馬鴻云 田春花 馬釗 吳陽 桂甜甜

(寧夏回族自治區(qū)人民醫(yī)院 寧夏眼科醫(yī)院,寧夏 銀川 750002)

子宮內(nèi)膜癌是女性生殖道最常見的惡性腫瘤,也是全球女性中第四常見的惡性腫瘤〔1〕。據(jù)Evans等〔2〕報道,英國子宮內(nèi)膜癌的發(fā)病率正不斷上升。而中國癌癥登記處提供的數(shù)據(jù)顯示,中國也觀察到類似趨勢〔3〕。盡管子宮內(nèi)膜癌在診斷和治療方面(包括手術(shù)、化療和放療)取得相當(dāng)大的進(jìn)展〔4〕,但轉(zhuǎn)移性子宮內(nèi)膜癌的預(yù)后仍較差〔5,6〕。因此,有必要尋找新的臨床適用的分子靶點和更有效的子宮內(nèi)膜癌治療策略。

微小核糖核酸(miRNAs)被發(fā)現(xiàn)具有促癌作用〔7〕,并與包括子宮內(nèi)膜癌在內(nèi)的許多癌癥的進(jìn)展密切相關(guān)〔8〕,多種miRNA已被認(rèn)為是子宮內(nèi)膜癌診斷和預(yù)后的生物標(biāo)志物〔9〕。miR-21-5p在多種腫瘤中高表達(dá)〔10〕,研究證實,多發(fā)性腫瘤抑制基因磷酸酶基因(PTEN)、原肌球蛋白基因(TPM)1、程序性細(xì)胞死亡基因(PDCD)4 mRNA的3'非編碼區(qū)(UTR)均含有miR-21-5p特異性識別和結(jié)合位點〔11〕。此外miR-21-5p在前列腺癌中的異常表達(dá)還可以促進(jìn)前列腺癌細(xì)胞多藥耐藥〔12〕。然而,miR-21-5p在子宮內(nèi)膜癌診斷和治療中的潛在作用研究尚不多。左炔諾孕酮(LNG)是第二代合成孕激素,是諾孕酮外消旋混合物的生物活性異構(gòu)體,目前主要作為一線口服緊急避孕藥或作為與雌激素聯(lián)合使用的長期避孕藥物〔13〕。研究指出,LNG可以作為子宮內(nèi)膜癌的初級保守治療方式,盡管其療效尚未得到證實,但已有研究指出LNG聯(lián)合口服孕激素具有較強(qiáng)的抑制子宮內(nèi)膜癌的作用〔14〕。但LNG對子宮內(nèi)膜癌的作用機(jī)制尚不明確。本研究首次提出LNG與miR-21-5p抑制劑(inhibitor)聯(lián)合使用抑制子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移的方案,為后續(xù)臨床治療子宮內(nèi)膜癌提供新的方法和理論支持。

1 材料與方法

1.1臨床樣本采集 臨床腫瘤標(biāo)本采自2018年9月至2019年7月在寧夏回族自治區(qū)人民醫(yī)院治療的子宮內(nèi)膜癌患者組織10例(均經(jīng)病理檢查確診),組織標(biāo)本離體后30 min內(nèi)置于液氮罐內(nèi)迅速冷凍保存。

1.2實驗細(xì)胞 人子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞系Ishikawa購自北納生物(BNCC338359)。

1.3試劑與儀器 LNG購自Selleckchem公司;Lipofectamine3000購自Invitrogen公司;miR-21 inhibitor和miR-21無關(guān)序列(NC)合成于安徽通用公司;Annexin V-異硫氰酸熒光素(FITC)/碘化丙啶(PI)凋亡檢測試劑盒購自聯(lián)科生物;RNA提取試劑盒及逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自康為世紀(jì)公司;PTEN一抗購自abcam(ab170941);結(jié)晶紫染色液購自Solarbio;NovoCyteTM流式細(xì)胞儀購自艾森生物(杭州)有限公司;多功能酶標(biāo)儀超高靈敏度化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)購自TECAN公司;熒光聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)儀及超高靈敏度化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)購自伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品(上海)有限公司;蛋白電泳儀購自北京市六一儀器廠。

1.4免疫組化 烤片,脫蠟,水化,抗原修復(fù),封閉,敷一抗,稀釋好的一抗:PTEN(1∶100),4 ℃孵育過夜,敷二抗,滴加辣根酶標(biāo)記山羊抗兔IgG(1∶100),37 ℃孵育30 min,二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色,蘇木素復(fù)染,脫水、透明、封片、鏡檢。

1.5細(xì)胞分組處理 將Ishikawa細(xì)胞分為4組,對照(Control)組、LNG處理(LNG)組、LNG處理+miR-21 NC(LNG+miR-21 NC)組和LNG處理+miR-21 inhibitor(LNG+miR-21 inhibitor)組。

1.6細(xì)胞轉(zhuǎn)染 Ishikawa細(xì)胞鋪6孔板,加入5 μl lipofectamine3000,混勻后室溫孵育15 min,將細(xì)胞放回孵箱培養(yǎng),轉(zhuǎn)染6 h后在6孔板中加入20%血清完全培養(yǎng)基1 ml,48 h后進(jìn)行檢測。

1.7實時熒光定量(qRT)-PCR 熒光PCR儀進(jìn)行熒光定量PCR。反應(yīng)體系如下:RNase Free dH2O 9.5 μl、cDNA 1 μl、上游引物1 μl、下游引物1 μl、2×SYBR Green PCR Master Mix 12.5 μl。miRNA反應(yīng)體系如下:RNase Free dH2O 7.2 μl、cDNA 2 μl、上游引物0.4 μl、下游引物10.4 μl、miRNA Universal SYBR qPCR Master Mix 10 μl。反應(yīng)步驟如下:預(yù)變性 95 ℃,10 min;變性95 ℃,10 s;退火58 ℃,30 s;延伸72 ℃,30 s;40個循環(huán)。引物序列由通用生物系統(tǒng)(安徽)有限公司設(shè)計合成,引物序列:PTEN正義:TTTTGAAGACCATAACCCACC,反義:TCATTACACCAGTTCGTCCCT;miR-21-5p正義:TAGCTTATCAGACTGATGTTGA,反義:CTACAATAAACGCGACCACG;GAPDH正義:TGACTTCAACAGCGACACCCA,反義:CACCCTGTTGCTGTAGCCAAA;U6正義:GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT,反義:CGC-TTCACGAATTTGCGTGTCAT。

1.8CCK8檢測細(xì)胞增殖 Ishikawa細(xì)胞中每孔加入10 μl CCK8檢測試劑,37 ℃孵育2 h,酶標(biāo)儀在450 nm波長處檢測細(xì)胞吸光值并計算存活率。細(xì)胞存活率=(實驗組細(xì)胞OD/對照組細(xì)胞OD)×100%〔10〕。

1.9流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡 收集各組細(xì)胞106個,用結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞,利用Annexin Ⅴ-FITC/PI Apoptosis Kit試劑盒,上NovoCyteTM流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡情況。

1.10細(xì)胞劃線檢測細(xì)胞遷移 Ishikawa細(xì)胞鋪6孔板待密度達(dá)到90%以上后進(jìn)行劃線,0 h后給每孔的細(xì)胞劃痕拍照,24 h后再次給每孔的劃痕拍照,進(jìn)而計算出細(xì)胞的遷移速率。遷移速率=遷移距離/遷移時間〔11〕。

1.11Transwell檢測細(xì)胞侵襲 各組細(xì)胞消化收集,離心,計數(shù),每個小室接種細(xì)胞5×104個,24 h后去除孔中培養(yǎng)基,結(jié)晶紫靜置染色1 h,拍照計數(shù)。

1.12Western印跡檢測 各組細(xì)胞加入細(xì)胞裂解液,提取總蛋白。根據(jù)二喹啉甲酸(BCA)試劑盒測定蛋白濃度,十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE),用300 mA恒流轉(zhuǎn)膜80 min。一抗溶液孵育,4 ℃過夜,二抗溶液中室溫孵育2 h。在凝膠成像系統(tǒng)中曝光。用ImageJ軟件分析各條帶灰度值。

1.13統(tǒng)計學(xué)分析 采用Graphpad Prism7軟件,組間顯著性差異采用one-way ANOVA分析。

2 結(jié) 果

2.1子宮內(nèi)膜癌組織PTEN表達(dá) 與治療前(0.160±0.050)相比,LNG治療后子宮內(nèi)膜PTEN表達(dá)水平(0.377±0.024)明顯升高(P=0.000),見圖1。

圖1 子宮內(nèi)膜癌組織中PTEN表達(dá)(DAB,×200)

2.2LNG作用濃度與時間選擇 與0 μmol/L相比,24、48 h時50、100 μmol/L LNG使細(xì)胞活力均明顯下降,細(xì)胞凋亡率均明顯升高且1、5、10 μmol/L LNG 24 h凋亡率亦明顯升高(P<0.01)。其中100 μmol/L效果更加明顯,因此選擇100 μmol/L LNG、24 h進(jìn)行后續(xù)實驗。見表1、圖2。

表1 LNG作用濃度對不同時間點細(xì)胞活力、凋亡的影響

圖2 流式檢測LNG不同濃度與作用時間的凋亡率

2.3miR-21-5p驗證結(jié)果 采用qPCR方法驗證miR-21-5p inhibitor的轉(zhuǎn)染效果,與Control組(1.000±0.00)和miR-21 NC組(0.809±0.121)相比,miR-21 inhibitor組細(xì)胞中miR-21-5p相對表達(dá)量(0.754±0.130)明顯下降(P=0.026)。

2.4LNG聯(lián)合miR-21 inhibitor處理后細(xì)胞增殖變化 與Control組(100.000±4.161)相比,LNG組細(xì)胞增殖活性(79.712±3.734)明顯下降;與LNG組相比,LNG+miR-21 inhibitor組細(xì)胞增殖活性(55.515±1.655)明顯下降(均P<0.01)。

2.5LNG聯(lián)合miR-21 inhibitor后細(xì)胞凋亡變化 與Control組〔(9.803±0.241)%〕相比,LNG組細(xì)胞凋亡率〔(18.323±0.318)%〕明顯上升;與LNG組相比,LNG+miR-21 inhibitor組凋亡率〔(27.297±0.523)%〕明顯上升(均P<0.01)。見圖3。

圖3 LNG聯(lián)合miR-21 inhibitor后各組細(xì)胞凋亡

2.6LNG聯(lián)合miR-21 inhibitor后細(xì)胞遷移能力變化 與Control組(4.930±1.672)相比,LNG組細(xì)胞遷移細(xì)胞數(shù)〔(2.640±1.028)個〕明顯下降;與LNG組相比,LNG+miR-21 inhibitor組細(xì)胞遷移細(xì)胞數(shù)〔(1.043±0.416)個〕明顯下降(均P<0.001)。見圖4。

圖4 LNG聯(lián)合miR-21 inhibitor后各組細(xì)胞遷移(熒光定量染色,×100)

2.7LNG聯(lián)合miR-21 inhibitor后細(xì)胞侵襲能力變化 與Control組(3.819±0.697)相比,LNG組細(xì)胞侵襲細(xì)胞數(shù)〔(2.392±0.234)個〕明顯下降(P=0.000);與LNG組(1.206±0.210)相比,LNG+miR-21 inhibitor組細(xì)胞侵襲細(xì)胞數(shù)〔(0.801±0.124)個〕明顯下降(P<0.01)。見圖5。

圖5 各組細(xì)胞侵襲能力(結(jié)晶紫染色,×100)

2.8各組細(xì)胞中miR-21-5p、PTEN、磷脂酰肌醇-3(PI3K)、p-PI3K、AKT和p-絲氨酸/蘇氨酸激酶(AKT)表達(dá) 與Control相比,其他3組miR-21-5p表達(dá)明顯下調(diào);與LNG相比,LNG+miR-21 inhibitor組miR-21-5p表達(dá)明顯下降(P<0.01)。與Control相比,其他3組p-AKT/AKT和p-PI3K/PI3K表達(dá)明顯下降,PTEN表達(dá)明顯升高;與LNG組相比,LNG+miR-21 inhibitor組p-AKT/AKT和p-PI3K/PI3K比值明顯下降,PTEN表達(dá)明顯升高(均P<0.01)。見表2、圖6。

表2 各組細(xì)胞中miR-21-5p、PTEN、p-PI3K/PI3K和p-AKT/AKT表達(dá)

1～4:Control組、LNG組、LNG+miR-21 NC組、LNG+miR-21 inhibitors組圖6 各組細(xì)胞PTEN、PI3K、p-PI3K、AKT和p-AKT表達(dá)

3 討 論

PTEN是PI3K/AKT通路的上游信號分子,是一種與腫瘤細(xì)胞生長、增殖、黏附等惡性生物學(xué)相關(guān)的抑癌基因〔12,13〕。在婦科惡性腫瘤中,PTEN與子宮內(nèi)膜癌關(guān)系密切,PTEN的缺失會削弱其對腫瘤細(xì)胞生長的調(diào)控作用〔14〕。已有研究指出,PTEN通過調(diào)節(jié)PI3K/AKT信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,調(diào)節(jié)細(xì)胞生長,抑制腫瘤〔15〕。因此PTEN作為一種新的抑癌基因,其獨特的作用方式可以為腫瘤的基因治療和新開發(fā)的抗腫瘤藥物提供新的靶點。本研究結(jié)果支持LNG聯(lián)合miR-21-5p inhibitor治療對子宮內(nèi)膜癌等相關(guān)癌癥的治療作用的理論研究,為子宮內(nèi)膜癌提供了新的治療策略。

miRNA以互補(bǔ)配對的方式與靶基因3'UTR區(qū)結(jié)合,降解靶基因mRNA或抑制靶基因mRNA的翻譯,從而影響腫瘤的增殖、凋亡、侵襲和轉(zhuǎn)移,已有研究表明PTEN是miR-21-5p特異性識別和結(jié)合位點〔16〕。目前,miRNA inhibitor被認(rèn)為是治療某些癌癥的有前途的治療方法,但進(jìn)入臨床應(yīng)用的miRNA療法數(shù)量卻很少,這是因為開發(fā)miRNA有效的傳遞系統(tǒng)時遇到障礙〔17〕。而采用miRNA和其他藥物的聯(lián)合使用可能是一種直觀的解決策略〔18〕,但miRNA聯(lián)合治療的候選藥物尚在研究中,它們的協(xié)同抑制作用也需要探索。本研究成功構(gòu)建miR-21-5p inhibitor并證實可以有效抑制miR-21-5p 的表達(dá)促進(jìn)PTEN表達(dá),這為后續(xù)聯(lián)合治療提供了基礎(chǔ)。

子宮內(nèi)膜癌是由激素引起的,激素治療相對毒性低于目前的化療和放療等治療方式〔19〕。孕酮的幾種衍生物已被用于治療晚期和復(fù)發(fā)性子宮內(nèi)膜癌,或希望保持生育能力的患者〔20〕。LNG是目前臨床上已開始用于治療子宮內(nèi)膜癌的激素,但患者的總有效率和治療效果差異很大〔21〕。 因此有必要尋找聯(lián)合或更有效的方式來治療子宮內(nèi)膜癌。

本研究發(fā)現(xiàn)LNG聯(lián)合miR-21-5p inhibitor可以更加有效抑制子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞的增殖、遷移和轉(zhuǎn)移,此過程主要是通過上調(diào)PTEN表達(dá)進(jìn)而抑制PI3K/AKT通路活性。綜合治療方法是一種很有前景的子宮內(nèi)膜癌治療方法。雖然已經(jīng)在體外證明了LNG聯(lián)合miR-21-5p inhibitor的協(xié)同作用,但更多的數(shù)據(jù)仍需進(jìn)行體內(nèi)實驗來進(jìn)行驗證。