胡夢奕 屠小龍 王永生 張婷素

失巢凋亡是正常細(xì)胞脫離細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）的黏附，喪失細(xì)胞間、細(xì)胞和基質(zhì)間的信號傳遞而發(fā)生的一種程序性凋亡，它可防止細(xì)胞黏附到異常的ECM 上異常生長，對機(jī)體發(fā)育和組織自身平衡具有重要作用[1]。和正常細(xì)胞不同，腫瘤細(xì)胞可通過多種途徑抵制失巢凋亡，使其在脫離ECM 的黏附和細(xì)胞間接觸后并不會發(fā)生細(xì)胞凋亡，反而重新獲得附著能力導(dǎo)致侵襲、擴(kuò)散和轉(zhuǎn)移[2]。中醫(yī)藥具有多靶點(diǎn)、多通路的作用特點(diǎn)，在防治腫瘤、延緩進(jìn)展、提高生活質(zhì)量等方面具有顯著療效，日漸成為腫瘤綜合治療的重要組成部分[3-4]。有研究表明，姜黃素、人參皂苷、清金得生片等中藥單體或復(fù)方可誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞失巢凋亡從而發(fā)揮抗腫瘤作用[5]，但是目前中藥在調(diào)控失巢凋亡領(lǐng)域的研究仍較少，因此積極開展中藥調(diào)控腫瘤相關(guān)性失巢凋亡的相關(guān)研究具有重要意義。

本研究以失巢凋亡相關(guān)靶點(diǎn)為切入點(diǎn)，采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法匹配出相應(yīng)的化合物和中藥，構(gòu)建多層次網(wǎng)絡(luò)并分析其關(guān)聯(lián)性，借助分子對接驗(yàn)證靶點(diǎn)與化合物的相互作用，初步探討了中藥調(diào)節(jié)腫瘤相關(guān)失巢凋亡的物質(zhì)基礎(chǔ)及一般用藥規(guī)律，以期為今后的理論研究、基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)、臨床應(yīng)用等提供思路及依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 收集失巢凋亡相關(guān)靶點(diǎn) 在GeneCards、OMIM、DrugBank、DisGeNET、pharmGKB 等數(shù)據(jù)庫中檢索獲得失巢凋亡相關(guān)靶點(diǎn)，借助通用蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫（Uniprot）進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理，物種來源限制為人（Homo sapiens）。

1.2 篩選候選化合物和潛在靶點(diǎn)，構(gòu)建“靶點(diǎn)-化合物”網(wǎng)絡(luò) TCMSP 數(shù)據(jù)庫中檢索收集作用于失巢凋亡靶點(diǎn)的化合物信息，以ADME 參數(shù)[6-7]和Lipinski規(guī)則[8]為標(biāo)準(zhǔn)篩選候選化合物。具體如下：ADME 參數(shù)[6-7]：口服利用度（OB）≥30%，類藥性（DL）≥0.18，血腦屏障（BBB）≥-0.3，半衰期（HL）＞4，拓?fù)錁O性表面積（TPSA）＜60，可旋轉(zhuǎn)鍵數(shù)（RBN）≤10；Lipinski 規(guī)則[8]：分子量（MW）＜500 Da，氫鍵供體（Hdon）＜5，氫鍵受體（Hacc）＜10，脂水分配系數(shù)（ALog P）＜5。通過候選化合物反向映射靶點(diǎn)，從而獲得潛在靶點(diǎn)，將兩者導(dǎo)入Cytoscape 3.7.2 軟件中構(gòu)建“靶點(diǎn)-化合物”網(wǎng)絡(luò)，并進(jìn)行拓?fù)鋵W(xué)分析。采用R 4.0.3 軟件對潛在靶點(diǎn)進(jìn)行京都基因與基因組百科全書（KEGG）分析。

1.3 分子對接 利用Autodock Vina 軟件對度值前5 的靶點(diǎn)和化合物進(jìn)行分子對接，以驗(yàn)證兩者之間作用關(guān)系的可信度，若對接得分＜-5.0，則認(rèn)為其結(jié)合活性較好，若得分＜-7.0，則認(rèn)為兩者之間有強(qiáng)烈的對接活性。

1.4 獲取相關(guān)中藥，構(gòu)建“靶點(diǎn)-化合物-中藥”網(wǎng)絡(luò)

在TCMSP 數(shù)據(jù)庫中收集候選化合物所對應(yīng)的中藥，并根據(jù)《中國藥典》2015 年版[9]、全國高等中醫(yī)藥院?！笆濉币?guī)劃教材《中藥學(xué)》[10]和《中國臨床藥物大辭典》[11]進(jìn)行篩選，通過Cytoscape 3.7.2 軟件構(gòu)筑“靶點(diǎn)-化合物-中藥”網(wǎng)絡(luò)并進(jìn)行相關(guān)分析。

1.5 中藥數(shù)據(jù)整理分析 參照《中國藥典》2015 年版[9]、全國高等中醫(yī)藥院?！笆濉币?guī)劃教材《中藥學(xué)》[10]和《中國臨床藥物大辭典》[11]對“1.4”中獲得的中藥匹配性味歸經(jīng)并進(jìn)行統(tǒng)計分析。拆分性味歸經(jīng)的組合，如藥味“味辛苦”拆分為“味辛”“味苦”，歸經(jīng)“歸心、肝、脾經(jīng)”拆分為歸“心經(jīng)”“肝經(jīng)”“脾經(jīng)”等。

2 結(jié) 果

2.1 失巢凋亡相關(guān)潛在靶點(diǎn)獲取及機(jī)制分析 檢索GeneCards、OMIM、DrugBank、DisGeNET、pharmGKB后共獲得Anoikis 相關(guān)靶點(diǎn)313 個，能匹配到化合物的靶點(diǎn)有116 個，符合ADME 參數(shù)[6-7]和Lipinski 規(guī)則[8]的化合物所對應(yīng)的靶點(diǎn)有26 個，所以將這26 個靶點(diǎn)定義為Anoikis 的潛在靶點(diǎn)（見表1）。對26 個潛在靶點(diǎn)進(jìn)行KEGG 富集分析（見圖1），結(jié)果顯示涉及多條腫瘤相關(guān)通路，如PI3K-Akt 信號通路、p53 信號通路、JAK-STAT 信號通路、HIF-1 信號通路等，并與多種惡性腫瘤相關(guān)，由此進(jìn)一步驗(yàn)證了失巢凋亡與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，也證實(shí)了本研究所選靶點(diǎn)的可靠性。

圖1 潛在靶點(diǎn)KEGG 富集分析

表1 調(diào)控失巢凋亡的潛在靶點(diǎn)

2.2 候選化合物篩選及“靶點(diǎn)-化合物”網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建經(jīng)潛在靶點(diǎn)映射、ADME 參數(shù)和Lipinski 規(guī)則篩選，共獲得198 個候選化合物，將候選化合物與潛在靶點(diǎn)構(gòu)建“靶點(diǎn)-化合物”網(wǎng)絡(luò)（見圖2）。該網(wǎng)絡(luò)由224個節(jié)點(diǎn)和311 條邊組成，網(wǎng)絡(luò)中節(jié)點(diǎn)代表活性成分或靶點(diǎn)，邊線代表兩者之間的相互聯(lián)系，度值為節(jié)點(diǎn)間相連的路徑數(shù)目，度值越大說明該節(jié)點(diǎn)在此網(wǎng)絡(luò)中的調(diào)控作用越大，其生物學(xué)功能也就越重要。度值前5 的化合物分別為玫瑰樹堿（ellipticine，MOL0091 35）、丹參酮ⅡA（tanshinone Ⅱa，MOL007154）、薯蕷皂 甙（diosgenin，MOL000546）、苦 參 堿（matrine，MOL005944）、隱丹參酮（cryptotanshinone，MOL00708 8），分別對應(yīng)10、8、8、5、5 個作用靶點(diǎn)。度值前5 的靶點(diǎn)為前列腺素內(nèi)過氧化物合酶2（PTGS2）、雄激素受體（AR）、血管內(nèi)皮生長因子受體2（KDR）、白細(xì)胞介素6（IL6）、半胱氨酸蛋白酶3（CASP3），分別對應(yīng)188、79、4、4、4 個化合物。

圖2 失巢凋亡相關(guān)“靶點(diǎn)-化合物”網(wǎng)絡(luò)

2.3 分子對接 將高度值靶點(diǎn)PTGS2、AR、KDR、IL6、CASP3 與高度值化合物玫瑰樹堿（ellipticine）、丹參酮ⅡA（tanshinone Ⅱa）、薯蕷皂甙（diosgenin）、苦參堿（matrine）、隱丹參酮（cryptotanshinone）進(jìn)行分子對接，雖然凋亡調(diào)節(jié)因子Bcl-2（BCL2）、Bcl-2 樣蛋白1（BCL2L1）、半胱氨酸蛋白酶8（CASP8）、半胱氨酸蛋白酶9（CASP9）度值低，但與失巢凋亡關(guān)系較為緊密，故也作為受體進(jìn)行對接。結(jié)果顯示，各靶點(diǎn)與化合物的對接得分均＜-5.0 kcal/mol，其中最低為-9.9 kcal/mol，最高為-6.0 kcal/mol（見圖3）。以二維圖展示9 個靶點(diǎn)與其最佳配體的對接結(jié)果（見圖4），可見各配體均嵌入靶點(diǎn)的活性口袋中，通過疏水作用、形成氫鍵等形式與靶點(diǎn)多個殘基發(fā)生相互聯(lián)系。

圖4 分子對接結(jié)果二維圖

2.4 獲取相關(guān)中藥，構(gòu)建“靶點(diǎn)-化合物-中藥”網(wǎng)絡(luò)198 種候選化合物經(jīng)匹配獲得相關(guān)中藥共220 味，其中8 味未被《中華人民共和國藥典》（2015 年版）[9]、全國高等中醫(yī)藥院校“十二五”規(guī)劃教材《中藥學(xué)》[10]、《中國臨床藥物大辭典》[11]收錄，故最終共收集212 味中藥。以此構(gòu)建“化合物-中藥”網(wǎng)絡(luò)，該網(wǎng)絡(luò)中含有410 個節(jié)點(diǎn)，463 條邊，度值前5 的中藥為延胡索、丹參、白屈菜、苦地丁、黃柏。通過候選化合物的橋接作用收集到靶點(diǎn)數(shù)前20 的中藥為丹參、訶子、胡蘆巴、天冬、菝葜、楮實(shí)子、粉萆薢、瓜蒂、黃精、黃藥子、苦參、兩頭尖、龍葵、綿萆薢、前胡、山豆根、山藥、土茯苓、菟絲子、知母，推測此20 味中藥對調(diào)控失巢凋亡具有較大的作用，中藥對應(yīng)度值及靶點(diǎn)情況見圖5。選取度值≥4 的中藥及關(guān)聯(lián)化合物、靶點(diǎn)構(gòu)建“靶點(diǎn)-化合物-中藥”網(wǎng)絡(luò)（177 個節(jié)點(diǎn)，422 條邊）（見圖6），可供失巢凋亡相關(guān)中藥基礎(chǔ)與臨床研究參考。

圖5 調(diào)控失巢凋亡中藥的對應(yīng)度值及靶點(diǎn)情況

圖6 調(diào)控失巢凋亡“靶點(diǎn)-化合物-中藥”網(wǎng)絡(luò)

2.5 中藥性味歸經(jīng)分析 通過對212 味中藥的性味歸經(jīng)進(jìn)行統(tǒng)計分析，結(jié)果顯示對失巢凋亡具有潛在調(diào)控作用的中藥藥味以苦味出現(xiàn)頻次最高，其次為辛味、甘味；藥性方面以寒性最多，其次為溫性、平性；歸經(jīng)方面以入肝經(jīng)最多，其次為肺經(jīng)、胃經(jīng)，見表2、圖7。

圖7 調(diào)控失巢凋亡中藥的歸經(jīng)分布

表2 調(diào)控失巢凋亡中藥的性味分布

3 討 論

生理狀態(tài)下，上皮或內(nèi)皮細(xì)胞借助于其錨定依賴性存活于ECM 及細(xì)胞之間，一旦其黏附效應(yīng)消失則會發(fā)生脫落進(jìn)而引起失巢凋亡，該過程主要通過線粒體途徑（內(nèi)源性）和死亡受體途徑（外源性）實(shí)現(xiàn)[12]。腫瘤細(xì)胞可通過自分泌或旁分泌機(jī)制使其自身具有失巢凋亡抗性，還可通過PI3K-Akt 信號通路、酪氨酸激酶受體通路、MAPK 通路、整合素通路、經(jīng)典Wnt/β-catenin 通路、TGF-β/Smad 通路等抑制失巢凋亡，從而經(jīng)淋巴或血液循環(huán)發(fā)生侵襲、擴(kuò)散和轉(zhuǎn)移[13]。本研究從GeneCards、DrugBank、OMIM 等數(shù)據(jù)庫搜索、經(jīng)TCMSP 匹配篩選后獲得26 個潛在靶點(diǎn)，根據(jù)KEGG 結(jié)果可證實(shí)，納入的潛在靶點(diǎn)具有高度可靠性。通過“靶點(diǎn)-化合物”網(wǎng)絡(luò)篩選，度值前5的靶點(diǎn)為PTGS2、AR、KDR、IL6、CASP3。PTGS2 又稱環(huán)氧化酶-2（COX-2），大量研究證實(shí)COX-2 過表達(dá)與多種惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[14]。E-鈣黏素是維持細(xì)胞間黏附性和穩(wěn)定正常組織結(jié)構(gòu)的主要因子，負(fù)責(zé)細(xì)胞與外界的錨定連接。一方面，COX-2 通過前列腺素E2（PGE2）誘導(dǎo)產(chǎn)生E-鈣黏素轉(zhuǎn)錄抑制蛋白，抑制E-鈣黏素基因的轉(zhuǎn)錄；另一方面，COX-2通過前列腺素H2（PGH2） 誘導(dǎo)基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP）大量表達(dá)，對E-鈣黏素進(jìn)行水解，COX-2 通過以上兩條途徑下調(diào)E-鈣黏素的表達(dá)，使得腫瘤細(xì)胞的表面黏附性較正常細(xì)胞低。研究發(fā)現(xiàn)，失巢凋亡相關(guān)通路Wnt/β-catenin 通路、整合素通路也均與COX-2 密切相關(guān)[15]。KDR[16-17]、AR[18]、IL6[19]也同樣被證實(shí)在調(diào)控腫瘤細(xì)胞失巢凋亡過程中扮演重要角色。無論是死亡受體途徑還是線粒體途徑，均是通過激活半胱氨酸蛋白酶來進(jìn)行調(diào)節(jié)，包括CASP3、CASP8、CASP9 等[13]；Bcl-2 蛋白家族則是線粒體膜電位和通透性的重要調(diào)節(jié)因子，在失巢凋亡內(nèi)源性途徑中起到重要作用，故本研究將BCL2、BCL2L1、CASP8、CASP9 也納入后續(xù)的分子對接研究。

細(xì)胞凋亡與細(xì)胞增殖相互對立又相互關(guān)聯(lián)，共同維持生物體內(nèi)細(xì)胞的動態(tài)平衡，其屬性可以從中醫(yī)陰陽理論的角度來進(jìn)行認(rèn)識，細(xì)胞增殖屬陽，細(xì)胞凋亡屬陰，兩者保持動態(tài)平衡，一旦一方出現(xiàn)異常，陰陽失衡則出現(xiàn)病理狀態(tài)，失巢凋亡屬于凋亡的一種類型，故歸屬于陰，腫瘤的發(fā)生正是由于細(xì)胞的陽盛（過度增殖）而陰衰（凋亡減退），此即為細(xì)胞層面的陽盛陰衰，當(dāng)?shù)蛲鏊俣却笥谠鲋乘俣?，即?xì)胞增殖與凋亡趨向于“陰平陽秘”時，則腫瘤消退[5，20]。

中醫(yī)藥抗腫瘤具有療效顯著、副作用低等優(yōu)點(diǎn)，呈現(xiàn)多成分、多靶點(diǎn)、多通路的綜合模式。從“靶點(diǎn)-化合物”網(wǎng)絡(luò)可知，多個化合物可與多個靶點(diǎn)發(fā)生相互作用，其中度值前5 的化合物分別為玫瑰樹堿、丹參酮ⅡA、薯蕷皂甙、苦參堿、隱丹參酮，以上化合物均被證實(shí)具有抗腫瘤作用[21-24]，其中苦參堿可通過激活抑癌基因p53、凋亡調(diào)節(jié)因子Bax 依賴的caspase-3，并阻斷ECM-整合素介導(dǎo)的細(xì)胞存活途徑，從而控制失巢凋亡誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡[25]。丹參酮ⅡA、隱丹參酮均為丹參提取物，研究發(fā)現(xiàn)丹參酮ⅡA 能夠阻斷TGF-β/Smad 通路、上調(diào)E-鈣黏素蛋白，防止形成上皮-間質(zhì)（EMT）轉(zhuǎn)化，誘導(dǎo)失巢凋亡[26-27]。隱丹參酮則可通過抑制JAK2/STAT3 和PI3K/Akt/NF-κB 信號通路，改變Bcl-2 家族的表達(dá)而誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生失巢凋亡[28]。本研究共篩選獲得212 味中藥與失巢凋亡相關(guān)，綜合度值及靶點(diǎn)數(shù)情況，尤以丹參與失巢凋亡的關(guān)系最為密切。薯蕷皂苷是一種甾體類皂苷，廣泛存在于各種植物中，實(shí)驗(yàn)證實(shí)薯蕷皂苷能夠促進(jìn)活性氧（ROS）產(chǎn)生、調(diào)節(jié)Bcl-2 蛋白家族的平衡、激活caspase 級聯(lián)反應(yīng)，參與線粒體途徑和死亡受體途徑[29]。玫瑰樹堿是從夾竹桃植物的葉和樹皮中提取或者經(jīng)由化學(xué)合成的一種生物堿，它可增加細(xì)胞內(nèi)的ROS，激活MAPKs 誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡[30]，關(guān)于玫瑰樹堿與失巢凋亡的研究較少，值得更進(jìn)一步的探索。分子對接結(jié)果表明，以上化合物與9 個靶點(diǎn)對接良好，尤以丹參酮ⅡA 與AR、薯蕷皂苷與PTGS2 對接活性最佳，為今后研究提供了新的思路與切入點(diǎn)。

本研究結(jié)果表明，潛在可調(diào)控失巢凋亡的中藥藥味多為苦、辛、甘；藥性以寒、溫、平為主?？辔端幠苄鼓茉锬軋裕鼓[瘤治療中常常運(yùn)用苦味藥來達(dá)到瀉火存陰、降逆通結(jié)的功效[31]，結(jié)合藥性以苦寒居多，藥理學(xué)研究證實(shí)苦寒中藥具有誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞分化、抑制腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移、抑制腫瘤血管生成、逆轉(zhuǎn)腫瘤多藥耐藥性作用、抑制端粒酶活性等作用，并且還能夠提高機(jī)體免疫功能[32]。辛味藥能散能行，具有行氣活血之效，中醫(yī)認(rèn)為腫瘤發(fā)病多與氣滯、血瘀有關(guān)，故臨床常用行氣活血化瘀法來治療腫瘤，用藥尤以辛溫之品為多。辛苦配伍、寒溫并用，既可制約偏盛，又取“辛開苦降”之意以斡旋人體氣機(jī)。甘味藥能補(bǔ)、能和、能緩，具有緩急止痛、補(bǔ)益和中、調(diào)和藥性的作用。腫瘤形成的根本在于正虛，且腫瘤為消耗性疾病，癌毒日久耗傷正氣而氣血俱虛，甘味藥能夠滋補(bǔ)強(qiáng)壯，補(bǔ)益氣血陰陽，改善腫瘤患者正虛的狀態(tài)?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，甘味藥含有糖類、氨基酸、蛋白質(zhì)、維生素等，可增強(qiáng)機(jī)體免疫功能，具有“扶正”之效[33-34]。辛甘合用更能溫陽補(bǔ)虛?！秲?nèi)經(jīng)》有云：“辛甘淡屬陽，酸苦咸屬陰”，藥性中寒涼屬陰，溫?zé)釋訇?，辛苦寒溫合用，加之甘味藥調(diào)和補(bǔ)虛，可解寒熱錯雜之態(tài)，散壅塞固結(jié)之邪，且無偏勝之害，這也正是中醫(yī)陰陽平衡的體現(xiàn)。在歸經(jīng)方面則以入肝、肺、胃經(jīng)為多。肝主疏泄、調(diào)暢氣機(jī)，從左而升；肺主氣、主治節(jié)，從右而降；脾胃居中，為氣機(jī)升降之樞紐，三者共同維系人體之氣正常運(yùn)行?！鞍俨〗陨跉狻?，腫瘤的發(fā)生發(fā)展除了正氣不足之外，還與氣機(jī)失調(diào)有關(guān)[35]，而且肝藏血、脾胃為氣血生化之源、肺朝百脈，運(yùn)用入肝、肺、胃經(jīng)的藥物則可發(fā)揮通行血脈、補(bǔ)益氣血、祛瘀生新之效。綜上推測失巢凋亡功能障礙的中醫(yī)病機(jī)或?yàn)闅鈾C(jī)失調(diào)、氣血不和，久而耗傷正氣，遣方用藥需注意調(diào)暢氣機(jī)，調(diào)和氣血，扶正培本。

本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，從失巢凋亡相關(guān)靶點(diǎn)入手，構(gòu)建了“靶點(diǎn)-化合物”“靶點(diǎn)-化合物-中藥”網(wǎng)絡(luò)，系統(tǒng)探討了中藥調(diào)控腫瘤相關(guān)性失巢凋亡的物質(zhì)基礎(chǔ)和一般規(guī)律，為進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)研究和臨床遣方用藥提供思路，具有一定的研究意義。但是，本研究仍有一定的局限性，雖然本研究通過多個數(shù)據(jù)庫盡可能地獲得較為全面的相關(guān)信息，可是由于數(shù)據(jù)庫更新時限，可能導(dǎo)致靶點(diǎn)、化合物和中藥收集不全。此外，本研究只考慮到靶點(diǎn)、化合物、中藥之間是關(guān)系數(shù)量，未兼顧到靶點(diǎn)與化合物之間的量效關(guān)系、臨床應(yīng)用時中藥劑量、煎煮等各種因素帶來的影響，故所得結(jié)果仍需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。