陳立強(qiáng) 劉敬 劉蘭博 劉春苗

(1河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院,河北 石家莊 050011;2石家莊市第四醫(yī)院)

冠脈微循環(huán)障礙是當(dāng)前常見心臟疾病,隨疾病發(fā)展可導(dǎo)致心肌梗死、心功能下降等,改善冠狀動(dòng)脈微循環(huán)障礙成為治療冠心病的主要目標(biāo)。當(dāng)冠脈微循環(huán)障礙發(fā)生后,炎癥反應(yīng)隨之而來(lái),研究發(fā)現(xiàn)核轉(zhuǎn)錄因子NF-E2相關(guān)因子(Nrf)2/抗氧化反應(yīng)元件(ARE)信號(hào)通路與血管氧化應(yīng)激損傷之間存在密切聯(lián)系,而氧化應(yīng)激損傷是冠心病發(fā)生及發(fā)展的關(guān)鍵因素〔1〕。Kelch樣環(huán)氧氯丙烷相關(guān)蛋白(Keap)1可在生理狀態(tài)下與Nrf2發(fā)生耦聯(lián),而Nrf2在細(xì)胞氧化過(guò)程中起到抑制作用,該反應(yīng)過(guò)程中還存在醌氧化還原酶(NQO)1、過(guò)氧化氫酶(CAT)及血紅素加氧酶(HO)-1等因子參與,并且可結(jié)合ARE序列〔2〕。冠脈微循環(huán)障礙發(fā)生后可激活Nrf2/ARE信號(hào)通路,促進(jìn)多種抗氧化酶表達(dá),從而發(fā)揮抗氧化作用,降低心肌損傷〔3〕。本研究通過(guò)檢測(cè)冠脈微循環(huán)障礙大鼠模型Nrf2/ARE信號(hào)通路相關(guān)因子表達(dá)及心肌損傷情況,探究尼可地爾對(duì)于冠脈微循環(huán)障礙的改善效果。

1 資料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 選取SD大鼠50只,均為SPF級(jí)雄性大鼠,由凱學(xué)生物科技(上海)有限公司提供,體質(zhì)量289～312 g,平均(302.45±2.39)g,入組后所有動(dòng)物進(jìn)行為期1 w的適應(yīng)性飼養(yǎng),溫度18～22 ℃,這期間所有動(dòng)物自由飲水、進(jìn)食。

1.2實(shí)驗(yàn)儀器及材料 電子天平(FA1104,上海天平儀器廠產(chǎn)品),切片機(jī)(HM340E 型,德國(guó)),恒溫水浴箱(上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司),光學(xué)顯微鏡、顯微照相機(jī)(OLYMPUS 公司,日本),石蠟包埋機(jī)(TKY-BMB,湖北泰康醫(yī)療設(shè)備有限公司)。止血鉗、剪刀、蘇木素液、伊紅、碘伏、無(wú)菌手套等。

1.3動(dòng)物分組 將50只動(dòng)物隨機(jī)分為對(duì)照組、假手術(shù)組、模型組、低劑量組、高劑量組,各10只,造模前所有動(dòng)物進(jìn)行普通飼養(yǎng)。

1.4制備冠脈微循環(huán)障礙大鼠模型 模型制備前所有大鼠禁食12 h,期間自由飲水,無(wú)菌環(huán)境內(nèi)進(jìn)行模型制備,常規(guī)麻醉,取大鼠仰臥位固定于手術(shù)臺(tái)上,連接動(dòng)物呼吸機(jī),切開胸腔,使用胰島素針刺入左心室,觀察到回血后注射月桂酸鈉,1 ml/kg,確保其進(jìn)入冠狀動(dòng)脈,待大鼠心率穩(wěn)定后縫合。假手術(shù)組手術(shù)操作與手術(shù)組一致,但不進(jìn)行月桂酸鈉注射,然后進(jìn)行常規(guī)縫合。對(duì)照組不進(jìn)行任何手術(shù)干預(yù),術(shù)后各組常規(guī)飼養(yǎng),期間不使用抗生素及抗凝劑,對(duì)大鼠生存狀態(tài)進(jìn)行密切觀察。

1.5干預(yù)方法 將適應(yīng)性飼養(yǎng)及造模,排除不成功大鼠后的剩余大鼠進(jìn)行常規(guī)飼養(yǎng),即對(duì)照組、假手術(shù)組、模型組、低劑量組、高劑量組,各8只,飼養(yǎng)期間溫度保持在18～22 ℃,保持動(dòng)物房?jī)?nèi)良好通風(fēng)。根據(jù)體表面積法進(jìn)行大鼠用藥劑量換算,大鼠給藥劑量=成人每日劑量(g)×大鼠體質(zhì)量與體表面積比值/人體質(zhì)量與體表面積比值。大鼠尼可地爾用藥劑量0.784 kg/(mg·d)為高劑量組,0.392 kg/(mg·d)為低劑量組,將尼可地爾溶于生理鹽水,每日灌胃;其他組每日進(jìn)行同劑量生理鹽水灌胃,每只大鼠的給藥體積2 ml/d,結(jié)合大鼠生長(zhǎng)情況調(diào)整用藥劑量,連續(xù)進(jìn)行28 d干預(yù),1次/d。

1.6超聲心動(dòng)圖檢測(cè) 對(duì)大鼠進(jìn)行全身麻醉,固定于超聲心動(dòng)圖儀器上,探頭掃描大鼠左胸第3、4肋間,連續(xù)測(cè)定3個(gè)不同心動(dòng)周期左室收縮末期內(nèi)徑(LVESD)、左室舒張末期內(nèi)徑(LVEDD),計(jì)算大鼠左室射血分?jǐn)?shù)(LVEF),并邀請(qǐng)專業(yè)人員進(jìn)行盲評(píng),確定大鼠是否造模成功。

1.7血清樣本采集 常規(guī)麻醉大鼠,抽取腹主動(dòng)脈血,離心處理,轉(zhuǎn)速設(shè)置為3 500 r/min,離心時(shí)間設(shè)置為10 min,分離上層清液低溫存儲(chǔ)備用。

1.8心臟標(biāo)本 在完成取血后,胸腔做切口,分離心臟并取出,沖洗后將其均分為2部分,分別用于病理觀察及RT-q聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)、Western印跡檢測(cè)。

1.9病理學(xué)觀察 制備石蠟切片,甲醛固定心肌組織,經(jīng)脫水透明處理后進(jìn)行石蠟包埋,制成組織切片,厚度約4 μm。烘烤組織切片,經(jīng)脫蠟處理后進(jìn)行染色,蘇木素染色50 s,伊紅染色50 s,經(jīng)反復(fù)處理后制成樹膠封片,鏡下觀察蘇木素-伊紅染色(HE)情況。同樣取組織切片,進(jìn)行馬休黃-酸性品紅-苯胺藍(lán)染色,經(jīng)脫蠟處理后天青石藍(lán)染色3～5 min,Mayer蘇木素染色3～5 min,依次進(jìn)行馬休黃、酸性品紅、苯胺藍(lán)染色,制成樹膠封片后鏡下觀察染色情況。取心肌組織進(jìn)行透射電鏡觀察,甲醛固定后經(jīng)磷酸漂洗液漂洗后進(jìn)行鋨酸固定,再次漂洗后將組織置于冰上,脫水處理后進(jìn)行環(huán)氧樹脂包埋,切片后采用枸櫞酸鉛和醋酸鈾雙重染色,透射電鏡下觀察心肌超微結(jié)構(gòu)變化。

1.10血清樣本測(cè)定 采用放射免疫法進(jìn)行檢測(cè),樣本取提前制備好的血清樣本,對(duì)谷胱甘肽-過(guò)氧化物酶(GSH-Px)、丙二醛(MDA)及超氧化物歧化酶(SOD)水平進(jìn)行檢測(cè),操作嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明進(jìn)行,且由同組人員完成所有操作。

1.11RT-qPCR檢測(cè) 取心肌組織樣本,高壓蒸汽滅菌后于液氮中進(jìn)行組織研磨,直至組織研磨成粉末狀,使用裂解液對(duì)組織粉末進(jìn)行裂解處理,并對(duì)其進(jìn)行離心處理,溫度設(shè)置為4 ℃,時(shí)間5 min,轉(zhuǎn)速12 000 r/min,分離上清,加入等體積異丙醇,充分混勻后孵育30 min,再次離心處理,棄上清,加入配制好的乙醇溶液,再次離心后棄上清,多次處理后室溫下晾干3 min,根據(jù)沉淀量加入適量DEPC水,充分混勻后獲得RNA,測(cè)定RNA濃度,確定提取RNA純度在1.8～2.0,對(duì)1 μg RNA體積進(jìn)行計(jì)算。逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA,然后進(jìn)行PCR檢測(cè),測(cè)定HO-1、Keap1、CAT、Nrf2及NQO1 mRNA表達(dá)情況。

1.12Western印跡檢測(cè) 提取總蛋白,取心肌組織,液氮低溫處理后進(jìn)行組織研磨,移入離心管中加入蛋白裂解液,反應(yīng)結(jié)束后進(jìn)行離心處理,轉(zhuǎn)速12 000 r/min,時(shí)間為5min,分離上清進(jìn)行蛋白測(cè)定。經(jīng)蛋白定量、電泳、轉(zhuǎn)膜后進(jìn)行免疫反應(yīng),依次加入一抗、二抗,反應(yīng)結(jié)束后進(jìn)行顯色曝光,對(duì)目的條帶灰度值進(jìn)行分析,并根據(jù)測(cè)定結(jié)果計(jì)算蛋白的相對(duì)表達(dá)量,分別測(cè)定Nrf2、Keap1、NQO1、CAT、HO-1蛋白表達(dá)情況。

1.13統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS18.0軟件進(jìn)行方差分析、LSD-t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1大鼠心功能改善情況 與對(duì)照組相比,模型組LVEDD、LVESD均升高,LVEF降低;與假手術(shù)組相比,模型組LVESD升高,LVEF降低;與模型組相比,低劑量組LVEDD、LVESD均降低,LVEF升高,高劑量組LVEDD、LVESD均降低,LVEF明顯升高,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1、圖1。

圖1 各組超聲心動(dòng)圖

表1 5組心功能對(duì)比

2.2各組心肌組織病理學(xué)變化 模型組冠脈微血管內(nèi)分布有紅色或白色血栓混合物,心肌纖維化明顯;對(duì)照組、假手術(shù)組無(wú)血栓,但存在少量紅細(xì)胞,尼可地爾干預(yù)后兩組心肌排列明顯改善,纖維化及血栓減輕。馬休黃-酸性品紅-苯胺藍(lán)染色顯示模型組栓塞嚴(yán)重,空白組、假手術(shù)組無(wú)血栓,經(jīng)尼可地爾干預(yù)兩組血栓明顯改善。透射電鏡觀察顯示,模型組心肌細(xì)胞破裂、閏盤間隙過(guò)大,線粒體呈絮狀改變,內(nèi)部復(fù)雜性降低,Z線明顯不平,對(duì)照組及假手術(shù)組襲擊細(xì)胞排列整齊,尼可地爾干預(yù)后兩組線粒體損傷緩解,細(xì)胞排列整齊,Z線改善。見圖2。

圖2 各組不同染色方法冠脈微血管觀察及心肌細(xì)胞、線粒體表現(xiàn)

2.35組血清樣本MDA、SOD、GSH-Px水平 與對(duì)照組相比,模型組MDA升高,高劑量組MDA降低,高劑量、低劑量組SOD升高,高劑量組GSH-Px升高;與假手術(shù)組相比,模型組MDA升高,高劑量、低劑量組SOD升高,高劑量組GSH-Px升高;與模型組相比,高劑量組MDA降低,高劑量、低劑量組SOD升高,高劑量組GSH-Px升高,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

表2 5組MDA、SOD、GSH-Px、HO-1、Keap1、CAT、Nrf2及NQO1 mRNA表達(dá)對(duì)比

2.45組組織HO-1、Keap1、CAT、Nrf2及NQO1 mRNA表達(dá) 與對(duì)照組相比,高劑量組HO-1、CAT、Nrf2及NQO1 mRNA水平升高,Keap1降低,低劑量組Nrf2、HO-1升高;與假手術(shù)組相比,高劑量組Nrf2、NQO1、CAT、HO-1 mRNA升高,低劑量組HO-1升高;與模型組相比,高劑量組Nrf2、NQO1、CAT、HO-1 mRNA升高,低劑量組HO-1升高,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。見表2。

2.55組組織HO-1、Keap1、CAT、Nrf2及NQO1蛋白表達(dá) 與對(duì)照組相比,高劑量組Nrf2、NQO1、CAT及HO-1蛋白水平升高,Keap1降低,低劑量組HO-1升高,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);與假手術(shù)組相比,高劑量組Hrf2、NQO1、CAT、HO-1蛋白水平升高,Keap1降低,低劑量組Keap1降低,HO-1蛋白水平升高,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);與模型組相比,高劑量組Hrf2、NQO1、CAT、HO-1 蛋白水平升高,低劑量組HO-1蛋白水平升高,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表3、圖3。

1～5:對(duì)照組、假手術(shù)組、模型組、低劑量組、高劑量組圖3 各組組織HO-1、Keap1、CAT、Nrf2及NQO1蛋白表達(dá)

表3 5組組織HO-1、Keap1、CAT、Nrf2及NQO1蛋白表達(dá)對(duì)比

3 討 論

據(jù)臨床數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)顯示,冠脈微循環(huán)障礙具有較高的發(fā)生率,嚴(yán)重影響患者原發(fā)疾病恢復(fù)。關(guān)于冠脈微循環(huán)障礙形成機(jī)制的研究較早,以往研究分析可以發(fā)現(xiàn),多數(shù)學(xué)者認(rèn)為氧化應(yīng)激損傷與冠脈微循環(huán)障礙的發(fā)生及發(fā)展存在密切聯(lián)系〔4〕。有研究指出,在冠脈微循環(huán)障礙發(fā)生患者中,其機(jī)體炎癥反應(yīng)及氧化應(yīng)激反應(yīng)明顯高于未發(fā)生冠脈微循環(huán)障礙患者,氧化應(yīng)激反應(yīng)及炎癥反應(yīng)是導(dǎo)致冠脈微循環(huán)障礙發(fā)生的關(guān)鍵〔5〕。冠脈微循環(huán)障礙發(fā)生時(shí)會(huì)損害血管內(nèi)皮,進(jìn)而導(dǎo)致血小板及中性粒細(xì)胞黏附,引起管腔狹窄或閉塞,致使血管閉塞區(qū)域出現(xiàn)循環(huán)障礙,加重患者損傷〔6〕。在冠脈微循環(huán)障礙形成后,增加氧自由基生成,促進(jìn)炎性細(xì)胞浸潤(rùn),激活凋亡信號(hào)通路,進(jìn)一步加重組織損傷的發(fā)生。

氧化應(yīng)激反應(yīng)過(guò)程中伴隨多種氧自由基的產(chǎn)生,氧自由基極易攻擊生物膜磷脂中的不飽和脂肪酸,造成組織損傷。內(nèi)皮細(xì)胞在發(fā)生氧化損傷時(shí),細(xì)胞膜會(huì)伴有脂質(zhì)過(guò)氧化情況,大量酸性物質(zhì)釋放,破壞細(xì)胞質(zhì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、線粒體等細(xì)胞器結(jié)構(gòu),引起蛋白質(zhì)變性〔7〕。隨著血管內(nèi)皮功能不全的發(fā)生,降低內(nèi)皮源性NO生物利用度,增強(qiáng)血管壁炎性反應(yīng),促進(jìn)多種促凝物質(zhì)及黏附分子分泌,最終形成血栓〔8〕。已有研究證實(shí),Nrf2屬于對(duì)抗氧化應(yīng)激的細(xì)胞保護(hù)機(jī)制,通過(guò)調(diào)節(jié)抗氧化基因轉(zhuǎn)錄完成的,在誘導(dǎo)內(nèi)源性抗氧化酶中起關(guān)鍵作用〔9〕。有研究指出,Nrf2可能會(huì)成為抗炎、改善血管內(nèi)皮及解毒等防御機(jī)制的治療靶點(diǎn)〔10〕。在正常細(xì)胞中,Nrf2呈低水平狀態(tài),表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)中,主要受Keap1調(diào)控。但是當(dāng)機(jī)體受到有毒物質(zhì)侵害時(shí),細(xì)胞內(nèi)(ROS)水平升高,影響Keap1結(jié)構(gòu),分離Keap1和Nrf2〔11〕。本研究可以看出,尼可地爾可有效糾正冠脈微循環(huán)障礙大鼠氧化應(yīng)激狀態(tài),調(diào)節(jié)與Nrf2/ARE信號(hào)通路相關(guān)的因子表達(dá),從而達(dá)到促進(jìn)血管恢復(fù)的目的。

Nrf2/ARE 信號(hào)通路是Nrf2在進(jìn)入細(xì)胞核后結(jié)合抗氧化反應(yīng)元件(ARE)形成的,從而促進(jìn)下游一系列反應(yīng)的發(fā)生,這些物質(zhì)均可起到機(jī)體保護(hù)作用,其中主要有HO-1、CAT、NQO1等因子參與〔12〕。有研究指出,激活Nrf2可以起到心肌保護(hù)作用,該保護(hù)作用在敲除Nrf2基因大鼠中消失〔13〕。發(fā)生冠脈循環(huán)障礙后,可產(chǎn)生大量ROS,進(jìn)而斷開Keap1與Nrf2之間的耦聯(lián),致使Nrf2進(jìn)入到細(xì)胞核內(nèi),對(duì)下游抗氧化酶激活起到促進(jìn)作用〔14〕。關(guān)于Nrf2/ARE信號(hào)通路在冠脈微循環(huán)障礙中作用機(jī)制的研究相對(duì)較少,該信號(hào)通路與氧化應(yīng)激損傷有關(guān),而冠脈微循環(huán)障礙形成與氧化應(yīng)激密不可分〔15〕。本研究也可以看出,在冠脈微循環(huán)障礙發(fā)生過(guò)程中,HO-1、CAT、NQO1等因子水平發(fā)生一定變化,且在經(jīng)尼可地爾干預(yù)后,可進(jìn)一步激活Nrf2/ARE 信號(hào)通路,促進(jìn)HO-1、CAT、NQO1等因子的釋放,從而起到抗氧化應(yīng)激的細(xì)胞保護(hù)作用,緩解血栓導(dǎo)致的血管內(nèi)皮損傷。尼可地爾屬于臨床常用藥,多用來(lái)治療冠心病、心絞痛等疾病,在冠脈微循環(huán)障礙治療中比較常見。尼可地爾屬于鉀通道激活劑,可以起到舒張動(dòng)脈血管的作用,關(guān)于尼可地爾治療冠脈微循環(huán)障礙的研究相對(duì)較少,臨床資料不足。本研究證實(shí),尼可地爾可有效起到疏通血管效果,促進(jìn)血管內(nèi)壁恢復(fù),且機(jī)制可能與Nrf2/ARE 信號(hào)通路有關(guān)。