劉岳軒 陳文鈺 陳言 馬夢舸 王鵬禹 劉湘花 高小玲 金艷 劉晨 吳效通 王曉 李曉冰

(1河南中醫(yī)藥大學(xué),河南 鄭州 450008;河南中醫(yī)藥大學(xué) 2第二臨床醫(yī)學(xué)院;3第三臨床醫(yī)學(xué)院)

糖尿病腎病(DN)以微量蛋白尿、腎小球和腎衰竭為特征,是糖尿病主要并發(fā)癥之一〔1〕。研究發(fā)現(xiàn),腎小管間質(zhì)纖維化(TIF)是DN的重要病理結(jié)局,而腎小管上皮細胞轉(zhuǎn)分化(EMT)被認為是TIF的主要發(fā)病機制之一〔2〕。當歸芍藥散(DSS)是傳統(tǒng)中藥方劑,研究表明,DSS在臨床上常用于DN的治療且療效顯著〔3,4〕。本文前期動物實驗也發(fā)現(xiàn),DSS可顯著降低糖尿病早期腎損傷大鼠24 h尿蛋白及β2-微球蛋白水平,改善腎小球及腎小管病理損傷狀況〔5〕。然而,DSS對DN的作用機制尚不明確。本研究觀察DSS對DN模型大鼠的腎保護作用,并從腎小管上皮細胞轉(zhuǎn)分化角度探究其作用機制。

1 材料與方法

1.1實驗動物 SPF級SD大鼠70只,體質(zhì)量(220±20)g,由鄭州大學(xué)實驗動物中心提供,許可證號:SCXK(豫)2017-0001。

1.2藥品與試劑 當歸芍藥散(當歸、芍藥、川芎、茯苓、白術(shù)、澤瀉,比例為1∶4∶2∶1∶1∶2,河南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院);雷公藤多苷片(湖南千金協(xié)力藥業(yè)有限公司,批準文號:國藥準字Z43020138);即用型免疫組化試劑盒(Maxim,中國);Anti-Vimentin (Aviva Systems Biology,CA,美國);Anti-E-cadherin抗體、Anti-α-SMA(CST,Boston,美國)。

1.3實驗儀器 FORMA 700型超低溫冰箱購于Thermo公司;石蠟包埋機、切片機購于德國LEICA公司;Western印跡系統(tǒng)購于Bio-Rad公司;BS224型電子天平購于北京塞多利斯儀器系統(tǒng)有限公司。

1.4DN大鼠模型的建立與分組 實驗前,所有大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1 w。根據(jù)隨機區(qū)組分組法對所有大鼠進行分組,隨機選擇8只作為正常組,常規(guī)動物飼料喂養(yǎng),其余62只大鼠給予高脂高糖飼料4 w。高糖高脂大鼠按照55 mg/kg腹腔注射鏈脲佐菌素(STZ)制備糖尿病模型。72 h后,選取空腹血糖≥16.7 mmol/L大鼠作為糖尿病大鼠〔5〕。隨后將高脂高糖糖尿病大鼠隨機分為模型組、DSS低劑量(DSS-L)組、DSS中劑量(DSS-M)組、DSS高劑量(DSS-H)組、雷公藤多苷(TP)組。根據(jù)“人-鼠體表面積折算法”,DSS高、中、低劑量組分別給予21、14、7 g/(kg·d)的DSS灌胃治療,雷公藤多苷組灌胃6 mg/(kg·d)的雷公藤多苷,模型組和正常組灌胃生理鹽水,各組連續(xù)干預(yù)8 w。

1.5免疫組織化學(xué)試驗 將腎組織固定在4%多聚甲醛緩沖液中,石蠟包埋,切片。將制好的石蠟切片置于電熱恒溫干燥箱中,60 ℃烘烤3 h;將干燥的石蠟切片進行常規(guī)二甲苯脫蠟,下行梯度乙醇水化,蒸餾水洗;抗原修復(fù);滴加3%過氧化氫(H2O2)室溫孵育10 min以滅活內(nèi)源性酶,磷酸鹽緩沖液(PBS)洗3次,每次3 min;每張切片滴加正常山羊免疫血清封閉,室溫孵育10 min后甩去多余液體,滴加1∶100比例稀釋波形蛋白(Vimentin)、E-鈣黏蛋白(cadherin)、α-平滑肌肌動蛋白(SMA),4 ℃冰箱過夜;從冰箱取出恢復(fù)至室溫后,PBS洗滌(3 min×3次);每張切片滴加聚合物增強劑(試劑A),室溫20 min,PBS洗滌;每張切片滴加酶標抗鼠兔聚合物(試劑B),室溫10 min,PBS洗滌;二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色,顯微鏡下控制反應(yīng)時間,蘇木素復(fù)染,蒸餾水充分水洗終止顯色;切片經(jīng)梯度酒精脫水干燥,二甲苯透明,中性樹膠封片;使用相差顯微鏡200倍視野下拍照。結(jié)果判定標準及方法:陽性表達的部位顯色呈棕黃色,且其顯色強度明顯高于其背景無特異性染色的部位,細胞核顯色呈淺藍色。使用Image J-ProPlus6.0軟件分析免疫組化的光密度值。

1.6Western印跡 每100 mg組織加入1 ml添加了苯甲基磺氟(PMSF)的RIPA,使用勻漿機勻漿,充分裂解后,4 ℃下12 000～16 000 r/min離心5 min,立即吸取上清進行組織蛋白提取,二喹啉甲酸(BCA)法蛋白定量。取蛋白樣品進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)結(jié)束后,將蛋白轉(zhuǎn)至聚偏氟乙烯(PVDF)膜,5%脫脂牛奶室溫封閉2 h,用α-SMA抗體(1∶1 000)、 Vimentin抗體(1∶4 000),E-cadherin抗體(1∶1 000)于4 ℃孵育過夜,Tris鹽酸緩沖液吐溫(TBST)洗滌,用辣根過氧化酶(HRP)標記的二抗室溫孵育1 h,化學(xué)發(fā)光顯影,用Tanon6600發(fā)光成像工作站圖像采集。蛋白相對表達量計算為目的蛋白灰度值/內(nèi)參蛋白灰度值。

1.7統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS21.0軟件進行單因素方差分析。

2 結(jié) 果

免疫組化和Western印跡檢測結(jié)果可見,與模型組比較,正常組、DSS-M組、DSS-H組及TP組E-cadherin水平顯著升高,Vimentin表達水平明顯降低(P<0.05,P<0.01);正常組、DSS-H組和TP組α-SMA水平顯著降低(P<0.05,P<0.01);此外,Western印跡檢測結(jié)果可見,與模型組比較,DSS-M組α-SMA蛋白表達水平顯著下調(diào)(P<0.01)。見表1、圖1、圖2。

圖1 免疫組織化學(xué)檢測E-cadherin、α-SMA及Vimentin表達

圖2 Western印跡檢測E-cadherin、α-SMA及Vimentin表達

表1 各組E-cadherin、α-SMA及Vimentin表達水平

3 討 論

DSS以健脾化濕,利水活血為基礎(chǔ),在臨床治療DN中收效甚廣〔4,6〕。研究表明,方中當歸、芍藥均可發(fā)揮不同程度降血糖及腎保護作用〔7～10〕,本課題組前期研究發(fā)現(xiàn),DSS可改善糖尿病腎損傷大鼠腎小球增大、系膜細胞及基質(zhì)增生、腎小管變性及炎癥細胞浸潤〔5〕,提示DSS對DN大鼠有一定治療作用。研究表明,DN主要病理基礎(chǔ)是TIF,而腎小管上皮細胞EMT是造成TIF的重要原因之一〔11〕。在EMT過程中,腎小管上皮細胞喪失了原有的細胞形態(tài)和結(jié)構(gòu),失去其特征蛋白E-cadherin,進而被α-SMA和Vimentin所取代,基底膜結(jié)構(gòu)逐漸破壞,上皮細胞分化為肌成纖維細胞,從而具有了遷移和侵襲能力,間質(zhì)纖維組織堆積,最終形成纖維化〔12〕。E-cadherin減少和消失是上皮細胞轉(zhuǎn)分化的標志,且二者相互作用,E-cadherin的減少會加速EMT進程。本研究結(jié)果提示,糖尿病腎損傷大鼠EMT進程被DSS明顯抑制,且在DSS高劑量時治療效果最好。綜上,DSS可一定程度改善糖尿病腎損傷,其對腎臟的保護機制有可能與其逆轉(zhuǎn)腎小管上皮細胞轉(zhuǎn)分化有關(guān)。