倪晨寧 王小勇 石海蘭 沈肖奮

黃褐斑是一種高度流行的獲得性色素障礙性疾病，絕大多數(shù)患者為女性，臨床表現(xiàn)為額頭、臉頰、下巴等區(qū)域出現(xiàn)不對(duì)稱、不規(guī)則的棕褐色斑塊，中醫(yī)稱其為“肝斑”“黧黑斑”“面塵”等[1-2]。組織病理學(xué)顯示，黃褐斑病變皮膚具有較大樹(shù)突的活躍黑素細(xì)胞數(shù)量增加，黑色素生成增多并向角質(zhì)層形成細(xì)胞轉(zhuǎn)移，日光性彈力組織變性，真皮乳頭層黑色素沉積，真皮血管、肥大細(xì)胞和白細(xì)胞數(shù)量增加[3]。小眼畸形相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子（microphthalmia-associated transcription factor，MITF）能夠調(diào)控多種黑素形成相關(guān)酶的轉(zhuǎn)錄水平，在黑素細(xì)胞的發(fā)育、分化和生存中起著關(guān)鍵作用[4]。激活磷脂酰肌醇3 激酶/蛋白激酶B （phosphatidylinositol 3 kinase/protein kinase B，PI3K/AKT）信號(hào)通路可下調(diào)MITF 表達(dá)，減少黑色素合成[5]。中醫(yī)典籍對(duì)黃褐斑類似癥狀早有記載，積累了豐富的用藥經(jīng)驗(yàn)[6]。甘草、當(dāng)歸、赤芍皆為消斑內(nèi)服處方中常用藥材，多與其他藥物配伍，達(dá)到補(bǔ)虛、溫里、活血化瘀、利水滲濕的效果[7-8]。本研究基于MITF 與PI3K/AKT信號(hào)通路，通過(guò)體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)與動(dòng)物黃褐斑模型探討甘草、當(dāng)歸、赤芍三味中藥對(duì)黃褐斑的影響與作用機(jī)制，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 30 只SPF 級(jí)5 周齡健康雌性棕色豚鼠，體質(zhì)量（250±30）g，購(gòu)自安徽醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，動(dòng)物合格證號(hào)SCXK（皖）2022-004。于溫度（25±2）℃、濕度40%～70%的SPF 房?jī)?nèi)適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，飼養(yǎng)期間允許豚鼠自由攝食飲水。本次研究經(jīng)浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)審核通過(guò)（倫理審批號(hào)20210406），實(shí)驗(yàn)中的所有操作均在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理指導(dǎo)守則指導(dǎo)下進(jìn)行。

1.2 試 劑 甘草（批號(hào)201112）、當(dāng)歸（批號(hào)201009）、赤芍（批號(hào)210113）飲片購(gòu)自山東百味堂中藥飲片有限公司；人表皮黑素細(xì)胞（貨號(hào)CP-H108）購(gòu)自武漢益普生物科技有限公司；254 培養(yǎng)基（貨號(hào)M254500）、黑素細(xì)胞生長(zhǎng)添加劑（貨號(hào)S0025）購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher 公司；PI3K 抑制劑LY294002（貨號(hào)LKT-L960002）購(gòu)自艾美捷科技有限公司；MTT 檢測(cè)試劑盒（貨號(hào)M1020）購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；酪氨酸酶活性檢測(cè)試劑盒（貨號(hào)PH0597）購(gòu)自北京普非生物科技有限公司；HE 染色試劑盒（貨號(hào)C0105S）、BCA 蛋白濃度測(cè)定試劑盒（貨號(hào)P0012）購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；Fontana-Masson染色試劑盒（貨號(hào)CLSG80154）購(gòu)自北京達(dá)科為生物技術(shù)有限公司；兔MITF（貨號(hào)ab303530）、兔PI3K（貨號(hào)ab191606）、兔磷酸化PI3K（p-PI3K，貨號(hào)ab182651）、兔p-AKT（貨號(hào)ab81283）、兔糖原合成酶激酶-3β（glycogen synthase kinase-3β，GSK3β，貨號(hào)ab32391）、兔p-GSK3β（貨號(hào)ab75814）購(gòu)自英國(guó)Abcam 公司；兔AKT（貨號(hào)9272）購(gòu)自美國(guó)CST 公司。其他試劑均為市售分析純。

1.3 主要儀器 DNP-9272 電熱恒溫培養(yǎng)箱（上海甘易儀器設(shè)備有限公司），Leica DM4 M 光學(xué)顯微鏡（德國(guó)Leica 公司），F(xiàn)lexStation 3 多功能酶標(biāo)儀工作站（美國(guó)分子儀器公司），M1324R 微量高速冷凍離心機(jī)（深圳瑞沃德生命科技有限公司），LF-Mini4 型小型垂直電泳槽（北京龍方科技有限公司），eBlotTML1快速濕轉(zhuǎn)儀（南京金斯瑞生物科技有限公司），TS-2000 型脫色搖床（江蘇海門其林貝爾儀器制造有限公司），接觸式無(wú)損定量成像儀（上海易孛特光電技術(shù)有限公司）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 單味中藥制備 甘草、當(dāng)歸、赤芍飲片各取約18 g，加入600 mL 去離子水浸泡1 h，大火煎開(kāi)后小火煎煮30 min，雙層紗布過(guò)濾后再次加水煎煮，合并2 次煎得的濾液并濃縮，高壓滅菌，最終甘草、當(dāng)歸、赤芍藥液生藥量分別為0.56、0.47、0.39 g/mL。

2.2 細(xì)胞培養(yǎng)與分組 復(fù)蘇黑素細(xì)胞，使用含1%黑素細(xì)胞生長(zhǎng)添加劑的254 培養(yǎng)基于37 ℃、5%CO2、飽和濕度的電熱恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。將黑素細(xì)胞分為0、50、100、500、1000 μg/mL 和1000 μg/mL+LY294002 組，向培養(yǎng)基中加入相應(yīng)濃度的中藥藥液與25 nmol LY294002，正常培養(yǎng)48 h 用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.3 MTT 法檢測(cè)不同劑量藥物細(xì)胞毒性 0、50、100、500、1000 μg/mL 組細(xì)胞以1500 個(gè)/孔的密度接種于96 孔板內(nèi)，正常培養(yǎng)24 h 后進(jìn)行MTT 檢測(cè)。每孔加入10 μL 濃度為5 mg/mL 的MTT 溶液，37 ℃下孵育4 h，加入100 μL 二甲基亞砜（DMSO），避光震蕩15 min，酶標(biāo)儀570 nm 測(cè)定吸光度。

2.4 酪氨酸酶活性測(cè)定 胰酶消化收集0、50、100、500、1000 μg/mL 組細(xì)胞，4 ℃超聲破碎、16000 r/min離心30 min，BCA 定量后將細(xì)胞裂解產(chǎn)物調(diào)整至相同蛋白濃度，使用酪氨酸酶活性檢測(cè)試劑盒檢測(cè)各組細(xì)胞酪氨酸酶活性，嚴(yán)格按照其操作步驟進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

2.5 黑色素含量測(cè)定 胰酶消化收集0、50、100、500、1000 μg/mL 組細(xì)胞，加入含10%DMSO 的1 mol/L氫氧化鈉溶液1 mL，80 ℃水浴加熱1 h，取100 μL混合液于酶標(biāo)儀405 nm 測(cè)定吸光度。

2.6 動(dòng)物分組與造模 30 只豚鼠采用隨機(jī)單位組設(shè)計(jì)分組法分為對(duì)照組、模型組、甘草組、當(dāng)歸組、赤芍組，每組6 只。所有豚鼠背部3 cm×3 cm 區(qū)域剃毛，模型組、甘草組、當(dāng)歸組、赤芍組接受波長(zhǎng)320 nm的中波紫外線（ultraviolet B，UVB）照射60 min，照射距離10 cm，每日1 次，對(duì)照組僅暴露于普通光源中，不接受照射。同時(shí)，甘草組、當(dāng)歸組、赤芍組分別接受甘草、當(dāng)歸、赤芍藥液灌胃，劑量均為0.3 mg/kg，對(duì)照組、模型組接受等體積生理鹽水灌胃，共持續(xù)4 周。

2.7 皮膚組織黑色素含量測(cè)定 3%異氟醚麻醉所有豚鼠，切取背部造模處皮膚。取部分皮膚組織制成勻漿，其余操作同2.5。

2.8 組織學(xué)評(píng)價(jià) 取部分皮膚組織，置入4%多聚甲醛固定后常規(guī)石蠟包埋制成厚度為3 μm 的切片，按照HE、Fontana-Masson 染色試劑盒說(shuō)明書(shū)的操作步驟進(jìn)行染色，每組隨機(jī)挑選5 個(gè)視野，于光鏡下觀察皮膚組織形態(tài)并拍照。

2.9 Western blot 檢測(cè)MITF、PI3K/AKT 信號(hào)通路相關(guān)分子水平 收集0、1000 μg/mL 和1000 μg/mL+LY294002 組細(xì)胞，加入適量預(yù)冷RIPA，充分混勻后冰上孵育30 min；取部分皮膚組織勻漿，加入適量預(yù)冷RIPA，充分混勻后冰上孵育1.5 h。4 ℃、10000 r/min離心10 min，取上清液，BCA 定量后制樣。凝膠電泳分離樣品蛋白，轉(zhuǎn)膜，截取目的條帶浸于5%脫脂奶粉制成的封閉液中，置于搖床上室溫封閉1 h。封閉液稀釋一抗制成孵育液，稀釋比例為1∶500，充分搖勻后置于4 ℃環(huán)境下過(guò)夜。洗膜，加入稀釋比例為1∶5000 的對(duì)應(yīng)二抗孵育液，室溫孵育2 h，洗膜后加入ECL 化學(xué)發(fā)光液，避光反應(yīng)5 min，用定量成像儀收集結(jié)果。

2.10 免疫組化檢測(cè)MITF、PI3K/AKT 信號(hào)通路相關(guān)分子表達(dá) 石蠟切片經(jīng)脫蠟、水化、抗原修復(fù)、封閉后加入稀釋度為1∶100 的相應(yīng)抗體，室溫孵育1 h。加入生物素標(biāo)記的二抗，室溫孵育30 min，加入鏈霉親和素酶，室溫孵育30 min，二氨基聯(lián)苯胺顯色，蘇木精復(fù)染，常規(guī)脫水、透明后用中性樹(shù)膠封片，于光鏡下拍攝實(shí)驗(yàn)結(jié)果，每張切片隨機(jī)選擇5 個(gè)不同視野，用Image J 軟件進(jìn)行圖像分析，取平均值作為蛋白相對(duì)表達(dá)量。

2.11 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 24.0 統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理，計(jì)量資料經(jīng)Kolmogorov-Smirov 檢驗(yàn)服從正態(tài)分布，使用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s） 表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t 檢驗(yàn)。P＜0.05 表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié) 果

3.1 不同中藥抑制黑素細(xì)胞活力比較 MTT 檢測(cè)結(jié)果顯示，與各單味中藥0 μg/mL 組比較，50、100 μg/mL組細(xì)胞活力差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），500、1000μg/mL組細(xì)胞活力明顯受到抑制（P＜0.05）。見(jiàn)表1。

表1 不同中藥濃度對(duì)黑素細(xì)胞活力影響（%，±s）

表1 不同中藥濃度對(duì)黑素細(xì)胞活力影響（%，±s）

注：與0 μg/mL 比較，aP＜0.05

濃度0 μg/mL 50 μg/mL 100 μg/mL 500 μg/mL 1000 μg/mL孔數(shù)細(xì)胞活力33333甘草100.00 93.67±13.71 87.95±6.67 70.20±9.33a 66.82±9.65a當(dāng)歸100.00 93.04±10.55 89.39±5.66 79.77±8.43a 56.62±15.99a赤芍100.00 91.64±12.67 91.46±19.62 81.41±17.84a 77.51±7.33a

3.2 不同中藥抑制黑素細(xì)胞酪氨酸酶活性比較 酪氨酸酶活性檢測(cè)結(jié)果顯示，與各單味中藥0 μg/mL組比較，甘草500、1000 μg/mL 組，當(dāng)歸100、500、1000 μg/mL 組和赤芍1000 μg/mL 組酪氨酸酶活性明顯受到抑制（P＜0.05）。見(jiàn)表2。

表2 不同中藥濃度對(duì)黑素細(xì)胞酪氨酸酶活性影響（%±s）

表2 不同中藥濃度對(duì)黑素細(xì)胞酪氨酸酶活性影響（%±s）

注：與0 μg/mL 比較，aP＜0.05

濃度0 μg/mL 50 μg/mL 100 μg/mL 500 μg/mL 1000 μg/mL孔數(shù)酪氨酸酶活性33333甘草100.00 92.76±5.89 86.91±10.63 75.60±5.89a 65.07±5.13a當(dāng)歸100.00 87.83±4.36 79.80±8.46a 65.82±14.20a 52.69±5.52a赤芍100.00 94.39±5.13 92.32±10.15 87.59±2.36 67.60±10.66a

3.3 不同中藥抑制黑素細(xì)胞黑色素合成比較 黑色素含量測(cè)定結(jié)果顯示，與各單味中藥0 μg/mL 組比較，甘草500、1000 μg/mL 組，當(dāng)歸50、100、500、1000 μg/mL 組和赤芍100、500、1000 μg/mL 組黑色素含量明顯降低（P＜0.05）。見(jiàn)表3。

表3 不同中藥濃度對(duì)黑素細(xì)胞黑色素含量影響（%，±s）

表3 不同中藥濃度對(duì)黑素細(xì)胞黑色素含量影響（%，±s）

注：與0 μg/mL 比較，aP＜0.05

濃度0 μg/mL 50 μg/mL 100 μg/mL 500 μg/mL 1000 μg/mL孔數(shù)黑色素含量33333甘草100.00 93.89±2.55 90.85±1.33 70.67±6.79a 55.56±3.17a當(dāng)歸100.00 79.58±20.30a 66.79±4.60a 56.53±4.06a 54.69±4.05a赤芍100.00 99.63±9.29 84.70±5.56a 70.90±13.72a 61.80±12.89a

3.4 不同中藥對(duì)黑素細(xì)胞MITF、PI3K/AKT 信號(hào)通路相關(guān)分子水平的影響 MTT 檢測(cè)結(jié)果顯示，各單味中藥含量為500、1000 μg/mL 時(shí)細(xì)胞活力明顯受到抑制，1000 μg/mL 組細(xì)胞活力較500 μg/mL 組受限更為明顯，因此Western blot 檢測(cè)中各組中藥劑量設(shè)定為1000 μg/mL。結(jié)果顯示，與各單味中藥0 μg/mL組比較，1000 μg/mL+LY294002 組PI3K、AKT、GSK3β、MITF、p-PI3K、p-AKT、p-GSK3β 表達(dá)水平，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；1000 μg/mL 組PI3K、AKT、GSK3β 表達(dá)水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），MITF表達(dá)水平降低（P＜0.05），p-PI3K、p-AKT、p-GSK3β表達(dá)水平升高（P＜0.05）。見(jiàn)圖1、表4～6。

圖1 不同中藥處理黑素細(xì)胞Western blot 檢測(cè)結(jié)果

表4 不同劑量甘草對(duì)黑素細(xì)胞MITF、PI3K/AKT 信號(hào)通路相關(guān)分子水平的影響（±s）

表4 不同劑量甘草對(duì)黑素細(xì)胞MITF、PI3K/AKT 信號(hào)通路相關(guān)分子水平的影響（±s）

注：MITF 為小眼畸形相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子；PI3K 為磷脂酰肌醇3 激酶；p-PI3K 為磷酸化PI3K；AKT 為蛋白激酶B；p-AKT 為磷酸化AKT；GSK3β 為糖原合成酶激酶-3β；p-GSK3β 為磷酸化GSK3β；β-actin 為β-肌動(dòng)蛋白；與0 μg/mL 組比較，aP＜0.05

組別甘草0 μg/mL 組甘草1000 μg/mL 組甘草1000 μg/mL+LY294002 組孔數(shù)333 MITF 0.99±0.08 0.28±0.04a 0.93±0.05 p-PI3K/PI3K 0.61±0.07 1.08±0.07a 0.54±0.06 p-AKT/AKT 0.33±0.08 0.79±0.07a 0.29±0.08 p-GSK3β/GSK3β 0.41±0.06 0.78±0.06a 0.38±0.06

表5 不同劑量當(dāng)歸對(duì)黑素細(xì)胞MITF、PI3K/AKT 信號(hào)通路相關(guān)分子水平的影響（±s）

表5 不同劑量當(dāng)歸對(duì)黑素細(xì)胞MITF、PI3K/AKT 信號(hào)通路相關(guān)分子水平的影響（±s）

注：MITF 為小眼畸形相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子；PI3K 為磷脂酰肌醇3 激酶；p-PI3K 為磷酸化PI3K；AKT 為蛋白激酶B；p-AKT 為磷酸化AKT；GSK3β 為糖原合成酶激酶-3β；p-GSK3β 為磷酸化GSK3β；β-actin 為β-肌動(dòng)蛋白；與0 μg/mL 組比較，aP＜0.05

組別當(dāng)歸0 μg/mL 組當(dāng)歸1000 μg/mL 組當(dāng)歸1000 μg/mL+LY294002 組孔數(shù)333 MITF 1.14±0.08 0.28±0.04a 1.13±0.05 p-PI3K/PI3K 1.01±0.07 1.38±0.07a 0.94±0.06 p-AKT/AKT 0.83±0.08 1.27±0.05a 0.79±0.08 p-GSK3β/GSK3β 0.39±0.06 0.78±0.06a 0.35±0.05

表6 不同劑量赤芍對(duì)黑素細(xì)胞MITF、PI3K/AKT 信號(hào)通路相關(guān)分子水平的影響（±s）

表6 不同劑量赤芍對(duì)黑素細(xì)胞MITF、PI3K/AKT 信號(hào)通路相關(guān)分子水平的影響（±s）

注：MITF 為小眼畸形相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子；PI3K 為磷脂酰肌醇3 激酶；p-PI3K 為磷酸化PI3K；AKT 為蛋白激酶B；p-AKT 為磷酸化AKT；GSK3β 為糖原合成酶激酶-3β；p-GSK3β 為磷酸化GSK3β；β-actin 為β-肌動(dòng)蛋白；與0 μg/mL 組比較，aP＜0.05

組別赤芍0 μg/mL 組赤芍1000 μg/mL 組赤芍1000 μg/mL+LY294002 組孔數(shù)333 MITF 0.84±0.13 0.43±0.09a 0.80±0.12 p-PI3K/PI3K 0.41±0.07 0.83±0.12a 0.44±0.06 p-AKT/AKT 0.29±0.08 0.79±0.07a 0.33±0.08 p-GSK3β/GSK3β 0.31±0.06 0.82±0.04a 0.28±0.06

3.5 不同中藥對(duì)黃褐斑模型豚鼠皮膚外觀與黑色素含量的影響 直接觀察各組豚鼠皮膚外觀發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組比較，模型組背部皮膚色素沉著程度明顯增加，甘草組、當(dāng)歸組、赤芍組背部皮膚色素沉著程度較模型組有不同程度減輕，且未觀察到明顯的刺激和副作用。黑色素含量測(cè)定結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，模型組、甘草組、當(dāng)歸組、赤芍組背部皮膚黑色素含量升高（P＜0.05）；與模型組比較，甘草組、當(dāng)歸組、赤芍組背部皮膚黑色素含量降低（P＜0.05）。見(jiàn)表7、圖2。

圖2 不同中藥對(duì)黃褐斑模型豚鼠皮膚外觀與黑色素含量的影響

表7 各組豚鼠皮膚黑色素含量測(cè)定結(jié)果（%，±s）

表7 各組豚鼠皮膚黑色素含量測(cè)定結(jié)果（%，±s）

注：對(duì)照組背部皮膚暴露在普通光源中照射60 min，灌胃等體積生理鹽水；模型組背部皮膚暴露在中波紫外線（UVB）中照射60 min，灌胃等體積生理鹽水；甘草組背部皮膚暴露在UVB 中照射60 min，灌胃0.3 mg/kg 甘草藥液；當(dāng)歸組背部皮膚暴露在UVB 中照射60 min，灌胃0.3 mg/kg 當(dāng)歸藥液；赤芍組背部皮膚暴露在UVB 中照射60 min，灌胃0.3mg/kg 赤芍藥液；與對(duì)照組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05

組別對(duì)照組模型組甘草組當(dāng)歸組赤芍組鼠數(shù)66666黑色素含量100.00 3060.21±431.62a 1820.34±385.08ab 1181.43±347.24ab 2229.87±554.25ab

3.6 不同中藥對(duì)黃褐斑模型豚鼠皮膚組織學(xué)的影響

HE、Fontana-Masson 染色結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，模型組、甘草組、當(dāng)歸組、赤芍組皮膚組織結(jié)構(gòu)紊亂，黑色素沉積明顯增多；與模型組比較，甘草組、當(dāng)歸組、赤芍組皮膚組織結(jié)構(gòu)較為完整，黑色素沉積減少。見(jiàn)圖3。

圖3 不同中藥對(duì)黃褐斑模型豚鼠皮膚組織學(xué)的影響

3.7 不同中藥對(duì)黃褐斑模型豚鼠皮膚MITF、PI3K/AKT 信號(hào)通路相關(guān)分子水平的影響 Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，模型組PI3K、AKT、GSK3β 表達(dá)水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），MITF表達(dá)水平升高（P＜0.05），p-PI3K、p-AKT、p-GSK3β表達(dá)水平降低（P＜0.05）；與模型組比較，甘草組、當(dāng)歸組、赤芍組MITF 表達(dá)水平降低（P＜0.05），p-PI3K、p-AKT、p-GSK3β 表達(dá)水平升高（P＜0.05）。免疫組化檢測(cè)結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，模型組MITF 表達(dá)水平升高（P＜0.05），p-PI3K、p-AKT、p-GSK3β 表達(dá)水平降低（P＜0.05）；與模型組比較，甘草組、當(dāng)歸組、赤芍組MITF 表達(dá)水平降低（P＜0.05），p-PI3K、p-AKT、p-GSK3β 表達(dá)水平升高（P＜0.05）。見(jiàn)圖4～5 和表8～9。

圖4 各組豚鼠皮膚Western blot 檢測(cè)結(jié)果

圖5 各組豚鼠皮膚免疫組化檢測(cè)結(jié)果（×200，刻度尺：100 μm）

表8 各組豚鼠皮膚Western blot 檢測(cè)蛋白相對(duì)表達(dá)水平（±s）

表8 各組豚鼠皮膚Western blot 檢測(cè)蛋白相對(duì)表達(dá)水平（±s）

注：對(duì)照組背部皮膚暴露在普通光源中照射60 min，灌胃等體積生理鹽水；模型組背部皮膚暴露在中波紫外線（UVB）中照射60 min，灌胃等體積生理鹽水；甘草組背部皮膚暴露在UVB 中照射60 min，灌胃0.3 mg/kg 甘草藥液；當(dāng)歸組背部皮膚暴露在UVB 中照射60 min，灌胃0.3 mg/kg當(dāng)歸藥液；赤芍組背部皮膚暴露在UVB 中照射60 min，灌胃0.3 mg/kg 赤芍藥液；MITF 為小眼畸形相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子；PI3K 為磷脂酰肌醇3 激酶；p-PI3K 為磷酸化PI3K；AKT 為蛋白激酶B；p-AKT 為磷酸化AKT；GSK3β 為糖原合成酶激酶-3β；p-GSK3β 為磷酸化GSK3β；β-actin 為β-肌動(dòng)蛋白；與對(duì)照組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05

組別對(duì)照組模型組甘草組當(dāng)歸組赤芍組鼠數(shù)66666 MITF 0.41±0.07 1.47±0.18a 0.85±0.07ab 0.67±0.05ab 0.92±0.06ab p-PI3K/PI3K 0.59±0.06 0.15±0.03a 1.18±0.06ab 1.30±0.09ab 1.13±0.08ab p-AKT/AKT 0.82±0.06 0.25±0.04a 1.12±0.06ab 1.15±0.04ab 1.08±0.06ab p-GSK3β/GSK3β 0.79±0.07 0.23±0.05a 1.04±0.12ab 1.09±0.12ab 1.00±0.11ab

表9 各組豚鼠皮膚免疫組化檢測(cè)蛋白相對(duì)表達(dá)水平（±s）

表9 各組豚鼠皮膚免疫組化檢測(cè)蛋白相對(duì)表達(dá)水平（±s）

注：對(duì)照組背部皮膚暴露在普通光源中照射60 min，灌胃等體積生理鹽水；模型組背部皮膚暴露在中波紫外線（UVB）中照射60 min，灌胃等體積生理鹽水；甘草組背部皮膚暴露在UVB 中照射60 min，灌胃0.3 mg/kg 甘草藥液；當(dāng)歸組背部皮膚暴露在UVB 中照射60 min，灌胃0.3 mg/kg 當(dāng)歸藥液；赤芍組背部皮膚暴露在UVB 中照射60 min，灌胃0.3 mg/kg 赤芍藥液；MITF 為小眼畸形相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子；p-PI3K 為磷酸化磷脂酰肌醇3 激酶；p-AKT 為磷酸化蛋白激酶B；p-GSK3β 為磷酸化糖原合成酶激酶-3β；與對(duì)照組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05

組別對(duì)照組模型組甘草組當(dāng)歸組赤芍組鼠數(shù)66666 MITF 1.00±0.05 2.71±0.17a 1.79±0.15ab 1.51±0.13ab 1.94±0.12ab p-PI3K 1.00±0.05 0.64±0.06a 1.57±0.12ab 1.70±0.12ab 1.50±0.08ab p-AKT 1.00±0.05 0.73±0.09a 1.68±0.14ab 1.79±0.10ab 1.49±0.12ab p-GSK3β 1.00±0.05 0.56±0.09a 1.81±0.14ab 1.96±0.09ab 1.67±0.15ab

4 討 論

雖然黑色素能夠保護(hù)皮膚免受紫外線誘導(dǎo)細(xì)胞DNA 損傷，但過(guò)度的黑色素沉積可能會(huì)發(fā)展為皮膚疾病，外貌變化可進(jìn)一步對(duì)患者的情緒產(chǎn)生負(fù)面影響，進(jìn)而加重病情[9-10]。在中醫(yī)理論中，肝、脾、腎臟功能失調(diào)、氣血瘀滯是黃褐斑的主要病機(jī)，因此黃褐斑的治療多從調(diào)肝、補(bǔ)腎、健脾著手，活血化瘀，通絡(luò)益氣，標(biāo)本兼治[11]。單味中藥適應(yīng)證較復(fù)方更為明確，藥力單一，療效確切，制成提取物可提高藥物生物利用率，貯藏、運(yùn)輸、攜帶、服用也更為方便，臨床應(yīng)用廣泛，分析單味中藥對(duì)疾病的作用機(jī)制可豐富中藥治療的基礎(chǔ)理論，指導(dǎo)臨床合理用藥[12]。甘草具有抗氧化、抗腫瘤、抗炎、免疫調(diào)節(jié)等生物活性，其根莖常用于治療感冒、咳嗽、哮喘、呼吸道感染，主要生物活性成分為黃酮類化合物和三萜皂苷，其中一種黃酮類化合物異甘草素具有多種藥理活性，可通過(guò)激活細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶信號(hào)通路降解MITF，從而抑制黑色素生成[13-14]。當(dāng)歸最早記載于漢代《神農(nóng)本草經(jīng)》中，有活血、潤(rùn)腸、調(diào)經(jīng)、止痛之功效，含有多種揮發(fā)油、有機(jī)酸、多糖和黃酮類化合物，在治療黃褐斑外用或內(nèi)服方劑中皆為高頻用藥[7，15-16]。赤芍屬清熱涼血類藥材，具有清熱涼血、祛瘀止痛的功效，主要成分包括萜類化合物、多酚類化合物和揮發(fā)油，其中芍藥苷具有抗酪氨酸酶和抗黑色素生成活性[17-18]。在本研究中，甘草、當(dāng)歸、赤芍藥液均對(duì)黑素細(xì)胞活力、酪氨酸酶活性、黑色素合成水平具有不同程度的抑制效果，藥液濃度為1000 μg/mL 時(shí)均降低了MITF 的表達(dá)水平，并提高了PI3K/AKT 信號(hào)通路相關(guān)分子的磷酸化水平，而使用藥液處理的同時(shí)加入PI3K 抑制劑LY294002，黑素細(xì)胞活力、酪氨酸酶活性、黑色素合成水平及MITF 表達(dá)水平與對(duì)照組相近，推測(cè)甘草、當(dāng)歸、赤芍可能通過(guò)激活PI3K/AKT 信號(hào)通路實(shí)現(xiàn)對(duì)MITF 水平、黑素細(xì)胞功能的抑制。

常見(jiàn)的色素沉著疾病多與MITF 的過(guò)度表達(dá)有關(guān)[19]。PI3K/AKT 信號(hào)通路是調(diào)節(jié)MITF 轉(zhuǎn)錄活性的重要信號(hào)級(jí)聯(lián)之一，研究表明，激活PI3K/AKT 信號(hào)通路能夠抑制黑色素在小鼠黑素細(xì)胞和人類黑色素瘤Melan-A 細(xì)胞中的積累[20]。GSK-3β 是調(diào)節(jié)糖原合成和神經(jīng)元微管相關(guān)蛋白表達(dá)的激酶，在哺乳動(dòng)物真核細(xì)胞中普遍表達(dá)且高度保守，可直接調(diào)節(jié)MITF的轉(zhuǎn)錄水平，進(jìn)而影響MITF 介導(dǎo)的黑色素合成[21]，Pan 等[22]研究顯示，PI3K/AKT 信號(hào)通路的激活能夠提高GSK-3β 在Ser 9 位點(diǎn)的磷酸化，進(jìn)而下調(diào)MITF 表達(dá)。在本次研究中，UVB 照射后模型組豚鼠背部皮膚色素沉淀明顯，MITF 表達(dá)水平升高，PI3K/AKT 信號(hào)通路PI3K、AKT、GSK3β 磷酸化水平下降，而甘草、當(dāng)歸、赤芍組豚鼠背部皮膚色素含量降低，MITF 表達(dá)水平受到不同程度的抑制，PI3K、AKT、GSK3β 磷酸化水平均明顯提高，推測(cè)甘草、當(dāng)歸、赤芍通過(guò)上調(diào)PI3K/AKT 信號(hào)通路相關(guān)分子磷酸化水平抑制MITF 表達(dá)，緩解黃褐斑癥狀。

綜上所述，甘草、當(dāng)歸、赤芍可通過(guò)激活PI3K/AKT 信號(hào)通路，抑制MITF 表達(dá)，減少皮膚黑色素沉積，進(jìn)而緩解黃褐斑癥狀。但單味中藥藥物成分仍較復(fù)雜，還可能通過(guò)其他信號(hào)通路調(diào)節(jié)黑色素合成，仍需更加深入的研究驗(yàn)證。