黃燕 楊艷清 萬(wàn)睿 周進(jìn)飛 胡夢(mèng)

(1武漢市第三醫(yī)院整形外科,湖北 武漢 430060;2襄陽(yáng)市伊萊美醫(yī)療美容門診部)

人皮膚成纖維(HDF)細(xì)胞是皮膚的主要細(xì)胞類型,主要負(fù)責(zé)細(xì)胞外基質(zhì)的沉積和重塑,為皮膚提供結(jié)構(gòu)的完整性和彈性〔1〕。皮膚的氧化損傷是皮膚老化的主要原因之一,而氧化損傷則是由于過(guò)多的活性氧積累引起的〔2〕。另有文獻(xiàn)報(bào)道,細(xì)胞老化與細(xì)胞自噬密切相關(guān),自噬水平的降低可加速細(xì)胞老化,自噬水平的升高可以延緩細(xì)胞老化〔3〕。因此,從分子水平探究氧化應(yīng)激誘導(dǎo)下HDF細(xì)胞自噬及老化的內(nèi)部機(jī)制,對(duì)于延緩皮膚衰老具有重要的意義。MicroRNA(miRNA)是一類公認(rèn)的轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)劑,屬于非編碼RNA家族,已通過(guò)靶向其自身的mRNAs被鑒定為調(diào)節(jié)細(xì)胞過(guò)程(如自噬、老化)的關(guān)鍵參與者〔4〕。研究表明,miR-181-5p參與調(diào)節(jié)細(xì)胞自噬,且是細(xì)胞老化的標(biāo)志分子〔5〕。而10號(hào)染色體上缺失的磷酸酶及張力蛋白同源基因(PTEN)/蛋白激酶B(AKT)/哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)通路作為參與細(xì)胞自噬的主要通路之一,可調(diào)控糖尿病大鼠腎組織中自噬水平的變化〔6〕。然而,miR-181-5p及PTEN/AKT/mTOR通路對(duì)氧化應(yīng)激誘導(dǎo)下HDF細(xì)胞自噬及老化的影響尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究探討miR-181-5p對(duì)氧化應(yīng)激誘導(dǎo)下HDF細(xì)胞自噬及老化的影響及其內(nèi)部分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1細(xì)胞來(lái)源 HDF細(xì)胞(貨號(hào):CE19179)購(gòu)于北京科瑞思搏生物科技有限公司。

1.2主要試劑與儀器 miR-181-5p模擬物(miR-181-5p mimics)及其陰性對(duì)照(miR-NC)、miR-181-5p抑制物(anti-miR-181-5p)及其陰性對(duì)照(anti-miR-NC)均購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher公司;DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS)均購(gòu)自TaKaRa公司;CCK-8試劑盒、細(xì)胞衰老檢測(cè)試劑盒〔β-半乳糖苷酶(SA-β-gal)染色〕均購(gòu)自美國(guó)Cell Biolabs公司;二喹啉甲酸(BCA)試劑盒、Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染試劑盒均購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司;通用反轉(zhuǎn)錄試劑盒(MMLV)、SYBR Green qPCR Master Mix、雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒均購(gòu)自美國(guó)Promega公司;PTEN、AKT、p-AKT、mTOR、p-mTOR、自噬相關(guān)蛋白(Beclin)-1、微管相關(guān)蛋白輕鏈(LC)3Ⅱ/Ⅰ兔單克隆抗體、GAPDH兔多克隆抗體(anti-PTEN、anti-AKT、anti-p-AKT、anti-mTOR、anti-p-mTOR、anti-Beclin-1、anti-LC3Ⅱ/Ⅰ、anti-GAPDH)、辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG二抗(羊抗兔IgG-HRP二抗)均購(gòu)自美國(guó)Abcam公司;熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR)儀、CO2培養(yǎng)箱均購(gòu)自德國(guó)Leica公司。

1.3細(xì)胞培養(yǎng)及細(xì)胞老化模型的構(gòu)建 將HDF細(xì)胞置于含有10%FBS和100 U/ml青霉素/鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中,并在含有5%CO2,37 ℃培養(yǎng)箱中進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)。參照文獻(xiàn)〔7〕,進(jìn)行細(xì)胞老化模型的構(gòu)建。簡(jiǎn)言之,取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HDF細(xì)胞,調(diào)整細(xì)胞濃度為6×103個(gè)/ml接種于96孔板中,于5%CO2,37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。隨后分別用含0、100、200、500 μmol/L H2O2的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)HDF細(xì)胞24 h,最后通過(guò)細(xì)胞存活率確定構(gòu)建細(xì)胞老化模型的適宜H2O2濃度,并將該濃度H2O2處理的HDF細(xì)胞命名為H2O2模型細(xì)胞。

1.4CCK-8法檢測(cè)HDF細(xì)胞存活率 分別收集處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的各組HDF細(xì)胞接種至96孔板(5×103個(gè)/孔)中,加入10 μl CCK-8溶液于每個(gè)孔中,37 ℃孵育3 h,采用全自動(dòng)酶標(biāo)儀測(cè)定各組細(xì)胞在450 nm波長(zhǎng)處的吸光值(OD值)。細(xì)胞存活率(%)=(實(shí)驗(yàn)組OD值-空白對(duì)照組OD值)/(正常對(duì)照組OD值-空白對(duì)照組OD值)×100%。

1.5細(xì)胞轉(zhuǎn)染 使用Lipofectamine2000試劑盒進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染,細(xì)胞分組為:空白組(細(xì)胞未轉(zhuǎn)染)、miR-181-5p mimics組(細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-181-5p mimics)、miR-NC組(細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-NC)、anti-miR-181-5p 組(細(xì)胞轉(zhuǎn)染anti-miR-181-5p)、anti-miR-NC組(細(xì)胞轉(zhuǎn)染anti-miR-NC),然后使用含適宜H2O2濃度(200 μmol/L)的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)各轉(zhuǎn)染組細(xì)胞24 h。

1.6qRT-PCR檢測(cè)HDF細(xì)胞中miR-181-5p表達(dá)水平 用Trizol試劑分別提取各組HDF細(xì)胞總RNA,使用MMLV逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將1 μg RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA,利用SYBR Green qPCR Master Mix對(duì)miR-181-5p表達(dá)水平進(jìn)行定量。以U6為內(nèi)參,采用2-ΔΔCt計(jì)算基因相對(duì)表達(dá)水平。所用引物序列為:U6正向:5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′,反向:5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′;miR-181-5p正向:5′-ACACTCCAGCTGGGAACATTCAACGCTGTC-GG-3′;反向:5′-TGGTGTCGTGGAGTCG-3′。

1.7Western印跡檢測(cè)蛋白表達(dá)水平 從細(xì)胞沉淀物中提取的蛋白質(zhì)上樣到12%的十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)上,然后轉(zhuǎn)移到聚偏氟乙烯(PVDF)膜上,在5%脫脂牛奶中封閉1h后,首先將膜與一抗(anti-PTEN、anti-AKT、anti-p-AKT、anti-mTOR、anti-p-mTOR、anti-Beclin-1、anti-LC3Ⅱ/Ⅰ、anti-GAPDH)在4 ℃下孵育過(guò)夜,然后加入羊抗兔IgG-HRP二抗(1∶5 000)于室溫孵育2 h。使用電化學(xué)發(fā)光(ECL)試劑可視化蛋白質(zhì),使用ImageJ軟件對(duì)灰度值進(jìn)行量化分析。

1.8雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)驗(yàn)證miR-181-5p與PTEN靶向關(guān)系 使用Starbase網(wǎng)站預(yù)測(cè)miR-181-5p與PTEN的結(jié)合位點(diǎn)。分別構(gòu)建PTEN的野生型(WT)和突變型(MUT)3'-UTR區(qū)質(zhì)粒,標(biāo)記為WT-PTEN、MUT-PTEN。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HDF細(xì)胞,按照Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染試劑盒說(shuō)明書將WT-PTEN、MUT-PTEN分別與miR-NC或miR-181-5p mimics共轉(zhuǎn)染,轉(zhuǎn)染48 h后,通過(guò)雙熒光素酶測(cè)定系統(tǒng)分析熒光素酶相對(duì)活性。

1.9SA-β-gal活性測(cè)定 SA-β-gal活性上調(diào)是細(xì)胞老化的特征之一。按照SA-β-gal試劑盒檢測(cè)各組細(xì)胞SA-β-gal的表達(dá),老化細(xì)胞經(jīng)SA-β-gal染色后會(huì)變成藍(lán)色,在光學(xué)顯微鏡下計(jì)數(shù)藍(lán)色細(xì)胞及總細(xì)胞數(shù)目,可計(jì)算SA-β-gal細(xì)胞的染色率。

1.10統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS25.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)、單因素方差分析、SNK-q檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1細(xì)胞老化模型的構(gòu)建 隨著H2O2濃度(0、100、200、500 μmol/L)的升高,HDF細(xì)胞存活率〔(99.96±9.96)%、(70.24±7.54)%、(51.64±5.11)%、(25.43±2.03)%〕逐漸降低,且當(dāng)H2O2濃度低于200 μmol/L,細(xì)胞存活率高于50%,H2O2濃度高于500 μmol/L時(shí),HDF細(xì)胞大量死亡。其中H2O2濃度為200 μmol/L時(shí),細(xì)胞存活率為51.64%。因此,選擇200 μmol/L H2O2作為模型的老化濃度,并將該濃度處理的HDF細(xì)胞記為H2O2模型細(xì)胞。

2.2HDF細(xì)胞中miR-181-5p及PTEN/AKT/mTOR通路相關(guān)蛋白表達(dá) 與HDF細(xì)胞相比,H2O2模型細(xì)胞中miR-181-5p及p-AKT、p-mTOR蛋白表達(dá)明顯上調(diào),PTEN蛋白表達(dá)明顯下調(diào)(P<0.05)。見(jiàn)表1、圖1。

1,2:HDF細(xì)胞、H2O2模型細(xì)胞圖1 Western印跡檢測(cè)HDF細(xì)胞中PTEN/AKT/mTOR 通路相關(guān)蛋白表達(dá)

表1 HDF細(xì)胞中miR-181-5p及PTEN/AKT/mTOR通路相關(guān)蛋白表達(dá)

2.3miR-181-5p靶向調(diào)控PTEN的表達(dá) Starbase網(wǎng)站預(yù)測(cè)PTEN與miR-181-5p存在結(jié)合位點(diǎn)見(jiàn)圖2。雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)結(jié)果表明,與miR-NC+WT-PTEN組(1.23±0.07)比較,miR-181-5p mimics+WT-PTEN組的熒光素酶相對(duì)活性(0.39±0.02)顯著降低(P<0.05),而miR-181-5p mimics+MUT-PTEN組(1.21±0.10)與miR-NC+MUT-PTEN組熒光素酶相對(duì)活性(1.22±0.09)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

圖2 miR-181-5p與PTEN結(jié)合位點(diǎn)

2.4各轉(zhuǎn)染組細(xì)胞中miR-181-5p及PTEN/AKT/mTOR通路相關(guān)蛋白表達(dá)水平 miR-181-5p mimics組中miR-181-5p表達(dá)水平顯著高于空白組和miR-NC組(P<0.05),而anti-miR-181-5p組中miR-181-5p表達(dá)水平顯著低于空白組和anti-miR-NC組(P<0.05),證明細(xì)胞轉(zhuǎn)染成功。與空白組和miR-NC組比較,miR-181-5p mimics組中PTEN蛋白表達(dá)明顯下調(diào),p-AKT、p-mTOR蛋白表達(dá)明顯上調(diào)(P<0.05);與空白組和anti-miR-NC組比較,anti-miR-181-5p組中PTEN蛋白表達(dá)明顯上調(diào),p-AKT、p-mTOR蛋白表達(dá)明顯下調(diào)(P<0.05)。見(jiàn)圖3、表2。

1～5:空白組、miR-NC組、miR-181-5p組、anti-miR-NC組、anti-miR-181-5p組;圖4同圖3 Western印跡檢測(cè)各組PTEN/AKT/mTOR通路相關(guān)蛋白表達(dá)

表2 各組細(xì)胞中miR-181-5p、PTEN/AKT/mTOR通路相關(guān)蛋白表達(dá)及Beclin-1、LC3Ⅱ/Ⅰ蛋白表達(dá)比較

2.5miR-181-5p對(duì)各組細(xì)胞中Beclin-1、LC3Ⅱ/Ⅰ蛋白表達(dá)的影響 miR-181-5p mimics組中Beclin-1、LC3Ⅱ/Ⅰ蛋白表達(dá)顯著低于空白組和miR-NC組(P<0.05);而anti-miR-181-5p組中Beclin-1、LC3Ⅱ/Ⅰ蛋白表達(dá)顯著高于空白組和anti-miR-NC組(P<0.05)。見(jiàn)表2、圖4。

圖4 各組Beclin-1及LC3Ⅱ/Ⅰ蛋白表達(dá)

2.6miR-181-5p對(duì)各組細(xì)胞形態(tài)及SA-β-gal活性的影響 空白組、miR-NC組、anti-miR-NC組細(xì)胞排列不規(guī)則,細(xì)胞變大,輪廓不清楚,折光性差,符合老化細(xì)胞的特征。miR-181-5p mimics組中的細(xì)胞狀態(tài)與上述類似,且比例高于空白組和miR-NC組;而anti-miR-181-5p組中大部分細(xì)胞呈長(zhǎng)梭形,輪廓清晰,折光性好。見(jiàn)圖5。與空白組〔(70.59±2.33)%〕和miR-NC組〔(72.09±2.09)%〕比較,miR-181-5p mimics組SA-β-gal染色率〔(95.56±6.36)%〕顯著升高,而anti-miR-181-5p組SA-β-gal染色率〔(23.16±1.28)%〕顯著低于空白組和anti-miR-NC組〔(71.83±2.55)%;P<0.05〕。

3 討 論

在皮膚老化過(guò)程中,會(huì)出現(xiàn)皮膚變薄,皺紋增多,彈性變小等現(xiàn)象〔8〕。過(guò)度的氧化應(yīng)激會(huì)破壞DNA和蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu),導(dǎo)致生物膜和細(xì)胞核的損傷,而細(xì)胞老化可以看作是氧化應(yīng)激誘導(dǎo)損傷累積的過(guò)程〔9〕。miRNA廣泛參與生物體多種生理過(guò)程,包括自噬、老化。據(jù)報(bào)道,miRNA在調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖能力和復(fù)制性老化之間的平衡中起著至關(guān)重要的作用;一些miRNA的表達(dá)與壽命直接相關(guān),miRNA的表達(dá)可以作為年齡,壽命和過(guò)早老化的預(yù)測(cè)因子〔10〕;miR-146a的表達(dá)水平與視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞的衰老呈正相關(guān)〔11〕;miR-663的表達(dá)水平隨年齡逐漸升高,且在老年組中的升高比率最大;miR-130a可通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡與自噬進(jìn)而調(diào)控腦衰老進(jìn)程;miR-181-5p在皮膚衰老的成纖維細(xì)胞中高表達(dá)〔12〕,這與本研究結(jié)果一致。本研究結(jié)果提示,過(guò)表達(dá)miR-181-5p在細(xì)胞老化過(guò)程中發(fā)揮著抑制自噬、促進(jìn)細(xì)胞老化的作用,而抑制miR-181-5p具有相反作用。

為了進(jìn)一步探究miR-181-5p在細(xì)胞老化過(guò)程中發(fā)揮著抑制自噬、促進(jìn)老化的內(nèi)部分子機(jī)制。本研究通過(guò)雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)證實(shí)PTEN為miR-181-5p的靶基因。已有研究表明,PTEN可負(fù)調(diào)控AKT/mTOR來(lái)調(diào)節(jié)自噬,PTEN/AKT/mTOR通路是參與自噬的主要信號(hào)通路之一〔13〕;在結(jié)直腸癌中,自噬標(biāo)志蛋白LC3的表達(dá)與mTOR的表達(dá)呈負(fù)相關(guān),mTOR的失活誘導(dǎo)了自噬的激活;非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞自噬水平升高,而參與自噬調(diào)控的AKT/mTOR通路活性降低〔14〕。本研究結(jié)果提示,miR-181-5p可能通過(guò)靶向調(diào)控PTEN表達(dá),進(jìn)而調(diào)控AKT/mTOR通路及HDF細(xì)胞自噬,影響細(xì)胞老化。

綜上,抑制miR-181-5p可能通過(guò)靶向上調(diào)PTEN蛋白表達(dá),抑制AKT/mTOR通路,促進(jìn)自噬,進(jìn)而延緩H2O2誘導(dǎo)的HDF細(xì)胞老化。