張紅娟 陳巖松 黎暉 劉慧

(福建醫(yī)科大學(xué)附屬南平第一醫(yī)院 1皮膚科,福建 南平 353000;2病理科)

皮膚鱗狀細(xì)胞癌發(fā)病率位居皮膚惡性腫瘤的第2位,僅次于皮膚基底細(xì)胞癌,但轉(zhuǎn)移率和死亡率明顯偏高,男性多發(fā)于女性,主要發(fā)生于中老年人群,以60～79歲為發(fā)病高峰,多數(shù)患者同時伴發(fā)著色性干皮病〔1〕。皮膚鱗狀細(xì)胞癌的發(fā)生與進(jìn)展是一個多基因共同參與的過程,探尋相關(guān)調(diào)控分子,對提高臨床診治水平具有重要意義〔2〕。微小RNA(miRNA)是一類小分子非編碼RNA,能夠在轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)控基因表達(dá),參與惡性腫瘤的發(fā)展〔3〕。近年來研究發(fā)現(xiàn),miR-155在甲狀腺癌、乳腺癌、肺癌等多種惡性腫瘤中高表達(dá)〔4〕,但在人皮膚鱗狀細(xì)胞癌中作用的研究仍十分少見。本研究旨在探討miR-155在皮膚鱗狀細(xì)胞癌中的表達(dá)特點及作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1研究對象 選取2020年3月至2021年7月福建醫(yī)科大學(xué)附屬南平第一醫(yī)院收治的老年皮膚鱗狀細(xì)胞癌患者42例。入選標(biāo)準(zhǔn):年齡≥60歲,均通過手術(shù)切除并經(jīng)病理檢查確診為皮膚鱗狀細(xì)胞癌。排除術(shù)前有放療、化療等抗腫瘤治療史。其中男25例,女17例;年齡61～78歲,平均(67.05±5.92)歲;分化程度:高分化20例,中分化12例,低分化10例;淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況:轉(zhuǎn)移17例,未轉(zhuǎn)移25例。另收集20例正常皮膚組織為對照,男12例,女8例;年齡60～76歲,平均(65.97±6.40)歲。兩組一般資料差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),具有可比性。本研究受試者自愿簽署知情同意書。

1.2材料與主要試劑 人皮膚鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞系SCL-1購于上海弘順生物有限公司。Trizol試劑盒、cDNA第一鏈合成試劑盒均購于上海聯(lián)邁生物有限公司;DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清購于武漢普諾賽科技有限公司;脂質(zhì)體2000購于上海研拓生物有限公司;鼠抗人細(xì)胞周期蛋白(Cyclin)D1單克隆抗體、鼠抗人細(xì)胞增殖因子(Ki-67)單克隆抗體、兔抗人半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(Caspase)-3單克隆抗體及相應(yīng)的二抗均購于賽業(yè)生物科技有限公司。

1.3實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR)檢測組織標(biāo)本中miR-155表達(dá)水平 采集兩組清晨空腹靜脈血,Trizol試劑盒提取血清總RNA,紫外分光光度計檢測濃度,逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA。miR-155和內(nèi)參U6的引物序列由上海生工生物有限公司設(shè)計合成,miR-155正向引物:5′-CGGCTGGAGCCTGGCACCTG-3′,反向:5′-AGTCG GGCGACGATGTCGCTC-3′。U6正向引物:5′-GTGGGTCTTGTCGTTGACTT-3′,反向:5′-GAGGAAAGGTCGGTTGGC-3′。反應(yīng)體系共20 μl,其中總RNA 2 μl、dT18 1 μl、正向和反向引物各1 μl、dNTP 1 μl、雙蒸餾水14 μl。反應(yīng)設(shè)定條件:94 ℃預(yù)變性5 min,95 ℃變性30 s,60 ℃復(fù)性30 s,共40個循環(huán),72 ℃延伸30 s。2-ΔΔCt計算miR-155表達(dá)水平。

1.4miR-155靶點預(yù)測 使用microRNA.org、miRMap、miRwalk 3個數(shù)據(jù)庫預(yù)測miR-155靶基因,采用韋恩分析法篩選出3個數(shù)據(jù)庫共同預(yù)測的miR-155靶基因〔5〕。KEGG富集分析miR-155靶基因的信號通路富集情況,通過基因功能注釋和查閱相關(guān)文獻(xiàn)〔5,6〕推測靶基因的潛在功能,確定miR-155的下游靶點。

1.5人皮膚鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞系SCL-1培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染 使用含胎牛血清的DMEM完全培養(yǎng)基培養(yǎng)人皮膚鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞系SCL-1,置于37 ℃ 5%CO2培養(yǎng)箱中孵育,待細(xì)胞生長至90%融合時進(jìn)行傳代。取對數(shù)生長期細(xì)胞接種于24孔板中,分為對照組(常規(guī)培養(yǎng))、miR-155抑制陰性對照組(轉(zhuǎn)染miR-155 inhibitor control)、miR-155抑制組(轉(zhuǎn)染miR-155 inhibitor)、miR-155激動陰性對照組(轉(zhuǎn)染 miR-155 mimics control)、miR-155激動組(轉(zhuǎn)染 miR-155 mimics),轉(zhuǎn)染基因的設(shè)計合成由蘇州吉瑪基因有限公司完成,使用脂質(zhì)體2000轉(zhuǎn)入人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞。

1.6各組蛋白酪氨酸磷酸酶基因(PTEN)、蛋白激酶B(AKT)及AKT下游潛在基因表達(dá)檢測 轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)48 h,qRT-PCR檢測各組人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞中PTEN、AKT、叉頭框蛋白(FOX)O1、結(jié)節(jié)硬化征(TSC)1、TSC2、糖原合酶激酶(GSK)3β、RAF1表達(dá)水平。引物序列由上海生工生物有限公司設(shè)計合成,PTEN正向引物:5′-AAGTGATGAGGCCACGAGA-3′,反向:5′-TGGTGTACCGCAAGGTCGT-3′;AKT正向引物:5′-TCGTGGTAGAGAAG GTCC-3′,反向:5′-CAGGACGACCGTTCTTACGA-3′;FOXO1正向引物:5′-TCGTGGTAGAGAAGGTCC-3′,反向:5′-CAGGACGACCGTTCTTAC-3′;TSC1正向引物:5′-AGTC-GTCATTGGTGTCAGTTG-3′,反向:5′-GTTGCCCGG-ACCAATGTTC-3′;TSC2正向引物:5′-TGATCGAATA-TGTATTAAGG-3′,反向:5′-TGGAGCCTGGGAC-GTGATC-3′;GSK3β正向引物:5′-GAAATAGAGCCGAGAACGCGT-3′,反向:5′-CACCTTGTCGACTCGGCACTT-3′;RAF1正向引物:5′-CTCCTCTCAATG-AACCAGCAAGT-3′,反向:5′-GATTTACTCGGACGC-TTTCGATGA-3′;內(nèi)參GAPDH正向引物:5′-ACGGTACCTTAACGGTACCCACC-3′,反向:5′-CCACCTGGACTGGACGGCAGATG-3′。反應(yīng)體系和反應(yīng)條件同1.3。

1.7Western印跡檢測CyclinD1、Ki-67、Caspase-3蛋白表達(dá)水平 取對照組、miR-155抑制組、miR-155激動組培養(yǎng)基誘導(dǎo)培養(yǎng)21 d的人皮膚鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞系SCL-1,RIPA細(xì)胞裂解液提取細(xì)胞總蛋白,二喹啉甲酸(BCA)試劑盒測定蛋白濃度,行10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE),電轉(zhuǎn)法將目標(biāo)蛋白轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜,室溫下封閉40 min,滴加鼠抗人CyclinD1單克隆抗體、鼠抗人Ki-67單克隆抗體,均為1∶500稀釋;兔抗人Caspase-3單克隆抗體,1∶800稀釋;鼠抗人GAPDH單克隆抗體,1∶2 000稀釋;4 ℃孵培育過夜,滴加相應(yīng)的二抗,1∶2 000稀釋,電化學(xué)發(fā)光(ECL)顯影,使用ImageJ軟件讀取灰度值。

1.8統(tǒng)計學(xué)分析 使用SPSS25.0統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行方差分析和t檢驗。

2 結(jié) 果

2.1不同組織中miR-155表達(dá)水平比較 皮膚鱗狀細(xì)胞癌組織中miR-155表達(dá)水平(4.08±0.51)高于正常皮膚組織(1.16±0.24),差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=19.425,P=0.000)。

2.2miR-155的潛在靶點預(yù)測 miRNA靶基因預(yù)測數(shù)據(jù)庫預(yù)測出靶基因21個,分別為Anxa7、Mapk6、Rap1a、Rab18、Scn1b、lgf2r、Sgk1、Rnf167、Kcnk2、Dmr1、Sv2a、PTEN、Ppara、Snx27、Tnfrsf12a、Ptk2b、Cltc、Cast、Stc25a20、Trak2、Btg1;對這些靶基因進(jìn)行KEGG富集分析顯示,上述靶基因富集中于GnRH通路、趨化因子通路、cAMP通路等。通過基因功能注釋和查閱相關(guān)文獻(xiàn)推測PTEN基因可能是miR-155的潛在靶點。

2.3miR-155表達(dá)對PTEN及AKT/GSK3β通路表達(dá)的影響 對照組、miR-155抑制陰性對照組、miR-155激動陰性對照組PTEN、AKT、GSK3β差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05);miR-155抑制組PTEN水平明顯低于miR-155抑制陰性對照組和對照組,AKT、GSK3β水平明顯高于miR-155抑制陰性對照組和對照組(P<0.01);miR-155激動組PTEN水平明顯高于miR-155激動陰性對照組和對照組,AKT、GSK3β水平明顯低于miR-155激動陰性對照組和對照組(P<0.01)。見表1。

表1 各組PTEN、AKT及AKT下游潛在基因表達(dá)水平比較

2.4miR-155對皮膚鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞中CyclinD1、Ki-67、Caspase-3表達(dá)的影響 皮膚鱗狀細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)第21天,miR-155抑制組CyclinD1、Ki-67蛋白表達(dá)水平明顯低于對照組,Caspase-3蛋白表達(dá)水平明顯高于對照組(P<0.01);miR-155激動組CyclinD1、Ki-67蛋白表達(dá)水平明顯高于對照組,Caspase-3蛋白表達(dá)水平明顯低于對照組(P<0.01)。見圖1、表2。

圖1 Western印跡檢測各組皮膚鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞中CyclinD1、Ki-67、Caspase-3蛋白表達(dá)

表2 各組皮膚鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞中CyclinD1、Ki-67、Caspase-3蛋白表達(dá)水平比較

3 討 論

皮膚是人體與外界環(huán)境的主要屏障,能夠保護(hù)機(jī)體免受環(huán)境中有害因素的影響,包括致癌化學(xué)物質(zhì)、乳頭狀瘤病毒、放射線等〔6〕。當(dāng)長期暴露于上述有害因素時,會增加皮膚鱗狀細(xì)胞癌的發(fā)生風(fēng)險。miRNAs在人體不同病變組織中表達(dá)存在差異且發(fā)揮調(diào)控作用〔7〕;近年來研究發(fā)現(xiàn),miRNAs轉(zhuǎn)錄后靶向作用上皮組織中角質(zhì)形成的相關(guān)基因,參與調(diào)控表皮上皮細(xì)胞的增生、分化、凋亡等過程〔8〕。與正常皮膚相比,鱗狀細(xì)胞癌中miR-21表達(dá)水平明顯提升,且miR-21原癌基因靶向作用于PTEN、GRHL3基因,激活PI3K/AKT信號傳導(dǎo)通路,誘導(dǎo)皮膚鱗狀細(xì)胞癌〔9〕。miR-206通過負(fù)調(diào)控絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶基因,抑制皮膚鱗狀細(xì)胞癌皮下腫瘤的生長〔10〕。不同miRNAs在不同類型的惡性腫瘤中表達(dá)存在差異,即使同一個miRNA在不同惡性腫瘤中表達(dá)也可能不相同。如miR-365在原發(fā)性乳腺癌和皮膚鱗狀細(xì)胞癌中高表達(dá),而在原發(fā)性肝癌、非小細(xì)胞肺癌中低表達(dá)〔11〕。

miR-155是近年來研究發(fā)現(xiàn)的一種miRNA,在乳腺癌、結(jié)直腸癌、肺癌、宮頸癌等多種惡性腫瘤中高表達(dá),參與調(diào)控腫瘤細(xì)胞的增殖、分化、轉(zhuǎn)移及凋亡過程〔12,13〕;但在皮膚鱗狀細(xì)胞癌中作用的研究仍十分少見。本研究結(jié)果提示miR-155表達(dá)水平可能與皮膚鱗狀細(xì)胞癌的發(fā)生、發(fā)展呈正相關(guān)。但miR-155是否直接參與調(diào)控皮膚鱗狀細(xì)胞癌目前仍未明確。另外,本研究結(jié)果提示miR-155對皮膚鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞的調(diào)控是通過影響PTEN/AKT/GSK3β表達(dá)來實現(xiàn)。PTEN是AKT信號通路上的靶目標(biāo)基因,PTEN高表達(dá)會抑制AKT基因活性,AKT下游基因GSK3β表達(dá)也隨之降低,加速皮膚鱗狀細(xì)胞癌病情發(fā)展。

CyclinD1是高度保守的細(xì)胞周期家族成員,主要參與調(diào)控G1至S期,CyclinD1高表達(dá)會促使細(xì)胞加速從G1到S期,進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞增殖〔14〕。Ki-67是能夠反映細(xì)胞增殖狀態(tài)的標(biāo)志抗原,存在于細(xì)胞G1、S、G2、M期,半衰期短,能夠準(zhǔn)確、敏感反映細(xì)胞增殖活性〔15〕。Caspase級聯(lián)反應(yīng)參與細(xì)胞的凋亡過程,作為細(xì)胞凋亡的參與者和執(zhí)行者,Caspase-3活化后能夠加速細(xì)胞凋亡〔16〕。本研究結(jié)果提示下調(diào)miR-155表達(dá)可通過PTEN/AKT/GSK3β信號通路抑制皮膚鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞的增殖,促進(jìn)細(xì)胞凋亡,達(dá)到疾病治療的目的,但具體分子機(jī)制仍需進(jìn)一步深入研究。