楊衛(wèi)振 侯偉 張磊 李小龍 翟建

(保定市第一中心醫(yī)院 1普外科,河北 保定 071000;2放療科;3中國人民解放軍陸軍第八十二集團(tuán)軍醫(yī)院消化內(nèi)科)

胃癌是常見的消化道惡性腫瘤之一,由于腫瘤細(xì)胞具有高度侵襲性導(dǎo)致術(shù)后患者復(fù)發(fā)率高,且患者遠(yuǎn)期生存率較低,目前胃癌的發(fā)病機制尚未闡明,已有報道證實環(huán)狀RNA(circRNA)在胃癌中表達(dá)異常,并可能作為胃癌分子、靶向治療的潛在靶點,circNRIP1、circ-HuR、circNHSL1、circRNA_001569在胃癌中表達(dá)上調(diào)/下調(diào),并可吸附微小RNA(miRNA)充當(dāng)其海綿分子,進(jìn)而調(diào)控靶mRNA表達(dá),參與胃癌等腫瘤發(fā)生及發(fā)展過程〔1～4〕。circCEP128在膠質(zhì)瘤細(xì)胞中表達(dá)水平升高,敲低circCEP128可通過調(diào)節(jié)miR-145-5p抑制膠質(zhì)瘤的發(fā)展〔5〕。靶基因預(yù)測顯示circCEP128與miR-4458存在結(jié)合位點,研究表明miR-4458可靶向抑制非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞遷移〔6〕。因此,本研究主要探討circCEP128與miR-4458在胃癌中的表達(dá)及其在胃癌AGS細(xì)胞惡性生長中的作用。

1 材料與方法

1.1一般資料 在保定市第一中心醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)下,2018年6月至2019年12月納入醫(yī)院病理確診為胃癌的33例患者。所有患者知情且簽署同意書,其中男20例,女13例,年齡53～67歲,平均年齡(58.69±9.16)歲,患者術(shù)前均無放化療等治療史,未合并其他惡性腫瘤,且臨床資料完整。將手術(shù)獲得的癌組織及相匹配的癌旁組織標(biāo)本置于-80 ℃保存。

1.2細(xì)胞、試劑與儀器 胃癌細(xì)胞AGS(美國ATCC);DMEM培養(yǎng)液、Opti-MEM減血清培養(yǎng)基(美國Gibco公司);胎牛血清、Lipofectamine2000、膜聯(lián)蛋白Ⅴ異硫氰酸熒光素(Annexin V-FITC)/碘化丙啶(PI)雙染法細(xì)胞凋亡檢測試劑盒、Matrigel基質(zhì)膠(北京索萊寶科技有限公司);Transwell小室(美國Corning公司);si-NC、si-circCEP128、miR-NC、miR-4458 mimics、anti-miR-NC、anti-miR-4458(上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司);pcDNA、Trizol試劑(美國Invitrogen公司);逆轉(zhuǎn)錄與SYBR熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)試劑(北京天根生化科技公司);細(xì)胞對數(shù)試劑盒(CCK)-8試劑(上海奧默生物技術(shù)有限公司);兔抗人Ki-67、B細(xì)胞淋巴瘤(Bcl)-2、基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)-2、MMP-9、Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bax)抗體(美國CST公司)。

1.3實驗分組 采用Opti-MEM減血清培養(yǎng)基分別與si-NC、si-circCEP128、miR-NC、miR-4458 mimics、pcDNA、pcDNA-circCEP128、si-circCEP128+anti-miR-NC、si-circCEP128+anti-miR-4458混合后室溫孵育5 min(A液),Opti-MEM減血清培養(yǎng)基與Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染試劑充分混合(B液),A液與B液充分混勻后室溫孵育20 min,將其加入AGS細(xì)胞后6 h,將轉(zhuǎn)染液替換為DMEM新鮮培養(yǎng)液,繼續(xù)培養(yǎng)48 h,分別記為si-NC組、si-circCEP128組、miR-NC組、miR-4458組、si-circCEP128+anti-miR-NC組、si-circCEP128+anti-miR-4458組。

1.4實時熒光定量(qRT)-PCR檢測circCEP128、miR-4458表達(dá)水平 胃癌組織、癌旁組織與各組AGS細(xì)胞總RNA采用Trizol法提取,將RNA應(yīng)用紫外分光光度計進(jìn)行濃度測定后將其置于-80 ℃超低溫冰箱內(nèi)保存。配制反轉(zhuǎn)錄體系(20 μl):5×gDNA緩沖液2 μl,10×King RT緩沖液2 μl,FastKing RT Enzyme Mix 1 μl,FQ-RT Primer Mix 2 μl,RNA(2 μg),最后RNase-Free ddH2O補足。qRT-PCR在StepOnePlus實時熒光定量PCR儀進(jìn)行,并設(shè)置循環(huán)條件為:1次循環(huán),95 ℃預(yù)變性5 min;40次循環(huán),95 ℃變性15 s,60 ℃退火60 s,72 ℃延伸30 s。采用2-ΔΔCt法計算circCEP128〔相對于磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)〕、miR-4458(相對于U6)的相對表達(dá)量。

1.5CCK-8實驗檢測細(xì)胞增殖 在96孔板每孔接種1×103個各組AGS細(xì)胞,96孔板中加入10 μl CCK-8溶液,繼續(xù)培養(yǎng)2 h后應(yīng)用酶標(biāo)儀Multiskan Sky檢測各孔吸光度(OD)值(450 nm)。

1.6流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡率 Annexin Ⅴ-FITC/PI雙染法細(xì)胞凋亡檢測試劑盒用于檢測各組AGS細(xì)胞凋亡。各組AGS細(xì)胞在黑暗環(huán)境中用5 μl Annexin V-FITC、5 μl PI充分混合10 min,在FACS Canto流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞凋亡率。

1.7Transwell實驗檢測細(xì)胞遷移與侵襲 收集各組AGS細(xì)胞(1×105個/ml)加入小室的上室(200 μl/孔),下室加入600 μl含10%胎牛血清的培養(yǎng)液,培養(yǎng)24 h,穿模細(xì)胞固定、染色10 min,于顯微鏡下觀察并統(tǒng)計遷移細(xì)胞數(shù)(個)。小室的上室加入稀釋后的基質(zhì)膠(40 μl/孔),后續(xù)操作同遷移檢測。

1.8雙熒光素酶報告基因檢測circCEP128與miR-4458的靶向關(guān)系 將含有結(jié)合位點片段克隆至pmirGLO載體得到野生型(WT)載體WT-circCEP128,將miR-4458結(jié)合序列進(jìn)行突變,并克隆至pmirGLO載體獲得突變型(MUT)載體MUT-circCEP128,在AGS細(xì)胞中分別共轉(zhuǎn)染上述載體與miR-NC或miR-4458 mimics,在熒光素酶檢測系統(tǒng)中測量轉(zhuǎn)染24 h的熒光素酶活性。

1.9Western印跡檢測Ki-67、Bcl-2、MMP-2、MMP-9、Bax蛋白表達(dá) 各組AGS細(xì)胞通過RIPA裂解液抽提總蛋白,將蛋白用二喹啉甲酸(BCA)試劑盒進(jìn)行定量。通過10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)將50 μg蛋白電泳、轉(zhuǎn)膜,隨后封閉膜。向膜中加入一抗稀釋液(1∶1 000)后4 ℃孵育12 h,加入辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記山羊抗兔IgG二抗稀釋液(1∶50 000)后室溫培養(yǎng)1 h,ImageJ軟件用于分析各條帶光度,計算目標(biāo)蛋白值與內(nèi)參與GAPDH的比值。

1.10統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS21.0軟件進(jìn)行獨立樣本t檢驗、單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1胃癌組織中circCEP128和miR-4458表達(dá)比較 癌旁組織circCEP128表達(dá)水平顯著低于胃癌組織,miR-4458表達(dá)水平顯著高于胃癌組織(P<0.001),見表1。

表1 circCEP128和miR-4458在胃癌組織中表達(dá)比較

2.2抑制circCEP128表達(dá)對胃癌AGS細(xì)胞增殖的影響 與si-NC組比較,si-circ-CEP128組細(xì)胞活力及Ki-67蛋白水平顯著降低(P<0.001),見圖1、表2。

圖1 Western印跡檢測兩組Ki-67蛋白表達(dá)

表2 抑制circCEP128表達(dá)對胃癌AGS細(xì)胞增殖、凋亡的影響

2.3抑制circCEP128表達(dá)對胃癌AGS細(xì)胞凋亡的影響 與si-NC組比較,si-circCEP128組細(xì)胞凋亡率、Bax蛋白顯著升高,Bcl-2蛋白水平顯著降低(P<0.001),見表2、圖2、圖3。

圖2 抑制circCEP128表達(dá)對胃癌AGS細(xì)胞凋亡、遷移及侵襲相關(guān)蛋白的影響

圖3 抑制circCEP128表達(dá)的胃癌AGS細(xì)胞凋亡

2.4抑制circCEP128表達(dá)對胃癌AGS細(xì)胞遷移和侵襲的影響 與si-NC組比較,si-circCEP128組遷移及侵襲細(xì)胞數(shù)顯著減少,MMP-2、MMP-9蛋白水平也顯著降低(P<0.001),見表3、圖4。

圖4 抑制circCEP128表達(dá)影響胃癌AGS細(xì)胞遷移和侵襲(結(jié)晶紫染色,×200)

表3 抑制circCEP128表達(dá)的胃癌AGS細(xì)胞遷移和侵襲

2.5circCEP128靶向調(diào)控miR-4458表達(dá) StarBase預(yù)測見圖5,結(jié)果顯示circCEP128與miR-4458存在互補序列。胃癌AGS細(xì)胞轉(zhuǎn)染W(wǎng)T-circCEP128的熒光素酶活性在miR-4458過表達(dá)時顯著低于對照miR-NC組(P<0.001),見表4。表明circCEP128可靶向結(jié)合miR-4458。qRT-PCR實驗結(jié)果顯示,pcDNA組miR-4458表達(dá)水平(1.00±0.06)顯著高于pcDNA-circCEP128(0.45±0.04,P<0.05);si-NC組miR-4458表達(dá)水平(0.99±0.05)顯著低于si-circCEP128組(3.15±0.21,P<0.05)。circCEP128可負(fù)向調(diào)控miR-4458表達(dá)。

圖5 circCEP128與miR-4458互補的核苷酸序列

表4 circCEP128與miR-4458的雙熒光素酶報告實驗

2.6miR-4458過表達(dá)的胃癌AGS細(xì)胞的增殖、凋亡、遷移和侵襲 與miR-NC組比較,miR-4458組細(xì)胞活力、Ki-67、Bcl-2、MMP-2、MMP-9蛋白水平顯著降低,細(xì)胞凋亡率顯著升高,遷移及侵襲細(xì)胞數(shù)顯著減少,Bax蛋白水平顯著升高(均P<0.001),見圖6、圖7、圖8、表5。

圖6 miR-4458過表達(dá)的胃癌細(xì)胞凋亡

圖7 miR-4458過表達(dá)影響胃癌AGS細(xì)胞凋亡、遷移和侵襲(結(jié)晶紫染色,×200)

圖8 Western印跡檢測各組增殖、凋亡、遷移侵襲相關(guān)蛋白表達(dá)

表5 miR-4458過表達(dá)對胃癌AGS細(xì)胞增殖、凋亡、遷移和侵襲及相關(guān)蛋白的影響

2.7circCEP128通過miR-4458調(diào)節(jié)胃癌AGS細(xì)胞增殖、凋亡、遷移和侵襲 與si-circCEP128+anti-miR-NC組比較,si-circCEP128+anti-miR-4458組細(xì)胞活力顯著升高,細(xì)胞凋亡率顯著降低,遷移及侵襲細(xì)胞數(shù)、Ki-67、Bcl-2、MMP-2、MMP-9蛋白水平明顯升高,Bax蛋白水平顯著降低(均P<0.001),見表6、圖8、圖9、圖10。

圖9 干擾miR-4458表達(dá)逆轉(zhuǎn)了抑制circCEP128表達(dá)對胃癌AGS細(xì)胞凋亡

圖10 干擾miR-4458表達(dá)逆轉(zhuǎn)了抑制circCEP128表達(dá)對胃癌AGS細(xì)胞遷移和侵襲(結(jié)晶紫染色,×200)

表6 干擾miR-4458表達(dá)及抑制circCEP128表達(dá)的胃癌AGS細(xì)胞增殖、凋亡、遷移和侵襲及相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

3 討 論

circRNA具有組織特異性與結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性,其基因序列是由3'端與5'端以共價鍵結(jié)合形成的閉合環(huán)狀分子,其基因序列上含有多個miRNA結(jié)合位點,并可發(fā)揮海綿分子的作用而參與腫瘤發(fā)生及發(fā)展過程,既往研究證實circRNA在胃癌中可發(fā)揮癌基因或抑癌基因作用,circ-SFMBT2通過充當(dāng)miR-182-5p的海綿分子以促進(jìn)環(huán)腺苷酸反應(yīng)元件結(jié)合蛋白(CREB)1表達(dá)而促進(jìn)胃癌細(xì)胞的增殖〔7〕。circRNA蛋白激酶B(AKT)3通過miR-198抑制上調(diào)磷酸肌醇-3-激酶調(diào)節(jié)亞基(PI3K)R1而增強胃癌的順鉑耐藥性〔8〕。胃癌中circ_006100的表達(dá)水平升高,并可通過miR-195/GPRC5A信號傳導(dǎo)促進(jìn)細(xì)胞生長和轉(zhuǎn)移〔9〕。circPDSS1通過充當(dāng)miR-186-5p的海綿分子并調(diào)節(jié)永離有絲分裂基因A相關(guān)激酶(NEK)2而促進(jìn)胃癌的進(jìn)展〔10〕。circRNA_LARP4通過充當(dāng)miR-424-5p的海綿分子并調(diào)節(jié)腫瘤抑制激酶(LATS)1表達(dá)而抑制胃癌細(xì)胞的增殖和侵襲〔11〕。

circCEP128在膀胱癌中表達(dá)水平升高,并可調(diào)節(jié)miR-145-5p/髓樣分化因子(MyD)88及絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號通路而促進(jìn)膀胱癌的進(jìn)展〔12〕。研究表明Ki-67表達(dá)水平高低可反映細(xì)胞增殖能力的強弱〔13〕。本研究結(jié)果提示,胃癌細(xì)胞中circCEP128可增加細(xì)胞增殖。本研究結(jié)果還顯示,抑制circCEP128表達(dá)可明顯提高胃癌細(xì)胞凋亡率,并上調(diào)Bax而下調(diào)Bcl-2表達(dá),其中Bcl-2和Bax分別起抗凋亡和促凋亡作用〔14〕,這些提示抑制circCEP128表達(dá)可促進(jìn)胃癌細(xì)胞凋亡。腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力與細(xì)胞外基質(zhì)沉積有關(guān),MMPs家族成員MMP-2和MMP-9能夠促進(jìn)細(xì)胞轉(zhuǎn)移〔15〕。另外,本研究表明,circCEP128可增強胃癌細(xì)胞的遷移及侵襲能力。

本研究證實circCEP128靶向負(fù)調(diào)控miR-4458的表達(dá)。研究表明miR-4458可抑制乳腺癌細(xì)胞的生長、遷移〔16〕。miR-4458通過直接靶向己糖激酶2而抑制糖酵解和乳酸的產(chǎn)生從而抑制結(jié)腸癌的發(fā)展〔17〕。LncRNA HEIH通過miR-4458/細(xì)胞因子信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制蛋白(SOCS)1軸調(diào)節(jié)三陰性乳腺癌細(xì)胞增殖和凋亡〔18〕。miR-4458通過直接靶向Lin28B抑制肺癌細(xì)胞的增殖〔19〕。circRNA PRMT5通過miR-4458/REV3編碼DNA聚合酶催化亞基(REV3L)軸增強非小細(xì)胞肺癌順鉑耐藥性〔20〕。本研究結(jié)果顯示,miR-4458過表達(dá)抑制胃癌細(xì)胞增殖、遷移及侵襲,并使細(xì)胞凋亡增加,而抑制circCEP128表達(dá)對胃癌細(xì)胞增殖、凋亡、遷移及侵襲的不利影響被干擾miR-4458表達(dá)所明顯逆轉(zhuǎn)。

綜上,抑制circCEP128表達(dá)通過靶向miR-4458抑制胃癌細(xì)胞增殖、遷移及侵襲,并誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞凋亡,circCEP128可能作為胃癌治療的潛在靶標(biāo)。下一步將進(jìn)行體內(nèi)實驗驗證circCEP128/miR-4458分子軸在胃癌發(fā)生過程中的作用機制。