毛蕾 蘭志勛 馬德祥 游霽月

(四川省醫(yī)學科學院 四川省人民醫(yī)院麻醉科,四川 成都 610072)

創(chuàng)傷性腦損傷是神經系統較為嚴重的疾病,是由外力引起創(chuàng)傷性結構損傷,常伴有頭皮損傷、顱骨骨折、腦脊漏液等〔1,2〕。該疾病主要表現為頭暈、惡心、記憶力障礙,嚴重可出現意識障礙,甚至導致死亡〔3,4〕。據流行病學調查顯示,隨著社會的發(fā)展、出行方式的轉變,創(chuàng)傷性腦損傷發(fā)生率升高趨勢更為顯著〔5〕。羅哌卡因是一種氨酰類局麻藥物,可抑制鈉離子通道,阻斷神經傳導與興奮〔6〕。本文分析羅哌卡因對創(chuàng)傷性腦損傷模型大鼠蛋白激酶B(AKT)/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)信號通路的影響,旨在探討羅哌卡因是否通過AKT/mTOR信號通路干預創(chuàng)傷性腦損傷的認知保護。

1 材料與方法

1.1材料 選取40只雄性大鼠(華蘭生物疫苗有限公司,使用許可證號:SYXK(豫)2017-0002,鼠齡3～5個月,平均年齡(4.0±0.8)個月;體質量258～279 g,平均(268.5±8.4)g。在相對濕度40%～65%、溫度(22.5±2.1)℃的環(huán)境中適應性喂養(yǎng)1 w。本研究嚴格按照動物實驗倫理要求操作,且通過醫(yī)院倫理委員會審批同意。主要試劑:小鼠抗兔白細胞介素(IL)-1β抗體(Invitrogen公司)、小鼠抗大鼠IL-6抗體(Hyclone公司)、兔抗大鼠腫瘤壞死因子(TNF)-α抗體(Selleck公司)、兔抗小鼠超氧化物歧化酶(SOD)抗體(BD公司)、大鼠抗小鼠丙二醛(MDA)抗體(Sigma公司)、大鼠抗兔AKT、mTOR抗體(Gibco公司)。

1.2建模及分組 隨機挑選10只大鼠為正常組,不做任何處理。其余30只建立創(chuàng)傷性腦損傷模型:大鼠禁食12 h,麻醉,固定于外傷模型裝備架,頭部去毛后消毒,切開頭皮,暴露顱骨,顱骨打磨器開直徑5 mm骨孔,使用撞擊器撞擊顱骨位置,撞擊參數:撞擊深度2 mm,速度4 m/s,撞擊時間120 ms,完成后將切口縫合,撞擊過程中3只大鼠死亡,最終27只大鼠建模成功,隨機分為腦損傷組13只,羅哌卡因組14只,建模完成后1 h羅哌卡因組尾靜脈注射羅哌卡因6 mg,正常組、腦損傷組不做處理。

1.3大鼠認知功能檢測 逃避潛伏期:各組進行水迷宮實驗,水迷宮為圓形水池,直徑110 cm、高60 cm、水深40 cm,水溫25 ℃,安全平臺隨機放置于任一象限中央位置,平臺直徑10 cm,水面高于平臺2 cm,大鼠訓練后隨機選擇入水點,觀察并記錄大鼠爬上平臺所需時間。60 s穿越平臺次數:各組連續(xù)訓練1 w后,撤除平臺,放入任一入水點,記錄60 s穿越平臺次數。

1.4腦含水量測定 造模完成后3 d處死大鼠,快速取腦組織,測量并記錄腦組織濕重,烘箱中烘干,迅速測量其干重,腦組織含水量:腦含水量(%)=(濕重-干重)/濕重×100%。

1.5HE染色 甲醛溶液固定腦組織24 h,石蠟包埋,流水沖洗,不同濃度酒精脫水,二甲苯透明,切片,厚度約6 μm,脫蠟,過氧化氫溶液孵育10 min,流水沖洗,蘇木素染色5 min,氨水分色5 s,流水沖洗,70%、90%酒精各脫水10 min,伊紅染色3 min,純酒精脫水,二甲苯透明,樹膠封片,顯微鏡(上海巴拓儀器有限公司,型號:BMM-580DIC)下觀察。

1.6酶聯免疫吸附試驗檢測炎癥因子、氧化應激水平 各組麻醉后,腹主動脈取血,3 000 r/min離心15 min,離心半徑10 cm,分離血清-20 ℃保存。稀釋待測血清,每孔加稀釋后的待測血清200 μl,37 ℃靜置2 h,磷酸鹽緩沖液(PBS)浸泡,洗滌,甩干,每孔加稀釋含抗原的被檢標本,37 ℃靜置1 h,洗滌,每孔加底物液,室溫靜置30 min,每孔加終止液,酶標儀(上?？迫A生物工程有限公司,型號:ST-360)測定IL-1β、TNF-α、IL-6、SOD、MDA水平。

1.7Western印跡法檢測AKT/mTOR通路蛋白表達 細胞裂解液將樣品裂解,測定樣品蛋白濃度,加適量濃縮十二烷基硫酸鈉(SDS)-聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE),水浴4 min,充分變性蛋白,冷卻,電泳,轉模,漂洗,加封閉液,室溫封閉60 min,加一抗,4 ℃孵育1 h,回收一抗,洗滌,加二抗,4 ℃孵育1 h,回收二抗,洗滌,超敏電化學發(fā)光(ECL)液(廣州進德生物科技有限公司)檢測AKT、mTOR蛋白表達。

1.8統計學處理 采用SPSS26.0軟件行F、t檢驗。

2 結 果

2.1各組大腦皮層組織病理學觀察 正常組大腦皮層組織細胞排列規(guī)則有序、細胞結構清晰完整,細胞間無水腫現象;腦損傷組組織疏松、細胞排列不規(guī)則,細胞間水腫、炎癥浸潤明顯;羅哌卡因組細胞排列較規(guī)則,結構較清晰完整,細胞間水腫、炎癥浸潤明顯改善。見圖1。

圖1 各組大腦皮層組織病理學(HE,×100)

2.2各組腦含水量比較 與正常組比較,腦損傷組、羅哌卡因組腦含水量顯著增加(P<0.05);與腦損傷組比較,羅哌卡因組腦含水量顯著減少(P<0.05)。見表1。

表1 各組腦含水量、逃避潛伏期、穿越平臺次數、炎癥因子水平、氧化應激水平比較

2.3各組認知功能比較 與正常組比較,腦損傷組、羅哌卡因組逃避潛伏期時間較長,穿越平臺次數較少,差異有統計學意義(P<0.05);與腦損傷組比較,羅哌卡因組逃避潛伏期時間較短,穿越平臺次數較多,差異有統計學意義(P<0.05)。見表1。

2.4各組炎癥因子水平比較 與正常組比較,腦損傷組、羅哌卡因組IL-1β、TNF-α、IL-6水平較高;與腦損傷組比較,羅哌卡因組上述指標水平較低,差異有統計學意義(P<0.05)。見表1。

2.5各組氧化應激水平對比 與正常組比較,腦損傷組、羅哌卡因組SOD水平較低,MDA水平較高;與腦損傷組比較,羅哌卡因組SOD水平較高,MDA水平較低,差異有統計學意義(P<0.05)。見表1。

2.6各組AKT/mTOR通路蛋白相對表達量對比 與正常組比較,腦損傷組、羅哌卡因組AKT、mTOR表達較低;與腦損傷組比較,羅哌卡因組AKT、mTOR表達較高,差異有統計學意義(P<0.05)。見表2、圖2。

表2 各組AKT/mTOR通路蛋白相對表達量對比

圖2 3組AKT、mTOR通路蛋白表達

3 討 論

創(chuàng)傷性腦損傷根據發(fā)病類型分為原發(fā)性、繼發(fā)性腦損傷,原發(fā)性損傷一系列反應可引起嚴重繼發(fā)性反應,導致腦水腫、顱內壓升高、腦組織灌注不足,神經細胞死亡、神經功能損害〔7,8〕。該疾病的發(fā)生機制主要與初期炎癥反應相關,特點是可激活免疫活性,釋放炎性介質〔9,10〕。有研究顯示,全球意外傷害中創(chuàng)傷性腦損傷的死亡和傷殘率居首位,給經濟和社會帶來較大負擔,因此,了解疾病病理、尋找治療方法有重要價值〔11〕。

腦含水量是判定腦損傷修復的指標,創(chuàng)傷性腦損傷大鼠模型腦部含水量越低,表明腦組織修復狀況越好〔12〕。逃避潛伏期時間、穿越平臺次數用于評價大鼠認知功能改善,大鼠承逃避潛伏期時間越短、穿越平臺次數越多,說明認知功能恢復情況越好〔13〕。本研究表明,羅哌卡因能有效改善腦損傷大鼠認知功能,改善腦含水量,從而減輕腦組織損傷。

羅哌卡因是一種新型純左旋長效局麻藥,具有麻醉、鎮(zhèn)痛雙重效應〔14〕。有研究表示,羅哌卡因可調節(jié)創(chuàng)傷性腦損傷大鼠IL-1β、TNF-α等炎癥因子水平,羅哌卡因可抑制TNF-α、IL等分泌,有研究證明IL-1β、TNF-α可介導內毒素損傷效應,放大炎癥過程,加重腦水腫,IL-1β、TNF-α水平下降,可減少腦組織損傷,從而促進對腦組織的修復〔15〕。據相關研究顯示,羅哌卡因可調控SOD、MDA等氧化應激因子水平,改善機體抗氧化能力,從而保護腦組織細胞,促進腦部功能修復〔16〕。本研究結果顯示,經羅哌卡因處理后,創(chuàng)傷性腦損傷大鼠炎癥因子水平下降,抗氧化功能提升,從而減輕腦組織創(chuàng)傷,進而抑制腦組織進一步損傷,促進創(chuàng)傷性腦損傷的修復。

AKT/mTOR信號通路是一種重要的信號轉導途徑,可影響轉錄蛋白的合成,在細胞生長、增殖、血管形成中發(fā)揮重要生物學功能〔17〕。AKT是PI3K重要的下游分子,可調控細胞的生長、存活、增殖;mTOR是一類高度保守的絲/蘇氨酸激酶,在離子轉運、細胞存活、蛋白細胞骨架形成中有重要作用〔18,19〕。相關研究顯示,使用羅哌卡因干預的創(chuàng)傷性腦損傷大鼠,其AKT、mTOR等蛋白表達降低,可能是羅哌卡因能抑制AKT/mTOR信號通路活性,促進腦組織細胞的增殖、發(fā)育,從而促進創(chuàng)傷性腦損傷大鼠的腦組織修復〔20,21〕。本研究結果認為,AKT/mTOR信號通路與羅哌卡因修復創(chuàng)傷性腦損傷大鼠的腦組織相關,經羅哌卡因干預后由AKT/mTOR介導的信號通路被抑制,AKT/mTOR信號通路可能抑制AKT、mTOR等通路蛋白活性,有效阻止腦細胞的程序性凋亡,從而保護腦組織細胞。