周磊 宋圣佑 邰倫偉 蔣俊玲 王蒙蒙 潘世杰 趙俊峰

(河南中醫(yī)藥大學(xué) 1第二臨床醫(yī)學(xué)院,河南 鄭州 450002;2第二附屬醫(yī)院)

腎細(xì)胞癌(RCC)簡稱腎癌,起源于腎小管上皮細(xì)胞,占所有癌癥的2%～3%〔1〕。有研究表明,RCC的發(fā)生發(fā)展與Th1/Th2免疫平衡有很大關(guān)系〔2～4〕。另有研究表明,中藥千金子的許多相關(guān)提取物可以抑制肺癌〔5〕、肝癌〔6〕、宮頸癌〔7〕、白血病〔8〕等腫瘤的進(jìn)展;本課題組前期研究發(fā)現(xiàn),千金子二萜醇可抑制RCC細(xì)胞的增殖、轉(zhuǎn)移和侵襲,并通過體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證實(shí)其可減緩腫瘤進(jìn)展、通過調(diào)控核因子(NF)-κB活性抑制基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)表達(dá)和通過調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)-β1/Smad通路活化影響腫瘤壞死因子(TNF)-α和白細(xì)胞介素(IL)-17表達(dá)〔9～11〕。但其是否具有調(diào)節(jié)腎細(xì)胞癌Th1/Th2免疫平衡的作用仍不清楚。本研究旨在分析千金子二萜醇調(diào)控TGF-β/Smad4信號(hào)通路調(diào)節(jié)腎癌小鼠Th1/Th2免疫平衡及其可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1試劑 千金子二萜醇(WKQ-0000424,四川維克奇生物科技有限公司);RPMI1640、胎牛血清(FBS)、0.25%胰酶-乙二胺四乙酸(EDTA)和Phosphate Buffered Saline(以色列BI公司);青-鏈霉素混合液(索萊寶公司)、無血清凍存液(C40100,新賽美);高效RIPA裂解液(組織/細(xì)胞)(R0010,索萊寶公司)和ECL顯影液(索萊寶公司);PEG-300和LY2109761(Med Chem Express公司);二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量試劑盒(碧云天生物技術(shù)有限公司);蛋白電泳凝膠制備試劑盒Ⅱ型(PE008-2,陜西中暉赫彩生物醫(yī)藥科技有限公司);TGF-βR Ⅱ Polyclonal antibody(27212-1-AP,武漢三鷹有限公司);SMAD4 Polyclonal antibody(51069-2-AP,武漢三鷹有限公司);Beta Actin Polyclonal antibody(20536-1-AP,武漢三鷹有限公司);HRP-conjugated Affinipure Goat Anti-Rabbit IgG(H+L)(SA00001-2,武漢三鷹有限公司);三色預(yù)染蛋白Marker(WJ103,上海雅酶生物醫(yī)藥科技有限公司)IFN-γ Mouse Uncoated ELISA Kit(EK280/3-96,聯(lián)科生物科技有限公司);鼠IL-4 High Sensitivity ELISA Kit(EK204HS-96,聯(lián)科生物科技有限公司);柱式動(dòng)物組織總RNA抽提純化試劑盒(B518651-0100,生工生物工程(上海)股份有限公司);PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser (Perfect Real Time)試劑盒(RR047A,寶日醫(yī)生物技術(shù)(北京)有限公司);TB Green Premix Ex TaqTM Ⅱ (Tli RNaseH Plus)(RR820A,寶日醫(yī)生物技術(shù)(北京)有限公司);

1.2細(xì)胞及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 腎癌細(xì)胞(北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)有限公司);6～8 周齡雄性SPF級(jí)BALB/c小鼠(北京斯貝福生物技術(shù)有限公司),體質(zhì)量18～22 g,于25 ℃、12 h光照/12 h黑暗實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心常規(guī)飼養(yǎng),正常飲食飲水。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)經(jīng)河南省中醫(yī)院(河南中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.3腎癌細(xì)胞培養(yǎng) 將完全培養(yǎng)基中的腎癌細(xì)胞恒溫培養(yǎng)對(duì)數(shù)生長期,胰蛋白酶消化,離心,進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)并制備1×107個(gè)/ml細(xì)胞懸液用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.4小鼠分組、腎癌模型構(gòu)建及給藥 取雄性SPF級(jí)BALB/c小鼠18只,隨機(jī)分為模型組(腎癌組)、實(shí)驗(yàn)組(模型+千金子二萜醇組)和TGF-β/Smad通路抑制劑組(模型+LY2109761組),每組6只。3組小鼠腋窩(右前肢)皮下組織注射0.2 ml細(xì)胞懸液。造模過程在SPF級(jí)小鼠飼養(yǎng)室環(huán)境中飼養(yǎng),自由飲水進(jìn)食。待瘤塊體積大于5 mm后,實(shí)驗(yàn)組給予25 mg/kg千金子二萜醇溶液灌胃,1次/d;通路抑制劑組給予25 mg/kg LY2109761溶液灌胃,每3 d 1次。給藥21 d結(jié)束后(實(shí)驗(yàn)組給藥21次;通路抑制劑組給藥7次),腹腔注射4%水合氯醛麻醉小鼠,眼科彎頭鑷摘除小鼠眼球后取血,離心后取上清,置于超低溫冰箱冷凍保存,剝離小鼠皮下移植瘤塊并置于液氮中冷凍保存,分離各組小鼠完整的脾臟置于液氮中冷凍保存。

1.5瘤塊體積增長率計(jì)算 灌胃期間測量小鼠第3天和第21天瘤塊的長徑L(mm)、短徑W(mm)。腫瘤體積(mm3)=π/6×L×W2,瘤塊增長率=(第21天腫瘤體積-第3天腫瘤體積)/第3天腫瘤體積×100%,并進(jìn)行分析。

1.6Western印跡檢測小鼠脾臟組織蛋白表達(dá) 取米粒大小的小鼠脾臟組織放入蛋白裂解液中提取總蛋白,采用BCA法定量蛋白濃度。將蛋白液轉(zhuǎn)移至十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE),依次進(jìn)行分離、轉(zhuǎn)膜、取膜和清洗,隨后加入一抗、二抗孵育,最后采用ECL顯色法顯影并檢測蛋白質(zhì)條帶,以β-actin為內(nèi)參,分析條帶灰度值,檢測TGF-βR Ⅱ和smad4蛋白含量。

1.7ELISA檢測IL-4和IFN-γ水平 從超低溫冰箱取出小鼠血清,將ELISA試劑盒及實(shí)驗(yàn)物品平衡至室溫,采用ELISA檢測血清IL-4和IFN-γ水平,嚴(yán)格按照試劑盒操作說明書進(jìn)行。

1.8RT-qPCR檢測各個(gè)蛋白的mRNA 根據(jù)柱式動(dòng)物組織總RNA抽提純化試劑盒操作步驟提取小鼠脾臟組織的mRNA,根據(jù)PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser (Perfect Real Time)試劑盒將所提取的mRNA逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。用TB Green Premix Ex Taq Ⅱ (Tli RNaseH Plus)試劑盒進(jìn)行目的基因TGF-βR Ⅱ、Samd4、IL-4、IFN-γ mRNA(以β-Actin為內(nèi)參)的qPCR擴(kuò)增,引物序列為:β-actin mRNA正義:5′-CTACCTCATGAAGATCCTGACC-3′,反義:5′-CACAGCTTCTCTTTGATGTCAC-3′;TGF-βR Ⅱ mRNA正義:5′-GACCTCAAGAGCTCTAACATCC-3′,反義:5′-GTCATCCACAGACAGAGTAGG-3′;Smad4 mRNA正義:5′-AGTTCACAATGAGCTTGCATTC-3′,反義:5′-TTCAAAGTAAGCAATGGAGCAC-3′;IFN-γ mRNA正義:5′-CTTGAAAGACAATCAGGCCATC-3′,反義:5′-CTTGGCAATACTCATGAATGCA-3′;IL-4 mRNA正義:5′-TACCAGGAGCCATATCCACGGATG-3′,反義:5′-TGTGGTGTTCTTCGTTGCTGTGAG-3′。以上引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。根據(jù)2-△△Ct進(jìn)行TGF-βR Ⅱ、Samd4、IL-4、IFN-γ mRNA表達(dá)的相對(duì)定量分析。

1.9統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 使用Graphpad Prism9.5軟件進(jìn)行單因素方差(非參數(shù)檢驗(yàn))分析。

2 結(jié) 果

2.1各組腫瘤體積增長率比較 與模型組比較,實(shí)驗(yàn)組和LY2109761組腫瘤體積增長率均顯著降低(P<0.05),見表1。

表1 各組腎癌小鼠腫瘤體積增長率,血清IFN-α、IL-4,脾臟組織TGF-βRⅡ、Samd4蛋白表達(dá)比較

2.2各組血清IFN-γ和IL-4水平比較 與模型組比,實(shí)驗(yàn)組IFN-γ顯著升高,IL-4水平顯著降低(P<0.05),見表1。

2.3各組脾臟組織TGF-βR Ⅱ、Samd4蛋白表達(dá)比較 與模型組比較,實(shí)驗(yàn)組和LY2109761組TGF-βR Ⅱ、Samd4和蛋白水平均顯著降低(P<0.05),見表1、圖1。

圖1 各組脾臟組織TGF-βR Ⅱ、Samd4蛋白表達(dá)水平

2.4各組脾臟組織TGF-βR Ⅱ、Samd4、IL-4、IFN-γ mRNA表達(dá)比較 與模型組相比,實(shí)驗(yàn)組TGF-βR Ⅱ、Smad4 mRNA表達(dá)顯著降低(P<0.05,P<0.01); LY2109761組TGF-βR Ⅱ mRNA表達(dá)水平顯著升高(P<0.01);與模型組相比,實(shí)驗(yàn)組IFN-γ mRNA表達(dá)水平顯著升高(P<0.05), IL-4 mRNA表達(dá)水平顯著降低(P<0.01),見表2。

表2 各組脾臟組織TGF-βR Ⅱ、Samd4、IL-4、IFN-γ mRNA的表達(dá)水平

3 討 論

20%～30%的腎癌患者在診斷早期發(fā)生轉(zhuǎn)移,5年存活率極低〔12〕。許多傳統(tǒng)中草藥能穩(wěn)定腫瘤生長,對(duì)改善腎癌的防治有重要臨床意義。研究報(bào)道,某些中藥和相關(guān)活性化合物具有有效的抗癌特性〔13〕,千金子二萜醇是傳統(tǒng)中草藥千金子Semen euphorbiae lathyridis中的主要抗癌單體。已有研究表明,千金子二萜醇通過調(diào)控上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化過程顯著抑制非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的體外增殖、遷移和侵襲能力〔5〕,通過調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡、增殖分化、轉(zhuǎn)錄、細(xì)胞周期等多種途徑來治療白血病〔8〕。本課題組前期研究也發(fā)現(xiàn)千金子二萜醇可以通過誘導(dǎo)腎癌細(xì)胞凋亡及阻斷其在細(xì)胞生長周期的G0/G1期來抑制腎癌細(xì)胞的增殖〔9,14〕。

癌癥的發(fā)展通常伴隨著Th1/Th2免疫失衡發(fā)生〔15〕。Th1向Th2漂移是惡性腫瘤的特有現(xiàn)象,Th2型細(xì)胞因子的優(yōu)勢狀態(tài)將導(dǎo)致機(jī)體抗腫瘤免疫功能減弱,保護(hù)腫瘤細(xì)胞逃逸免疫監(jiān)視和免疫攻擊,這可能是腎癌發(fā)生發(fā)展的免疫機(jī)制之一〔16〕。 Th1細(xì)胞介導(dǎo)、參與細(xì)胞免疫和局部炎癥反應(yīng),其分泌的INF-γ具有多種免疫調(diào)節(jié)作用,可以抑制腫瘤細(xì)胞生長〔17〕,Th2細(xì)胞產(chǎn)生IL-4、IL-5、IL-6和IL-10,介導(dǎo)體液免疫,并與超敏反應(yīng)的發(fā)生密切相關(guān)〔17〕,可通過抑制IL-12、IFN-γ的產(chǎn)生,防止NK細(xì)胞活化,減少腫瘤細(xì)胞抗原表達(dá)等方式抑制細(xì)胞免疫的抗腫瘤效應(yīng)。本研究結(jié)果說明千金子二萜醇觸發(fā)了Th1/Th2失衡,并將Th1/Th2免疫平衡向Th1轉(zhuǎn)移。

TGF-β/Smad4是細(xì)胞內(nèi)重要的信號(hào)通路,參與調(diào)控多種重要的生物學(xué)過程,在多種腫瘤中均發(fā)揮重要作用。在TGF-β信號(hào)傳導(dǎo)的第一步中,TGF-β配體與Ⅱ型受體(TGF-βR Ⅱ)和Ⅰ型受體(TGF-βR Ⅰ)的異聚體復(fù)合物結(jié)合,3種異構(gòu)體均以同源二聚體的形式結(jié)合到TGF-βR Ⅱ上,TGF-βR Ⅱ磷酸化并激活TGF-βR Ⅰ。激活的TGF-βR Ⅱ依次磷酸化并激活受體激活的Smads(R-Smads)、Smad2和Smad3。Smad7與R-Smads競爭與TGF-βR Ⅰ的相互作用,從而阻止R-Smad激活和信號(hào)的正確傳播?；罨腞-Smads與TGF-βR Ⅰ分離,與共同的介體Smad4形成復(fù)合物。三聚體復(fù)合物易位到細(xì)胞核,在細(xì)胞核里與高親和力DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子和染色質(zhì)重塑蛋白結(jié)合,促進(jìn)或抑制靶基因的轉(zhuǎn)錄〔18〕。LY2109761是一種新型的選擇性TGF-βR Ⅰ/Ⅱ 型抑制劑,能選擇性通過抑制TGF-βR Ⅰ和TGF-βR Ⅱ的結(jié)合發(fā)揮作用〔19〕。本研究結(jié)果說明LY2109761抑制TGF-βR Ⅱ可能在翻譯水平,LY2109761組Smad4蛋白水平表達(dá)降低,可能是由于膜受體蛋白TGF-βR Ⅱ表達(dá)量降低,阻止了信號(hào)從膜外向膜內(nèi)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo),導(dǎo)致Smad2/3和Smad4蛋白表達(dá)量降低,同時(shí)抑制型Smad7表達(dá)量上升,進(jìn)一步抑制了信號(hào)向核內(nèi)的傳遞,從而有效抑制了TGF-β1/Smads信號(hào)通路〔20〕。說明千金子二萜醇調(diào)節(jié)腎癌小鼠Th1/Th2免疫平衡的機(jī)制可能與TGF-β/Smad4信號(hào)通路有關(guān)。

綜上,腎癌會(huì)引起IFN-γ降低和IL-4升高,從而影響機(jī)體免疫反應(yīng)誘發(fā)免疫抑制,而千金子二萜醇可以影響Th1/Th2的免疫平衡,將Th1/Th2免疫平衡向Th1轉(zhuǎn)移,促進(jìn)IFN-γ的分泌和抑制IL-4的分泌,解除免疫抑制,進(jìn)而影響腎癌進(jìn)展,其機(jī)制可能與TGF-β/Smad4信號(hào)通路有關(guān)。