鄒 利,王金龍,2,李傳武,王冬武,曾春芳,劉明求,劉 麗,謝 敏,曾 鳴

( 1.湖南省水產(chǎn)科學(xué)研究所,湖南 長沙,410153; 2.湖南文理學(xué)院,環(huán)洞庭湖水產(chǎn)健康養(yǎng)殖及加工湖南省重點實驗室,動物學(xué)湖南省高校重點實驗室,常德市農(nóng)業(yè)生物大分子研究中心,湖南 常德 415000 )

由于地理環(huán)境的差異和人工選育的方向不同,各地鯉(Cyprinuscarpio)在遺傳和形態(tài)上皆發(fā)生了分化,形成了地方特有鯉品系如黑龍江鯉(C.carpiohaermatopterus)、黃河鯉(C.carpiohaermatopterus)、湘江野鯉(C.carpio)、荷包紅鯉(C.carpiovar.wuyuanensis)、興國紅鯉(C.carpiovar.singguoensis)等,人工選育品種如豐鯉(C.carpiovar.singguoensis♀×C.carpiovar.mirrorsplittered♂)、建鯉(C.carpiovar.jian)、福瑞鯉(FFRCC.carpio)、芙蓉鯉(C.carpiovar.furong)等。我國傳統(tǒng)的稻田養(yǎng)魚,主要是將鯉放養(yǎng)于稻田環(huán)境之中,具有悠久的歷史文化傳承[1-2]。據(jù)《湘西土家族苗族自治州志》記載,湘西土家族苗族自治州自唐代就開始摸索在稻田中放魚的生產(chǎn)方式,稻田養(yǎng)魚已有1200多年的歷史[3]。在湖南湘西,稻田養(yǎng)殖的鯉被稱為呆鯉或埋頭鯉,其遇汛期水漲,頭埋泥中,故而得名。呆鯉肉味鮮美,是加工酸菜魚的首選魚料;其性情溫順,喜逆水上游,即使是放干稻田里的水也不輕易隨水逃跑,是開展稻田綜合種養(yǎng)的適養(yǎng)品種。呆鯉稻田養(yǎng)殖群體的形成,可能與上千年的稻田養(yǎng)殖環(huán)境有關(guān),也可能是因為湘西山區(qū)與外界環(huán)境交流較少,相對隔離的環(huán)境使得呆鯉與其他水域和品種的鯉基因交流甚少,久而久之,便形成了這一獨特的稻田養(yǎng)殖群體。

養(yǎng)殖場在未對親魚遺傳背景進(jìn)行了解的情況下,盲目地擴(kuò)大繁殖,將導(dǎo)致群體遺傳多樣性下降、近交系數(shù)高、經(jīng)濟(jì)性狀丟失、種質(zhì)退化等問題[4-6]。近年來,湖南稻田綜合種養(yǎng)發(fā)展迅速,呆鯉苗種需求量大,對呆鯉的遺傳背景進(jìn)行研究,對其苗種生產(chǎn)具有指導(dǎo)意義。微衛(wèi)星作為一種發(fā)展迅速的分子標(biāo)記,目前已廣泛應(yīng)用于鯉群體遺傳多樣性和遺傳結(jié)構(gòu)分析[7]、種質(zhì)資源鑒定[8-9]、遺傳連鎖圖和數(shù)量性狀位點定位[10-11]等研究。

筆者以湘江野鯉野生群體和興國紅鯉池塘養(yǎng)殖群體作為對照,采用14個微衛(wèi)星標(biāo)記對3個湘黔山區(qū)的稻田養(yǎng)殖呆鯉群體的遺傳特征與遺傳結(jié)構(gòu)進(jìn)行研究,旨在對呆鯉的遺傳信息背景進(jìn)行初步探索,為呆鯉優(yōu)質(zhì)遺傳資源的充分發(fā)掘與保護(hù)提供參考信息。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗用永順呆鯉群體采自湘西土家族苗族自治州永順縣,藕團(tuán)呆鯉群體采自懷化市靖州自治縣藕團(tuán)鄉(xiāng),錦屏呆鯉群體采自黔東南苗族侗族自治州錦屏縣,湘江野鯉群體采自岳陽市湘江江段,興國紅鯉群體為湖南省水產(chǎn)科學(xué)研究所院養(yǎng)殖群體(表1)。剪取試驗魚的尾鰭,置于95%乙醇中,保存于4 ℃冰箱備用。

表1 5個鯉群體樣本采集信息

1.2 方法

1.2.1 DNA提取

參照《分子克隆實驗指南》[12],應(yīng)用常規(guī)的酚-氯仿法自鰭條中提取基因組DNA。用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測樣本DNA質(zhì)量,各組質(zhì)量良好,可以進(jìn)行后續(xù)的試驗。

1.2.2 引物定制

試驗采用14對在以往研究中擴(kuò)增性較好的多態(tài)性微衛(wèi)星引物,其中有8對引物由Crooijmans等[13]設(shè)計,另外6對引物參考文獻(xiàn)[14-15],引物序列見表2。試驗用特異性熒光引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。微衛(wèi)星標(biāo)記的正向引物5′端用fam、hex、tamrad、rox 4種熒光標(biāo)記中的1種進(jìn)行標(biāo)記。

表2 14對鯉微衛(wèi)星引物特征

1.2.3 PCR擴(kuò)增

PCR反應(yīng)總體系20 μL:10×PCR Buffer 2 μL,dNTP (2.5 mmol/L)1.6 μL,MgCl2(2.5 mmol/L)1.6 μL,上、下游引物(10 mmol/L)各0.6 μL,TaqDNA聚合酶0.5 μL,DNA模板(100 ng/μL)0.5 μL,雙蒸水12.6 μL。PCR擴(kuò)增程序:94 ℃預(yù)變性5 min;94 ℃變性30 s,50～60 ℃退火45 s,72 ℃延伸60 s,30個循環(huán);72 ℃延伸10 min。取 3 μL PCR擴(kuò)增產(chǎn)物,用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測是否為有效擴(kuò)增。

1.2.4 毛細(xì)管電泳樣本制備和檢測

熒光PCR產(chǎn)物送往生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行毛細(xì)管電泳,利用GeneScan和GeneMapper 4.0等軟件進(jìn)行圖像收集和數(shù)據(jù)分析,統(tǒng)計片段堿基數(shù)。

1.2.5 數(shù)據(jù)分析

將每個基因座的不同堿基數(shù)的DNA片段作為該座位的等位基因來處理,每個座位擴(kuò)增的等位基因按其堿基數(shù),從大到小依次定義為:1、2、3、…k,統(tǒng)計各群體樣本基因型。多態(tài)信息含量(PIC)根據(jù)Botstein等[16]的公式計算:

式中,Pi、Pj分別為第i和第j個(j=i+1)等位基因在群體中的頻率,n為某一基因座位上的等位基因數(shù)。

用GenAlEx軟件計算各微衛(wèi)星位點在5個鯉群體中的等位基因數(shù)、有效等位基因數(shù)、雜合度、遺傳分化系數(shù)和基因流等指標(biāo),并進(jìn)行各群體間的分子方差分析。

用Structure軟件分析群體遺傳結(jié)構(gòu)特征,設(shè)定群體數(shù)K的估算數(shù)值為2～5,根據(jù)群體的區(qū)分程度確定最優(yōu)群體數(shù)K的值。用MEGA 4.0軟件構(gòu)建各群體之間的系統(tǒng)樹。

2 結(jié) 果

2.1 微衛(wèi)星位點的電泳檢測結(jié)果

本試驗采用的14對微衛(wèi)星引物在5個鯉群體中均能穩(wěn)定擴(kuò)增出PCR產(chǎn)物,產(chǎn)物片段長度結(jié)果見表2。

2.2 群體遺傳多樣性分析

14對微衛(wèi)星引物在5個鯉群體中的擴(kuò)增結(jié)果見表3。平均等位基因數(shù)為16.571～19.214,平均有效等位基因數(shù)為9.420～11.143,平均觀測雜合度為0.705～0.778,平均期望雜合度為0.884～0.893,平均多態(tài)信息含量為0.883～0.891。

表3 14對微衛(wèi)星標(biāo)記在5個鯉群體的遺傳多樣性參數(shù)

5個鯉群體的遺傳多樣性見表3。湘江野鯉平均等位基因數(shù)最多(19.214),錦屏呆鯉最少(16.571);藕團(tuán)呆鯉的平均有效等位基因數(shù)最多(11.143),錦屏呆鯉最少(9.420);藕團(tuán)呆鯉的香農(nóng)-維納多樣性指數(shù)最高(2.551),錦屏呆鯉的最低(2.428);湘江野鯉的觀測雜合度最高(0.778),錦屏呆鯉的最低(0.705)?？傮w上,本試驗的5個鯉群體均具有較高的遺傳多樣性,3個呆鯉群體和湘江野鯉群體的多樣性水平無明顯差異。

采用哈迪-溫伯格平衡的卡方檢驗對5個群體的14個位點進(jìn)行檢測發(fā)現(xiàn),在5個鯉群體中均發(fā)生偏離極顯著的位點有5個,錦屏呆鯉、藕團(tuán)呆鯉、永順呆鯉、湘江野鯉及興國紅鯉群體分別有12、10、7、9、8個位點表現(xiàn)出極顯著的遺傳不平衡狀態(tài),表明各群體均在一定程度上偏離了哈迪-溫伯格平衡。

2.3 群體間的遺傳分化分析

GenAlEx軟件計算結(jié)果表明,5個鯉群體在14個位點上群體內(nèi)的近交系數(shù)均為正值,平均值為0.166,群體存在不同程度的近交現(xiàn)象(表4)。本試驗的14個位點中,僅HLJ1274 位點上的遺傳分化系數(shù)大于0.05,其余位點的遺傳分化系數(shù)均小于0.05,各位點群體間的遺傳分化系數(shù)平均值為0.017(小于0.05),說明5個鯉群體間的遺傳分化較弱?；蛄髋c遺傳分化系數(shù)為負(fù)相關(guān)的關(guān)系,基因流為3.088～27.730,各個位點基因流均大于1,其平均值為19.325,說明種群間存在一定的基因流動,遺傳變異主要來自于群體內(nèi)。分子方差分析結(jié)果表明,有5%的遺傳方差來自于群體間,而95%的遺傳方差來源于群體內(nèi)個體間和個體內(nèi),個體間的遺傳變異遠(yuǎn)大于群體間的遺傳變異(表5)。用Structure軟件對5個鯉群體遺傳結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析:當(dāng)K=2時,興國紅鯉從5個群體中分離出來,永順呆鯉、藕團(tuán)呆鯉、錦屏呆鯉與湘江野鯉主要遺傳組分相同;當(dāng)K=3時,永順呆鯉與藕團(tuán)呆鯉相互分離開,并且各自形成各自的遺傳組分,錦屏呆鯉介于其他2個呆鯉養(yǎng)殖群體之間,永順呆鯉與湘江野鯉遺傳結(jié)構(gòu)更相似(圖1)。

圖1 5個鯉群體的遺傳結(jié)構(gòu)Fig.1 Genetic structure bar plot of 5 populations of common carp C. carpio

表4 14個微衛(wèi)星位點在5個鯉群體中的F值和基因流

表5 5個鯉群體的分子方差分析

采用MEGA 4.0軟件構(gòu)建的5個鯉群體間遺傳距離系統(tǒng)樹見圖2,分析結(jié)果顯示,3個呆鯉群體遺傳距離較近,而湘江野鯉與興國紅鯉聚為一支。

圖2 5個鯉群體遺傳距離系統(tǒng)樹Fig.2 Genetic distance phylogenetic tree of 5 populations of common carp C. carpio

2.4 特有等位基因

在5個群體200尾個體的14個座位上,共有389個位點(表6)。錦屏呆鯉、藕團(tuán)呆鯉、永順呆鯉、湘江野鯉、興國紅鯉分別擁有11、16、14、19、20個特有等位基因。特有等位基因的頻率普遍較低(0.013～0.056),還不能將這些基因作為區(qū)分5個群體的特異性分子標(biāo)記。

表6 5個鯉群體在14 個微衛(wèi)星基因座位的特有等位基因及頻率

3 討 論

3.1 5個鯉群體的遺傳多樣性分析

微衛(wèi)星標(biāo)記遵循孟德爾遺傳規(guī)律,具備共顯性遺傳、多態(tài)性高及易于操作等優(yōu)點,在魚類種質(zhì)資源評估、遺傳育種等研究中已得到廣泛應(yīng)用[17-21]。本試驗采用的14個微衛(wèi)星位點,在5個鯉群體中的平均有效等位基因數(shù)為9.42～11.143,多態(tài)信息含量為0.883～0.891,觀測雜合度為0.705～0.778。根據(jù)Botstein等[16]提出的衡量基因變異程度的指標(biāo),本試驗中的5個鯉群體的多態(tài)信息含量均大于0.5,均為高度多態(tài)性位點。有效等位基因數(shù)、多態(tài)信息含量、雜合度的大小近似反映出群體遺傳結(jié)構(gòu)變異程度的高低[22-23]。湘江野鯉和3個呆鯉群體的觀測雜合度為0.705～0.778,表明5個鯉群體遺傳多樣性均較高,具備選育潛力。本試驗的5個鯉魚群體,有效等位基因數(shù)和群體多樣性高于其他學(xué)者關(guān)于鯉多樣性的報道。如劉臻等[24]對湘江野鯉養(yǎng)殖群體和自然群體的遺傳多樣性進(jìn)行分析指出,平均等位基因數(shù)為6.92,平均多態(tài)信息含量為0.5860、0.5347。曾繁振等[25]利用微衛(wèi)星分子標(biāo)記,檢測荷包紅鯉、興國紅鯉和長江野鯉的平均等位基因數(shù)為5.4～8.2,平均多態(tài)信息含量為0.6253～0.7775。馬秀英等[26]在2個黃河鯉群體遺傳多樣性的研究中指出,人工養(yǎng)殖和野生鯉群體平均有效等位基因數(shù)分別為2.350、2.085,多態(tài)信息含量的平均值分別為0.474、0.428。除了引物和樣本的差異外,最主要的原因是本試驗采用的測序儀基因分型技術(shù)分辨率較高,而此前研究通常采用的聚丙烯酰胺凝膠電泳的分辨率相對較低。運(yùn)用微衛(wèi)星標(biāo)記對種質(zhì)資源進(jìn)行評估時,可將引物、片段擴(kuò)增技術(shù)、基因分型技術(shù)等建立統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn),避免因為技術(shù)造成的誤差。

從實際生產(chǎn)來看,由于遺傳漂變以及人工繁殖過程中一些人為的因素,如親本數(shù)量過少、近親交配、定向選擇及缺乏科學(xué)管理手段等,而造成養(yǎng)殖群體等位基因丟失、遺傳多樣性水平降低等現(xiàn)象[27-28]。遺傳多樣性的降低往往導(dǎo)致種群的適應(yīng)能力降低、經(jīng)濟(jì)性狀衰退、抗病能力差等,最終導(dǎo)致種群退化,調(diào)查研究野生群體和養(yǎng)殖群體的遺傳多樣性對魚類種質(zhì)資源的保護(hù)和人工育種具有重要意義,在以往的研究中,養(yǎng)殖群體的遺傳多樣性水平往往有所降低,純合速度加快[27-29]。然而本試驗中,3個呆鯉養(yǎng)殖群體的遺傳多樣性均處于較高水平,且遺傳純度不高,形成此現(xiàn)象的原因可能與湘西山區(qū)稻田養(yǎng)魚歷史悠久、養(yǎng)殖面積廣、親本群體保有量大、魚苗繁殖量高等有關(guān)。據(jù)湘西州地方志記載,該地區(qū)在唐、宋時期就“有良田數(shù)萬頃”,稻田養(yǎng)魚已有發(fā)展,自新中國成立以來,稻田養(yǎng)殖面積基本維持在13 333～33 333 hm2;目前,湘西山區(qū)稻田鯉產(chǎn)量約2.0×104t,后備親本上萬尾[3]。且由于呆鯉繁殖能力強(qiáng),繁殖技術(shù)容易掌握,民間一直盛行傳統(tǒng)的“稻魚連作”、“挑擔(dān)賣魚花”,很多農(nóng)戶家都有繁苗發(fā)花的小土池和溝凼。研究結(jié)果表明,目前呆鯉稻田養(yǎng)殖群體遺傳多樣性處于較高水平,具備良好選育潛力。在呆鯉育種過程中,適當(dāng)增加有效親本數(shù)量,可避免連續(xù)繁育造成的遺傳多樣性下降現(xiàn)象。

3.2 群體間遺傳分化

遺傳分化系數(shù)是體現(xiàn)群體間遺傳分化程度的重要參數(shù),由所有微衛(wèi)星位點上的所有等位基因來衡量[29-30]。本試驗的5個鯉群體,14個位點僅5%的變異由群體間分化導(dǎo)致,而總變異的95%發(fā)生于群體內(nèi)。本試驗中,群體間遺傳分化系數(shù)<0.05,揭示整體水平的遺傳分化程度較低,對5個群體等位基因頻率的分析結(jié)果也驗證了這一點,即群體間共有的等位基因為較高頻率基因,而5個群體各自特有的大多數(shù)等位基因均屬低頻等位基因。雖然群體間分化程度低,但分子方差分析結(jié)果表明群體間遺傳差異顯著。Structure軟件不受群體個體數(shù)目的限制,可基于個體的遺傳組成進(jìn)行群體模擬分析,是用于群體遺傳結(jié)構(gòu)分析的理想工具[31-32]。對5個鯉群體進(jìn)行Structure亞種群數(shù)檢驗,通過遺傳組分的分析,從呆鯉稻田養(yǎng)殖群體中篩選出遺傳差異相對較大的群體,可為稻田適養(yǎng)品種的進(jìn)一步選育提供科學(xué)有效的指導(dǎo)。Structure亞種群數(shù)檢驗結(jié)果顯示:當(dāng)K=2時,3個呆鯉養(yǎng)殖群體與湘江野鯉遺傳組分接近,與興國紅鯉養(yǎng)殖群體分離開,呆鯉群體的親本可能是源自湖南天然流域的自然群體;當(dāng)K=3時,湘西永順和懷化藕團(tuán)的呆鯉養(yǎng)殖群體相互分離開,并且各自形成獨具特色的遺傳組分,其中湘西永順的呆鯉養(yǎng)殖群體與湘江野鯉遺傳結(jié)構(gòu)更相似,而黔東南錦屏縣的呆鯉養(yǎng)殖群體介于其他2個呆鯉養(yǎng)殖群體之間。推測發(fā)生這種現(xiàn)象的結(jié)果可能是,湘江永順呆鯉群體其親本是收集自天然水域的自然群體,而且該群體親本數(shù)量足夠多,而懷化藕團(tuán)的呆鯉已經(jīng)與湘江野鯉產(chǎn)生了一定的遺傳分化。

筆者對呆鯉的遺傳學(xué)信息背景進(jìn)行了初探,并為稻田呆鯉品種選育與遺傳改良提供理論基礎(chǔ)。5個鯉群體的遺傳多樣性和遺傳結(jié)構(gòu)研究表明,5個群體均具有較高的遺傳多樣性,湘西呆鯉之所以不隨水逃跑,可能與千年的稻田養(yǎng)殖模式有關(guān),而群體間遺傳分化水平和遺傳結(jié)構(gòu)表明,呆鯉養(yǎng)殖群體與湘江野鯉并未產(chǎn)生明顯分化。湘西永順呆鯉群體的遺傳信息表明,其具有良好的育種潛力,而懷化藕團(tuán)呆鯉群體與湘江野鯉群體在遺傳結(jié)構(gòu)上已經(jīng)產(chǎn)生差異,具有選育潛力,這2個呆鯉養(yǎng)殖群體均可以自身群體為基礎(chǔ),為稻田鯉品種遺傳育種和改良提供優(yōu)良的種質(zhì)資源。

4 結(jié) 論

本試驗結(jié)果表明,湘西永順、懷化藕團(tuán)和黔東南錦屏3個呆鯉養(yǎng)殖群體的遺傳多樣性均處于較高的水平,具備良好選育潛力,但遺傳純度不高,需要進(jìn)一步提純復(fù)壯。湘西永順和懷化藕團(tuán)的呆鯉養(yǎng)殖群體相互分離開,并且各自形成獨具特色的遺傳組分,其中湘西永順的呆鯉養(yǎng)殖群體與湘江野鯉遺傳結(jié)構(gòu)更相似,而黔東南錦屏縣的呆鯉養(yǎng)殖群體介于其他2個呆鯉養(yǎng)殖群體之間,懷化藕團(tuán)的呆鯉已經(jīng)與湘江野鯉產(chǎn)生了一定的遺傳分化。

致 謝

本論文數(shù)據(jù)處理過程中,得到上海交通大學(xué)海洋學(xué)院曾聰博士的指導(dǎo),特此感謝!