王一樂 林子鈞

痤瘡是一種常見的慢性炎癥性疾病，其全球發(fā)病率約9%，且處于增長(zhǎng)趨勢(shì)[1-2]。痤瘡發(fā)病與雄激素介導(dǎo)的皮脂生成、角化過度、痤瘡角質(zhì)桿菌定植及與先天性和適應(yīng)性機(jī)制相關(guān)的炎癥反應(yīng)有關(guān)。因此，抗雄激素分泌、抗感染及靶向特定因子的生物抗體治療已成為研究焦點(diǎn)[3]。中醫(yī)藥擁有悠久的歷史傳統(tǒng)和獨(dú)特的理論及技術(shù)方法，具有生物活性高、藥理機(jī)制新穎、毒性低、副作用有限等優(yōu)勢(shì)[4]。大柴胡湯在治療痤瘡方面具有良好的效果[5]。本研究利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，通過蛋白-蛋白互作分析、富集分析以及分子對(duì)接技術(shù)等，探索大柴胡湯治療痤瘡的潛在分子機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 大柴胡湯活性成分及其靶點(diǎn)鑒定 通過中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)與分析平臺(tái)（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP，https://old.tcmsp -e.com/tcmsp.php）數(shù)據(jù)庫(kù)獲取大柴胡湯各藥材的化學(xué)成分，以口服利用度（oral availability，OB）≥30%和類藥性（drug-likeness，DL）≥0.18 篩選活性成分，進(jìn)一步在TCMSP 數(shù)據(jù)庫(kù)獲取活性成分靶點(diǎn)，利用Uniprot 數(shù)據(jù)庫(kù)統(tǒng)一靶點(diǎn)名稱，剔除非人類靶點(diǎn)。

1.2 痤瘡相關(guān)基因鑒定 利用GeneCards（https://www.genecards.org/）和DisGeNET（https://www.disgenet.org/）數(shù)據(jù)庫(kù)篩選痤瘡相關(guān)基因，以“痤瘡”作為關(guān)鍵詞進(jìn)行檢索，合并兩個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)結(jié)果并剔除重復(fù)項(xiàng)。

1.3 蛋白互作分析 合并大柴胡湯靶點(diǎn)和痤瘡相關(guān)基因獲取交集作為大柴胡湯治療痤瘡的潛在靶點(diǎn)，利用STRING（https://string-db.org/）數(shù)據(jù)庫(kù)獲取潛在靶點(diǎn)的蛋白互作數(shù)據(jù)，設(shè)置可信度閾值為0.7，導(dǎo)出蛋白互作數(shù)據(jù)后利用Cytoscape 軟件繪制蛋白互作網(wǎng)絡(luò)。

1.4 網(wǎng)絡(luò)分析 利用Cytoscape 軟件進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建和分析，主要包括藥材-成分網(wǎng)絡(luò)，成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)，蛋白互作網(wǎng)絡(luò)以及藥材-成分-靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)。利用Analyze Network 工具進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋵W(xué)分析，利用merge 工具進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)合并。

1.5 富集分析 采用clusterprofiler 包進(jìn)行富集分析，對(duì)潛在靶點(diǎn)的細(xì)胞組分（cellular component，CC）、生物學(xué)功能（biological process，BP）、分子功能（molecular function，MF）以及京都基因與基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）通路進(jìn)行富集分析和可視化。以P 值<0.05 篩選顯著富集的通路。

1.6 分子對(duì)接分析 通過PubChem（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）以及RCSB PDB 數(shù)據(jù)庫(kù)（https://www.rcsb.org/）獲取活性成分和靶點(diǎn)的結(jié)構(gòu)文件，通過PyMOL 軟件提取目的蛋白結(jié)構(gòu)和對(duì)接口袋信息，利用AutoDock 軟件進(jìn)行加氫、計(jì)算電荷后進(jìn)行分子對(duì)接分析，選擇最優(yōu)結(jié)構(gòu)的分子結(jié)合能。

2 結(jié) 果

2.1 大柴胡湯的活性成分和靶點(diǎn)的鑒定及互作成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò) 基于TCMSP 數(shù)據(jù)庫(kù)，我們檢索了大柴胡湯中8 類藥材的化學(xué)成分，并利用OB≥30%和DL≥0.18 篩選出潛在的活性成分。如圖1 所示，我們鑒定到110 種活性成分，其中黃芩36 種，枳實(shí)22種，白芍13 種，柴胡17 種，大黃16 種，半夏13 種，大棗5 種以及生姜5 種。在110 種活性成分中，82 種活性成分鑒定到潛在靶點(diǎn)共274 個(gè)，見圖2。

圖1 大柴胡湯的藥材-活性成分網(wǎng)絡(luò)圖

圖2 大柴胡湯的活性成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖

2.2 大柴胡湯治療痤瘡的潛在靶點(diǎn)鑒定 為了進(jìn)一步獲取大柴胡湯治療痤瘡的潛在靶點(diǎn)，我們首先從GeneCards 和DisGeNET 數(shù)據(jù)庫(kù)中獲取了痤瘡相關(guān)的基因，結(jié)果共得到1710 個(gè)痤瘡相關(guān)基因。通過與大柴胡湯的靶點(diǎn)取交集，我們共鑒定到100 個(gè)潛在靶點(diǎn)（見圖3A）。為了進(jìn)一步闡明這些靶點(diǎn)的重要成分，我們從STRING 數(shù)據(jù)庫(kù)獲取了靶點(diǎn)間的蛋白互作數(shù)據(jù)并構(gòu)建蛋白互作網(wǎng)絡(luò)，如圖3B 所示。該網(wǎng)絡(luò)包含92 個(gè)靶點(diǎn)蛋白和522 對(duì)互作信息，而腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）、白介素-6（interleukin 6，IL6）、白介素- 1B（interleukin 1 beta，IL1B）等靶點(diǎn)具有最多的互作節(jié)點(diǎn)，暗示其在大柴胡湯治療痤瘡中的重要作用。

圖3 大柴胡湯治療痤瘡的潛在靶點(diǎn)及其蛋白互作圖

2.3 潛在靶點(diǎn)的功能富集分析結(jié)果 通過基因本體論（gene ontology，GO）和KEGG 富集分析，我們得到了這些潛在靶點(diǎn)涉及的重要通路和生物學(xué)過程。結(jié)果顯示這些潛在靶點(diǎn)顯著富集于白介素17（interleukin 17，IL-17）、缺氧誘導(dǎo)因子1（hypoxia-inducible factor 1，HIF-1）、核因子B 亞基（nuclear factor kappa B subunit，NF-κB）等信號(hào)通路（見圖4）。另外，這些潛在靶點(diǎn)與基因表達(dá)調(diào)控、細(xì)胞增殖和凋亡等過程有關(guān)，見圖5。

圖4 大柴胡湯治療痤瘡潛在靶點(diǎn)的GO 功能富集分析

圖5 大柴胡湯治療痤瘡潛在靶點(diǎn)的KEGG 通絡(luò)富集分析

2.4 核心靶點(diǎn)及分子對(duì)接分析 利用功能富集分析的結(jié)果，我們構(gòu)建了大柴胡湯治療痤瘡的藥材-成分-靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)圖（見圖6）。其中，前列腺素過氧化物內(nèi)合酶2（prostaglandin-endoperoxide synthase 2，PTGS2）處于該網(wǎng)絡(luò)最核心的位置，被認(rèn)為是大柴胡湯治療痤瘡的最核心靶點(diǎn)。富集分析顯示，潛在靶點(diǎn)顯著富集于IL-17 信號(hào)通路。因此，我們利用分子對(duì)接進(jìn)一步驗(yàn)證了IL-17 信號(hào)通路的相關(guān)靶點(diǎn)與活性成分的結(jié)合活性（見表1）。結(jié)果顯示，槲皮素（MOL000098）和木犀草素（MOL000006）與IL-17 信號(hào)通路相關(guān)靶點(diǎn)具有較強(qiáng)的結(jié)合能力。

表1 大柴胡湯活性成分與IL-17 信號(hào)通路相關(guān)蛋白的分子對(duì)接結(jié)果

圖6 大柴胡湯治療痤瘡的藥材-成分-靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)圖

3 討 論

本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)結(jié)合分子對(duì)接技術(shù)系統(tǒng)化地研究了大柴胡湯治療痤瘡的分子機(jī)制。共鑒定出110 種潛在活性成分和274 個(gè)靶點(diǎn)，再與痤瘡的相關(guān)基因取交集后得到100 個(gè)潛在靶點(diǎn)。PPI 分析顯示TNF、IL6、IL1B 等靶點(diǎn)具有最多的互作節(jié)點(diǎn)，表明其在大柴胡湯治療痤瘡中起到重要作用。TNF、IL6、IL1B 作為炎癥標(biāo)志物，可以在一定程度上反映炎癥水平[6]，而痤瘡的發(fā)病也與炎癥反應(yīng)密切相關(guān)。有研究發(fā)現(xiàn)，白藜蘆醇可以在肽聚糖誘導(dǎo)下促進(jìn)NF-κB p65 亞基的SIRT1 表達(dá)和脫乙?；瑥亩档虸L-1β和IL-6 的分泌，在痤瘡的治療中發(fā)揮抗炎作用[7]。綠原酸可以通過降低NF-κB 信號(hào)通路的活性顯著下調(diào)TNF-α 的表達(dá)，從而起到抗炎作用，進(jìn)而改善痤瘡[8]。因此，大柴胡湯可能通過干預(yù)上述靶點(diǎn)進(jìn)而起到治療痤瘡的效果。

功能富集分析表明，IL-17、HIF-1、NF-κB 等信號(hào)通路與靶點(diǎn)之間存在關(guān)聯(lián)。IL-17 是由T 輔助細(xì)胞Th17 產(chǎn)生的炎癥因子，可通過直接或間接誘導(dǎo)多種炎癥因子以及趨化因子，參與炎癥反應(yīng)[9]。實(shí)驗(yàn)證實(shí)，IL-17/Th17 通路在痤瘡病變中顯著激活，而抑制IL-17 信號(hào)通路也被認(rèn)為是治療痤瘡的新策略之一[10]。HIF-1 可以在低氧下激活多種靶基因的轉(zhuǎn)錄，在細(xì)胞、組織生長(zhǎng)發(fā)育和生理應(yīng)激，以及某些病理過程中有重要的作用[11]。最新研究發(fā)現(xiàn)，HIF-1 可以在缺氧條件下促進(jìn)脂質(zhì)累積，并且對(duì)痤瘡的發(fā)生發(fā)展具有較大的影響[12]。NF-κB 信號(hào)通路可以介導(dǎo)免疫應(yīng)答，調(diào)控炎癥反應(yīng)，在一些炎癥性疾病中具有重要的作用[13]。近期研究發(fā)現(xiàn)，長(zhǎng)鏈非編碼RNA H19 可以通過miR-196a/TLR2 軸激活NF-κB 信號(hào)通路，進(jìn)而影響?zhàn)畀彽募膊∵M(jìn)程[14]?；谝陨涎芯?，我們推斷大柴胡湯治療痤瘡可能是通過調(diào)控IL-17、HIF-1、NF-κB等信號(hào)通路實(shí)現(xiàn)的，進(jìn)一步完善了大柴胡湯臨床治療痤瘡潛在的作用機(jī)制。

分析顯示PTGS2 是大柴胡湯治療痤瘡的另一個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)。PTGS2 是一種環(huán)加氧酶，其可催化花生四烯酸代謝和前列腺素合成，是炎癥的主要介質(zhì)[15]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，脂多糖可以通過增加皮脂腺中PTSG2、PGF-2α 和PGF-2α 介導(dǎo)的proMMP-2 產(chǎn)生，加重包括痤瘡和毛囊炎在內(nèi)的皮膚疾病的炎癥反應(yīng)[16]。此外，有研究認(rèn)為PTGS2 是無(wú)患子及其活性化合物發(fā)揮抗痤瘡作用的重要靶點(diǎn)之一[17]。分子對(duì)接技術(shù)進(jìn)一步分析了大柴胡湯的活性成分與相關(guān)靶點(diǎn)之間的結(jié)合活性，顯示槲皮素和木犀草素與IL-17 信號(hào)通路的相關(guān)靶點(diǎn)具有較強(qiáng)的結(jié)合能力。槲皮素是一種抗氧化劑，具有抑制痤瘡丙酸桿菌誘導(dǎo)的皮膚炎癥的潛在治療作用[18]。木犀草素屬于類黃酮的黃酮亞類，具有抑制脂肪酶活性的作用并有助于痤瘡的臨床管理[19]。因此，大柴胡湯中的槲皮素與木犀草素可能通過與IL-17 信號(hào)通路的相關(guān)靶點(diǎn)結(jié)合，調(diào)控IL-17 信號(hào)通路，從而降低痤瘡患者的炎癥水平，最終起到改善痤瘡的作用。綜上所述，本研究結(jié)果豐富了大柴胡湯治療痤瘡依靠多組分、多靶點(diǎn)和多信號(hào)傳導(dǎo)配合發(fā)揮作用的分子機(jī)制。