彭旭 姜波濤 張丹 劉杰 李雙

(長沙市第一醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科,湖南 長沙 410000)

臨床醫(yī)學(xué)將因突發(fā)性的腦組織供血中止導(dǎo)致腦組織壞死的癥狀定義為急性腦梗死,在腦卒中患者中占比接近90%,是最常見的腦血管疾病〔1,2〕。急性腦梗死多發(fā)于中老年人群,患者主要臨床表現(xiàn)為半身不遂、突發(fā)性眩暈、頭痛等,具有病起突然、嚴(yán)重程度高、治療難度大、預(yù)后差等特征〔3,4〕。目前臨床尚無特效的治療急性腦梗死的藥物,因此研究其發(fā)病分子機(jī)制,探尋新的治療靶點成為重點研究方向〔5〕。有研究表示,miR-145-5p在急性腦梗死中呈異常表達(dá),其表達(dá)變化與急性腦梗死患者病情密切相關(guān),但是關(guān)于調(diào)控miR-145-5p對急性腦梗死干預(yù)效果的研究鮮有報道〔6〕。本研究建立急性腦梗死大鼠模型,調(diào)控大鼠miR-145-5p表達(dá),旨在探究調(diào)控miR-145-5p表達(dá)對急性腦梗死模型大鼠的干預(yù)效果及相關(guān)作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1材料 選取40只SD健康雄性大鼠〔北京科興中維生物技術(shù)有限公司,使用許可證號:SYXK(京)2020-0054〕,鼠齡10～12 w,平均(10.9±0.7)w;體質(zhì)量221～252 g,平均(236.5±12.4)g。所有大鼠于(23.2±1.9)℃環(huán)境中喂養(yǎng)。本研究獲長沙市第一醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)。主要試劑:antago miR-145-5p、ago miR-145-5p(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司);兔抗大鼠Toll樣受體(TLR)4抗體(Gibco公司);大鼠抗小鼠核因子(NF)-κB p65抗體(Dako公司);大鼠抗小鼠腫瘤壞死因子(TNF)-α抗體(Invitrogen公司);小鼠抗兔白細(xì)胞介素(IL)-1β抗體(Sigma公司);小鼠抗大鼠B淋巴細(xì)胞瘤(Bcl)-2、Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bax)抗體(Selleck公司);兔抗大鼠微管相關(guān)蛋白(LC3)-Ⅱ抗體(Hyclone公司);小鼠抗兔自噬效應(yīng)蛋白(Beclin)-1抗體(BD公司)。

1.2建模及分組干預(yù) 隨機(jī)挑選10只為正常組,其余30只建立急性腦梗死模型:固定后進(jìn)行麻醉處理,大鼠失去意識后頸部消毒,將中央部位皮膚切開,顯微鏡下分離頸外動脈(ECA)、頸總動脈(CCA)、頸內(nèi)動脈(ICA),近心端結(jié)扎近端ECA,應(yīng)用微動脈夾夾住ICA,CCA進(jìn)行結(jié)扎固定,阻斷腦組織中動脈后將微動脈夾取下,并對ICA進(jìn)行固定,縫合創(chuàng)口并消毒。大鼠建模后出現(xiàn)病灶對側(cè)前肢無法伸直、行走時向病灶對側(cè)旋轉(zhuǎn)、按住尾巴向病灶對側(cè)旋轉(zhuǎn)等狀況視為建模成功,將實驗過程中死亡大鼠剔除,建模成功25只,隨機(jī)分為上調(diào)組9只,腦梗死組、下調(diào)組各8只。下調(diào)組腹腔注射antago miR-145-5p 30 mg/kg,上調(diào)組腹腔注射ago miR-145-5p 30 mg/kg,正常組、腦梗死組腹腔注射等量生理鹽水。4組均連續(xù)干預(yù)7 d。

1.3學(xué)習(xí)、記憶能力檢測 設(shè)計Y型迷宮,并將大鼠置于其中自由活動10 min,60 V電壓對大鼠電刺激6 s,電刺激開始后大鼠直接逃至安全區(qū)為正確反應(yīng),大鼠逃至安全區(qū)后停留0.5 min后再次置入電刺激區(qū)域反復(fù)訓(xùn)練。連續(xù)訓(xùn)練10次中9次符合正確反應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)為訓(xùn)練合格,記錄各組學(xué)習(xí)合格所用訓(xùn)練次數(shù)。Y型迷宮訓(xùn)練次日再次訓(xùn)練,記錄各組10次訓(xùn)練正確反應(yīng)次數(shù)。

1.4腦梗死面積、含水量檢測 取各組腹部靜脈血3 ml,離心半徑10 cm,轉(zhuǎn)速2 500 r/min離心處理15 min,-30 ℃保存。分別于干預(yù)3、5、7 d時間點對腦梗死面積、含水量進(jìn)行檢測:在各時間點,各組麻醉后頸椎脫臼法處死2只,取腦組織冷藏0.5 h,2 mm厚度切片,使用2%紅四氮唑(TTC)溶液染色,0.5 h后4%甲醛固定,拍照后對梗死面積進(jìn)行計算。含水量檢測:將腦組織表面水分吸除后稱重,置于烤箱中烤至恒重,稱取干質(zhì)量,腦含水量=(濕質(zhì)量-干質(zhì)量)/濕質(zhì)量。

1.5HE染色 大鼠腦組織固定后使用4%甲醛浸泡1 d,石蠟包埋、切片,烤干后進(jìn)行脫蠟處理,不同濃度酒精復(fù)水、蘇木素染色,分化、沖洗后進(jìn)行乙醇梯度脫水,伊紅染色、乙醇梯度脫水、脫蠟后封片,顯微鏡觀察。

1.6Western印跡法檢測TLR4/NF-κB通路、凋亡、自噬相關(guān)蛋白表達(dá) 使用裂解液對大鼠腦組織切片進(jìn)行干預(yù)后提取50 μg蛋白,煮沸、蛋白定量后十二烷基硫酸鈉(SDS)-聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)、轉(zhuǎn)膜后室內(nèi)封閉2.5 h,之后1∶2 000添加一抗進(jìn)行孵育,4 ℃孵育,1 d后取出TBST清洗3次,1∶5 000添加二抗,孵育1 h,再次TBST清洗3次,顯色、曝光、成像,檢測條帶灰度值,檢測TLR4、NF-κB p65、Bcl-2、Bax、LC3-Ⅱ、Beclin-1相對表達(dá)量。

1.7酶聯(lián)免疫吸附試驗檢測炎癥因子水平 標(biāo)記酶標(biāo)板,稀釋標(biāo)準(zhǔn)品,設(shè)置空白孔、對照孔、觀察孔,空白孔添加終止液、顯色劑,對照孔添加稀釋后標(biāo)準(zhǔn)品,觀察孔添加血清標(biāo)本、抗體,封膜、充分搖晃后置于37 ℃保溫箱中培養(yǎng),2 h后取出去膜清洗,吸干水分,添加顯色劑后震蕩,顯色后添加終止液,450 nm處測吸光值,計算TNF-α、IL-1β水平。

1.8統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS26.0軟件,多組對比行F檢驗,組間對比行獨立樣本t檢驗。

2 結(jié) 果

2.1各組腦組織病理學(xué)觀察 正常組腦組織細(xì)胞排列緊密、規(guī)則,結(jié)構(gòu)、形態(tài)均正常,無病理變化。腦梗死組、下調(diào)組腦組織細(xì)胞排列較為雜亂無序,且結(jié)構(gòu)、形態(tài)異常,出現(xiàn)細(xì)胞核破裂現(xiàn)象,炎性細(xì)胞浸潤明顯。上調(diào)組腦組織細(xì)胞排列較為規(guī)則,細(xì)胞結(jié)構(gòu)、形態(tài)改善,炎性細(xì)胞浸潤情況明顯減輕。見圖1。

2.2各組學(xué)習(xí)、記憶能力比較 腦梗死組、下調(diào)組、上調(diào)組達(dá)標(biāo)所需訓(xùn)練次數(shù)高于正常組、記憶能力低于正常組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);上調(diào)組達(dá)標(biāo)所需訓(xùn)練次數(shù)低于腦梗死組、下調(diào)組,記憶能力高于腦梗死組、下調(diào)組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);下調(diào)組達(dá)標(biāo)所需訓(xùn)練次數(shù)高于腦梗死組,記憶能力低于腦梗死組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

表1 各組學(xué)習(xí)、記憶能力比較

2.3各組腦組織梗死面積、含水量情況 與腦梗死組比較,干預(yù)3、5、7 d后下調(diào)組梗死面積、腦組織含水量升高,上調(diào)組梗死面積、腦組織含水量降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);與下調(diào)組比較,干預(yù)3、5、7 d后上調(diào)組梗死面積、腦組織含水量降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

表2 各組腦組織梗死面積、含水量比較

2.4各組TLR4/NF-κB通路蛋白及下游炎癥因子水平比較 腦梗死組、下調(diào)組、上調(diào)組TLR4、NF-κB p65表達(dá)及TNF-α、IL-1β水平均顯著高于正常組;下調(diào)組上述指標(biāo)均顯著高于腦梗死組;上調(diào)組上述指標(biāo)均顯著低于腦梗死組、下調(diào)組(P<0.05)。見表3,圖2。

表3 各組TLR4/NF-κB通路蛋白及下游炎癥因子水平及凋亡、自噬相關(guān)蛋白表達(dá)比較

圖2 各組TLR4/NF-κB通路蛋白表達(dá)

2.5各組凋亡、自噬相關(guān)蛋白表達(dá)對比 腦梗死組、下調(diào)組、上調(diào)組Bcl-2、LC3-Ⅱ、Beclin-1表達(dá)顯著高于正常組,Bax表達(dá)顯著低于正常組(P<0.05);下調(diào)組Bcl-2、LC3-Ⅱ、Beclin-1表達(dá)顯著高于腦梗死組,Bax表達(dá)顯著低于腦梗死組(P<0.05);上調(diào)組Bcl-2、LC3-Ⅱ、Beclin-1表達(dá)顯著低于腦梗死組、下調(diào)組,Bax表達(dá)顯著高于腦梗死組、下調(diào)組(P<0.05)。見表3,圖3。

圖3 各組凋亡、自噬相關(guān)蛋白表達(dá)

3 討 論

急性腦梗死患者病死率較高,且其發(fā)病機(jī)制尚未研究透徹,因此許多學(xué)者嘗試通過基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)等途徑對急性腦梗死發(fā)病機(jī)制、干預(yù)方法進(jìn)行研究〔7,8〕。miRNA在生物體中大量存在,在機(jī)體免疫系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)、組織細(xì)胞增殖、凋亡等過程中具有重要作用〔9〕。miR-145-5p為miRNA家族的重要組成成員,miR-145-5p表達(dá)變化與癌細(xì)胞生物學(xué)活性密切相關(guān)〔10,11〕。調(diào)控miR-145-5p表達(dá)能夠促進(jìn)小膠質(zhì)細(xì)胞活化,從而起到腦保護(hù)作用。

大量臨床研究表明,急性腦梗死患者神經(jīng)功能、認(rèn)知功能會受到嚴(yán)重?fù)p傷〔12,13〕。有研究通過動物實驗研究表明,對腦梗死大鼠進(jìn)行干預(yù),能夠改善其神經(jīng)功能及學(xué)習(xí)記憶能力〔14〕。本研究說明急性腦梗死大鼠神經(jīng)功能出現(xiàn)一定程度的損傷,導(dǎo)致學(xué)習(xí)記憶能力明顯下降,上調(diào)miR-145-5p表達(dá)能夠改善大鼠學(xué)習(xí)記憶能力,改善大鼠神經(jīng)功能,可能是由于上調(diào)miR-145-5p表達(dá)促進(jìn)大鼠小膠質(zhì)細(xì)胞活化,從而減輕大鼠神經(jīng)功能損傷嚴(yán)重程度。本研究結(jié)果體現(xiàn)上調(diào)miR-145-5p表達(dá)能夠發(fā)揮一定的腦保護(hù)作用。本研究說明上調(diào)miR-145-5p表達(dá)能夠抑制急性腦梗死大鼠腦組織炎癥反應(yīng)。大量研究表示,隨著急性腦梗死的發(fā)生發(fā)展,機(jī)體腦組織出現(xiàn)一定程度的炎癥反應(yīng),腦組織炎癥反應(yīng)是導(dǎo)致機(jī)體神經(jīng)功能損傷的主要因素〔15,16〕。TLR4/NF-κB通路蛋白表達(dá)變化與機(jī)體炎癥反應(yīng)具有密切聯(lián)系,TNF-α、IL-1β均為TLR4/NF-κB通路下游炎癥因子,二者水平變化與機(jī)體炎癥反應(yīng)密切相關(guān)。本研究說明急性腦梗死大鼠腦組織出現(xiàn)一定程度的炎癥反應(yīng),上調(diào)miR-145-5p表達(dá)能夠調(diào)控TLR4/NF-κB通路蛋白表達(dá),抑制下游炎癥因子水平,減輕大鼠腦組織炎癥反應(yīng)嚴(yán)重程度,從而起到腦保護(hù)作用。

本研究推測由于上調(diào)miR-145-5p表達(dá)能夠抑制大鼠腦組織神經(jīng)細(xì)胞凋亡,從而發(fā)揮腦保護(hù)作用。急性腦梗死癥狀的發(fā)生發(fā)展伴隨腦組織細(xì)胞凋亡、自噬是機(jī)體神經(jīng)功能損傷的主要原因〔17,18〕。Bcl-2、Bax為線粒體凋亡通路的重要成員,二者表達(dá)變化與細(xì)胞增殖、凋亡能力變化密切相關(guān)〔19,20〕。LC3-Ⅱ、Beclin-1是常用的評價細(xì)胞自噬的指標(biāo),二者表達(dá)與細(xì)胞自噬密切相關(guān)〔21,22〕。本研究說明上調(diào)miR-145-5p表達(dá)能夠調(diào)控細(xì)胞凋亡、自噬蛋白表達(dá),抑制急性腦梗死大鼠腦組織細(xì)胞凋亡、自噬,具有一定的腦保護(hù)作用。