包杭生 關宏剛 梁鈺英 馮宗權 劉偉明 陳國濤 周活龍 王鼎 鄒勇根

(佛山市中醫(yī)院骨傷科,廣東 佛山 528000)

膝骨關節(jié)炎(KOA)在老齡人群中具有高發(fā)病率、高危害性,成為廣大學者關注的焦點〔1〕。調(diào)查發(fā)現(xiàn),60歲以上的女性中幾乎有一半是KOA患者〔2〕。我國健康與養(yǎng)老追蹤調(diào)查數(shù)據(jù)庫顯示癥狀性KOA發(fā)病率為8.1%,女性高于男性〔3〕。老年KOA嚴重者將影響患者生活質量〔4〕。研究認為,KOA是由各種復雜因素在炎癥因子及其相關信號通路的介導下引發(fā)的骨性疾病〔5〕。Wnt/β-連環(huán)蛋白(catenin)信號通路通過細胞凋亡途徑發(fā)揮調(diào)控效應〔6〕,其相關蛋白和受體與KOA的發(fā)生發(fā)展密切相關〔7〕。

KOA中醫(yī)學稱為膝痹〔8〕?！稄埵厢t(yī)通》記載有“膝痛”:膝者筋之府,屈伸不能,行則僂附,筋將憊矣。故膝痛無有不因肝腎虛者,虛則風寒濕氣襲之?！妒備洝酚涊d:腎脂不長,則髓涸而氣不行,骨乃痹而其證內(nèi)寒也。故KOA多以正氣內(nèi)虛、肝腎不足為主要病機,以補益肝腎、強筋壯骨為主要治則。骨補丸(曾用名骨寶丸)是佛山市中醫(yī)院骨傷科長期臨床實踐總結的常用院內(nèi)制劑,具有補腎填精益髓、強筋壯骨通絡的功效,適用于肝腎虧虛型老年KOA,已由前期動物與臨床研究證實〔9～11〕?；谥嗅t(yī)藥調(diào)控Wnt/β-catenin信號通路可能是防治KOA的關鍵機制〔12〕,本文從該信號通路探討骨補丸改善關節(jié)功能、抑制滑膜炎癥、延緩軟骨退變、促進軟骨修復的臨床療效及其作用機制。

1 資料與方法

1.1一般資料 以隨機數(shù)字表法將2021年1～6月佛山市中醫(yī)院治療的128例肝腎虧虛型老年KOA患者分成試驗組、對照組各64例。男46例,女82例;年齡60～79歲,平均(66.32±5.21)歲;病程1～10年,平均(4.22±3.38)年;X片Kellgren-Lawrence(KL)分級:Ⅰ級21例,Ⅱ級43例,Ⅲ級41例,Ⅳ級23例。兩組一般資料(性別、年齡、病程、KL分級等)差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05),具有可比性。見表1。本課題通過佛山市中醫(yī)院倫理委員會批準(研究方案版本號20200202),取得所有受試對象知情同意(知情同意書版本號20200205),并在醫(yī)學研究登記備案信息系統(tǒng)備案(備案編號MR-44-21-007340)。

表1 兩組一般資料

1.2診斷標準 KOA診斷標準:根據(jù)《骨關節(jié)炎診療指南(2018年版)》制定〔13〕:①近1個月內(nèi)反復的膝關節(jié)疼痛;②X線片(站立位或負重位)示關節(jié)間隙變窄、軟骨下骨硬化和(或)囊性變、關節(jié)邊緣骨贅形成;③年齡≥60歲;④晨僵時間≤30 min;⑤活動時有骨摩擦音(感)。滿足①+(②、③、④、⑤條中的任意2條)者。肝腎虧虛證候診斷標準:參照《中醫(yī)骨傷科臨床診療指南·膝痹病(膝骨關節(jié)炎)》制定〔14〕:①主癥:關節(jié)隱隱作痛;②次癥:腰膝酸軟無力,酸困疼痛,遇勞更甚。舌質紅,少苔,脈沉細無力。

1.3納入標準 ①符合上述西醫(yī)疾病診斷標準及中醫(yī)證候診斷標準;②X線片示KL分級為Ⅰ～Ⅳ級;③就診之前4 w內(nèi)未服用任何含有骨補丸組成的中藥或中成藥;④患者知情同意。

1.4排除標準 ①膝關節(jié)腫瘤、風濕、類風濕、結核、化膿、骨髓炎、痛風、骨折或嚴重創(chuàng)傷急性期;②嚴重肝腎功能損害,轉氨酶>正常上限值的3倍,血尿素氮和血清肌酐>正常上限值的2倍;③循環(huán)、呼吸、消化、血液、內(nèi)分泌系統(tǒng)等嚴重原發(fā)性疾病;④語言、聽力、認知功能障礙、精神疾病等無法進行有效溝通;⑤已知對試驗藥物(骨補丸組方中的任意一味中藥或中成藥、玻璃酸鈉、氨基葡萄糖類、非甾體抗炎藥)過敏;⑥研究者認為其他需要排除的因素。

1.5終止臨床試驗標準 ①用藥依從性<80%;②發(fā)生嚴重不良事件,如皮膚嚴重過敏、消化道大出血等;③受試者不能堅持治療,主動要求退出。

1.6試驗藥品 ①骨補丸:規(guī)格每袋裝6 g,批準文號粵藥制字Z20060052,佛山市中醫(yī)院院內(nèi)制劑中心生產(chǎn);②玻璃酸鈉注射液:商品名阿爾治,關節(jié)內(nèi)注射劑,規(guī)格2.5 ml(25 mg),進口藥品注冊證號H20090719,日本生化學工業(yè)株式會社高萩工長生產(chǎn);③鹽酸氨基葡萄糖膠囊:商品名奧泰靈,0.75 g/粒,醫(yī)藥產(chǎn)品注冊證號HC20140007,香港澳美制藥廠生產(chǎn);④塞來昔布膠囊:商品名西樂葆,200 mg/片,進口藥品注冊證號H20120355、H20120354,輝瑞制藥有限公司生產(chǎn)包裝;⑤安慰劑:仿造骨補丸外形,原料為面粉,達到可食用級別滅菌后包裝,規(guī)格每袋裝6 g,佛山市中醫(yī)院院內(nèi)制劑中心提供。

1.7治療方法 ①西醫(yī)常規(guī)治療:兩組均給予玻璃酸鈉關節(jié)腔內(nèi)注射,1次/w,連續(xù)4 w?？诜}酸氨基葡萄糖膠囊,2次/d,每次1粒,飯后服用,連續(xù)4 w?？诜麃砦舨寄z囊,1次/d,每次1粒,飯后服用,連續(xù)4 w;②試驗組:口服骨補丸,3次/d,1袋/次,飯后服用,連續(xù)4 w;③對照組:口服安慰劑,3次/d,1袋/次,飯后服用,連續(xù)4 w。

1.8觀察指標 ①功能量表評分:分別于治療前、治療后由同一組臨床醫(yī)師采用西安大略和麥馬斯特大學骨關節(jié)炎指數(shù)(WOMAC)〔15〕、日本骨科協(xié)會評估治療分數(shù)(JOA)〔16〕、膝關節(jié)Lysholm功能評分〔17〕3種不同功能量表評分。WOMAC評分由關節(jié)疼痛、僵硬和關節(jié)功能3個項目組成,總分96分,分值與功能呈負相關。JOA評分由疼痛及步行能力、疼痛及上下樓梯能力、屈度角度及強直與高度攣縮、腫脹4個項目組成,總分100分,分值與功能呈正相關。Lysholm評分由跛行、支撐、交鎖、膝軟、疼痛、腫脹、爬樓梯、下蹲8個項目組成,總分100分,分值與功能呈正相關。②超聲影像測量滑膜厚度:分別于治療前、治療后由同一組超聲醫(yī)師采用Philips iu22型超聲儀測量。取仰臥位,伸直下肢,顯露膝關節(jié),設置探頭頻率為8～15 MHz,掃查膝關節(jié)前上方,探測膝關節(jié)髕上囊滑膜,收集滑膜厚度數(shù)據(jù),測量3次取平均值。③磁共振成像(MRI)影像測量髕骨面、滑車面軟骨T2值:分別于治療前、治療后由同一組MRI醫(yī)師采用Philips Achieva 3.0T TX多源發(fā)射MRI儀測量。使用SENSE8通道相控陣膝關節(jié)線圈,T2圖成像采用6回波自旋回波(SE)序列1次掃描,參數(shù)為:重復時間(TR)/回波時間(TE)=2 400 ms/15、30、45、60、75、90 ms,層厚5 mm,間隔0.5 mm,視野(FOV)16 cm×16 cm,矩陣320×512,重復次數(shù)(NSA)=1,掃描時間5 min 54 s。將掃描圖像傳遞到Philips EWS工作站,獲取膝關節(jié)軟骨的T2-mapping偽彩圖像,選取髕骨面、滑車面2個興趣區(qū)的關節(jié)軟骨T2值,均測量3次取平均值。④Wnt/β-catenin信號通路因子:分別于治療前、治療后抽取左肘正中靜脈血5 ml,放置于無菌乙二胺四乙酸(EDTA)-Na2抗凝管中,實時熒光定量聚合酶鏈反應檢測Wnt-3a、β-catenin、骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP)-2 mRNA的表達量。設定β-catenin作為內(nèi)參,依據(jù)2-△△Ct方法計算獲取相對定量數(shù)值。本檢測委托廣州金域醫(yī)學檢驗中心完成。⑤安全指標:如實記錄任何不良事件,包括全身不良反應、局部皮膚不良反應、消化道不良反應等出現(xiàn)的時間及癥狀體征,是否需停藥及處理措施等。

1.9統(tǒng)計學方法 采用SPSS22.0軟件,計數(shù)資料采用Pearsonχ2檢驗。計量資料若服從正態(tài)分布,且各組總體方差齊,則選擇參數(shù)統(tǒng)計,組內(nèi)比較采用配對設計t檢驗,組間比較采用獨立樣本設計t檢驗;否則選擇非參數(shù)統(tǒng)計。

2 結 果

2.1功能量表評分 病例均獲得隨訪。兩組治療前WOMAC、JOA、Lysholm評分比較,差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。治療后兩組各指標分別與治療前比較,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05);治療后試驗組以上指標改善顯著優(yōu)于對照組(P<0.05)。見表2。

表2 兩組功能量表評分分,n=64)

2.2影像學測量指標 兩組治療前滑膜厚度、髕骨面軟骨T2值、滑車面軟骨T2值比較,差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。治療后,兩組以上指標分別與治療前比較,差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05);治療后試驗組以上指標改善顯著優(yōu)于對照組(P<0.05)。見表3。

表3 兩組影像學測量指標

2.3Wnt/β-catenin信號通路因子 兩組治療前Wnt-3a、β-catenin、BMP-2 mRNA比較,差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。治療后兩組以上指標分別與治療前比較,差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05);治療后試驗組以上指標改善明顯優(yōu)于對照組(P<0.05)。見表4。

表4 兩組Wnt/β-catenin信號通路因子比較

2.4安全指標 試驗期間,兩組均無不良反應事件發(fā)生。

3 討 論

老年KOA是常見而多發(fā)的慢性進行性關節(jié)疾病〔18〕,具體發(fā)病原因和發(fā)病機制尚未完全闡明〔19〕。KOA主要病理過程是關節(jié)滑膜的增生、肥厚,軟骨的降解、破壞,軟骨下骨的囊性變、繼之硬化,邊緣性骨贅形成〔20〕,這一過程由炎癥因子在相關信號通路的介導下實現(xiàn)。研究證實,Wnt/β-catenin信號通路通過調(diào)控關節(jié)軟骨發(fā)育、骨化、重塑、骨折修復等,參與KOA的發(fā)生與發(fā)展〔21〕。Wnt家族有19個成員蛋白〔22〕,其中Wnt-3a是骨代謝的主要調(diào)節(jié)因子,Wnt-3a促進成骨細胞增殖或早期成骨細胞分化,并抑制成骨細胞的成熟或礦化〔23〕。β-catenin是Wnt/β-catenin通路中最關鍵的成骨因子,β-catenin作為多功能胞質蛋白,其異常表達能夠加劇骨質破壞和吸收進程,干擾骨質重建〔24〕。BMP-2則是唯一可以誘導間充質細胞朝向骨組織分化的因子,廣泛參與成骨過程,與成骨速率呈明顯負相關〔25〕,其活躍濃度提示KOA炎癥反應的嚴重程度。本研究提示,Wnt/β-catenin通路是調(diào)控骨代謝的重要途徑,Wnt-3a、β-catenin、BMP-2在該通路中發(fā)揮獨特作用,下調(diào)這三者的表達水平可延緩KOA病程發(fā)展,對這三者的調(diào)控可成為KOA的治療標靶〔26〕。

骨補丸由熟地黃、山茱萸、山藥、淫羊藿、龜板膠、鹿角膠、仙茅、杜仲等多種中藥組成。骨補丸以六味地黃湯之“三補”為其組方框架,熟地黃、山茱萸、山藥為君藥,淫羊藿、龜板膠、鹿角膠為臣藥,仙茅、杜仲為佐使藥,具有補益精髓、壯骨通絡之功效。從單味中藥分析,陳燁等〔27〕證實,山茱萸顆粒能抑制Wnt4、β-catenin的表達,抑制Wnt/β-catenin信號通路的激活。孫雯雯等〔28〕發(fā)現(xiàn),山藥提取物能下調(diào)Wnt/β-catenin通路中關鍵基因Wnt1的表達。代云龍等〔29〕認為,淫羊藿苷能夠降低基質金屬蛋白酶(MMP)-9的mRNA相對表達量與β-catenin蛋白表達量,可能具有抑制Wnt/β-catenin信號通路活性的作用。李春等〔30〕觀察,龜板提取物具有雙向調(diào)控毛囊干細胞Wnt/BMP信號通路作用,隨著龜板提取物劑量的增加,β-catenin表達水平下降。本研究提示,骨補丸能夠調(diào)控Wnt/β-catenin信號通路,有效干預老年KOA病程進展,結合功能量表評分及影像學測量指標比較,骨補丸可能通過下調(diào)Wnt/β-catenin信號通路Wnt-3a、β-catenin、BMP-2表達水平,發(fā)揮其改善關節(jié)功能、抑制滑膜炎癥、延緩軟骨退變、促進軟骨修復的治療作用。

本研究不足之處:一是由于隨訪時間有限,樣本量偏少,缺乏多中心研究;二是由于中藥成分的不確定性及Wnt/β-catenin信號通路機制的復雜性,骨補丸調(diào)控Wnt/β-catenin信號通路是由其單味中藥提取物還是整方復合制劑來干預KOA的機制尚未完全明確。因此,下一步應進行多中心大樣本長期隨訪的前瞻對照試驗,對骨補丸成分進行詳細分析并結構排列,以骨補丸具體影響Wnt/β-catenin信號通路效應成分及作用標靶作為切入點,以獲得更精準的靶向藥物。