對(duì)豐度24 h降為2%,48 h后恢復(fù)至36.7%,72 h恢復(fù)至69.9%,總體來(lái)說(shuō),藥浴后幼參腸道菌群結(jié)構(gòu)逐漸趨向藥浴前的幼參腸道結(jié)構(gòu)恢復(fù)變化。門(mén)水平分析顯示,幼參腸道優(yōu)勢(shì)菌變形菌門(mén)相對(duì)豐度由98%降至90%,72 h后恢復(fù)到96%,酸桿菌門(mén)、綠彎菌門(mén)、疣微菌門(mén)、厚壁菌門(mén)均有所提高,新出現(xiàn)的達(dá)達(dá)菌門(mén)、德潘菌門(mén)、芽單胞菌門(mén)均為土壤和海水中的常見(jiàn)細(xì)菌[21-22]。根據(jù)細(xì)菌在腸道上的定殖力和停留時(shí)間,腸道菌群可分為固定菌群或過(guò)路菌群,前者是指在腸道中占有特定區(qū)域的微生物,后者是指那些不能在健康動(dòng)物消化道內(nèi)長(zhǎng)期滋生的微生物,除非占據(jù)固定菌群讓出的特定區(qū)域[23]。腸道細(xì)菌與外界環(huán)境、動(dòng)物和腸道細(xì)菌之間,處在一個(gè)相對(duì)的動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài),這種狀態(tài)對(duì)寄主的正常生理功能的維持有著重大意義[24]。藥浴后的幼參腸道菌群平衡被打破,固定菌群發(fā)生紊亂,環(huán)境中的過(guò)路菌群趁虛而入,在仿刺參腸道內(nèi)定殖。過(guò)路菌群由一些潛在致病性或非致病性細(xì)菌組成,在仿刺參腸道存留數(shù)小時(shí)、數(shù)天或數(shù)周,如環(huán)境中的過(guò)路菌群多為潛在致病性細(xì)菌且在短時(shí)間內(nèi)大量繁殖,便可能會(huì)引發(fā)疾病。

3.3 仿刺參保苗期抗生素的科學(xué)使用

通過(guò)比較氟苯尼考藥浴幼參的腸道菌群結(jié)構(gòu)變化,筆者發(fā)現(xiàn):藥浴會(huì)打破幼參腸道原有平衡,進(jìn)而可能會(huì)影響到幼參的消化吸收,并增加致病風(fēng)險(xiǎn)。保苗期即仿刺參苗種培育期,倒池屬于該時(shí)期常規(guī)操作。倒池操作過(guò)程中難免會(huì)造成仿刺參苗種表皮的機(jī)械損傷,為防止傷口繼發(fā)性感染采用抗生素藥浴,這也是一些技術(shù)人員使用抗生素藥浴的出發(fā)點(diǎn),但這種認(rèn)識(shí)顯然是存在偏差的,倒池時(shí)對(duì)健康苗種進(jìn)行藥浴是弊大于利的,實(shí)際生產(chǎn)中應(yīng)摒棄藥浴的做法而注重倒池操作的細(xì)節(jié),比如調(diào)節(jié)沖苗水流強(qiáng)度、選用適宜網(wǎng)目的收苗網(wǎng)袋、勤搖動(dòng)或更換網(wǎng)袋防止網(wǎng)眼堵塞、減少幼參在盆中滯留時(shí)間等,可以有效減少表皮受損的參苗數(shù)量。

近年來(lái),由于養(yǎng)殖環(huán)境污染加重、養(yǎng)殖生產(chǎn)操作不規(guī)范等因素,仿刺參養(yǎng)殖病害頻發(fā),出現(xiàn)“腐皮綜合征”、“腸炎病”等疾病和“一倒沒(méi)”、“放不住”等現(xiàn)象,一些從業(yè)者會(huì)使用抗生素進(jìn)行病害防控,如缺少科學(xué)使用的指導(dǎo),抗生素的濫用會(huì)影響?zhàn)B殖動(dòng)物的質(zhì)量和安全,導(dǎo)致水環(huán)境惡化、藥物殘留、細(xì)菌耐藥以及微生態(tài)結(jié)構(gòu)失衡[25-26]。筆者認(rèn)為,在仿刺參保苗期間,除非出現(xiàn)“腐皮綜合征”、“腸炎癥”等疾病時(shí)[27],需要采用農(nóng)業(yè)農(nóng)村部允許使用的藥物進(jìn)行治療,其他情況下均無(wú)需使用抗生素。保苗期間通過(guò)潑灑、拌飼、藥浴等方式利用抗生素進(jìn)行病害防控可能會(huì)起到適得其反的效果。近幾年的生產(chǎn)實(shí)踐證明,做好水質(zhì)調(diào)控、飼料檢測(cè)以及管理操作標(biāo)準(zhǔn)化,保苗期間不使用任何抗生素藥物,通過(guò)科學(xué)合理應(yīng)用微生態(tài)制劑便可達(dá)到防控細(xì)菌性疾病的目的。

4 結(jié) 論

綜上所述,抗生素藥浴會(huì)打破正常生長(zhǎng)狀態(tài)下幼參的腸道菌群平衡,進(jìn)而可能會(huì)影響到幼參的消化吸收,并增加致病風(fēng)險(xiǎn),因此倒池時(shí)不建議采用抗生素藥浴。本試驗(yàn)結(jié)果可為仿刺參健康養(yǎng)殖提供理論依據(jù)和技術(shù)支持。