羅慶 文霞 鐘敏 周家紅 呂志宇 劉靳波

(西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院 1醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)部,四川 瀘州 646000;2神經(jīng)內(nèi)科)

帕金森病(PD)是中老年人常見的神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病,其病理機(jī)制尚不清楚〔1〕,有證據(jù)表明線粒體功能障礙在PD發(fā)病機(jī)制中起關(guān)鍵作用〔2〕。線粒體DNA(mtDNA)單倍群是共享某些古老變體的mtDNA單倍型的組,它們在某種程度上反映了對環(huán)境和自然選擇的適應(yīng),并且在不同種族的人口中有所不同〔3〕,且在進(jìn)化和遷移過程中形成并呈現(xiàn)出大陸特定分布〔4〕,在中國漢族群體南北不同地區(qū)存在地理分化〔5〕。

mtDNA單倍群被發(fā)現(xiàn)與自閉癥譜系障礙〔6〕、阿爾茨海默病〔7〕、精神分裂癥〔8〕等多種疾病有關(guān)。PD的風(fēng)險(xiǎn)和mtDNA變異之間的關(guān)聯(lián)已在白種人中得到廣泛研究。與之形成鮮明對比的是,在中國人群的mtDNA變體與PD中的相關(guān)研究較少且還存在爭議。mtDNA多態(tài)的具有地區(qū)差異,尚缺乏在中國西南地區(qū)漢族人群的相關(guān)研究。因此本研究探討線粒體D環(huán)(D-loop)控制區(qū)多態(tài)位點(diǎn)及mtDNA單倍群與漢族人群PD的遺傳易感性。

1 對象和方法

1.1研究對象 收集2018年7月年至2019年12月于西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科就診的門診及住院治療的散發(fā)原發(fā)性PD患者219例(PD組),病例之間無直接血緣關(guān)系,其中男109例,女110例,年齡42～91歲,平均(69.64±10.47)歲。病例均為中國漢族人群。且入組病例均經(jīng)過兩名神經(jīng)內(nèi)科醫(yī)生的獨(dú)立檢查,采集相關(guān)信息及病史,排除家族性及繼發(fā)性PD。對照組來自同一區(qū)域的漢族人群,共233例。年齡44～88歲,平均(62.85±9.51)歲,其中男136例,女97例,親緣家屬中無PD患者,且經(jīng)過系統(tǒng)的病史采集與體格檢查排除原發(fā)及繼發(fā)性PD。診斷標(biāo)準(zhǔn)PD的診斷標(biāo)準(zhǔn)根據(jù)2015年國際運(yùn)動(dòng)障礙學(xué)會(MDS)推出的PD的臨床診斷最新標(biāo)準(zhǔn)〔9〕。

1.2PCR及測序 血液基因組DNA的提取,進(jìn)行濃度與純度檢測。檢測合格后,進(jìn)行mtDNA高變區(qū)片段的擴(kuò)增,采用引物〔10〕:擴(kuò)增引物L(fēng)15594(正向5′-CGCCTACACAATTCTCCGATC-3′)與H901(5′-反向ACTTGGGTTAATCGTGTGACC-3′),測序引物L(fēng)15811(正向5′-TCATTGGACAAGTAGCATCC-3′)、H11反向(5′-CGTGAGTGGTTAATAGGGTGATAG-3′)、L16410正向(5′-GTCCCTTGACCACCATCCTC-3′)、H665反向(5′-TAAGAGCTAATAGAAAGG-3′)。PCR擴(kuò)增完成后經(jīng)1.5%凝膠電泳鑒定,將PCR產(chǎn)物進(jìn)行sanger 測序。

1.3測序數(shù)據(jù)分析 測序結(jié)果采用DNA分析工具seqman軟件進(jìn)行組裝。使用MitoTool軟件(http://www.mitotool.org)〔11〕根據(jù)修訂的劍橋參考序列分析DNA序列以鑒定堿基中的變體。計(jì)算出每個(gè)樣品突變的數(shù)量及每個(gè)突變的總數(shù)量,選擇群組中總體突變頻率大于5%用于進(jìn)一步分析。根據(jù)最新人類系統(tǒng)發(fā)育樹(Phylotree,mtDNA tree Build 17)確定單倍群及亞單倍群〔12〕。某些通過D-loop測序無法區(qū)分的單倍群則結(jié)合mtDNA編碼區(qū)相應(yīng)的SNPs酶切的結(jié)果來分析。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。PD組和對照組的遺傳同質(zhì)性檢驗(yàn)使用多重對應(yīng)分析進(jìn)行評估。χ2檢驗(yàn)用于評估性別差異,樣本年齡正態(tài)性檢驗(yàn)符合后,使用Mann-WhitneyU檢驗(yàn)評估年齡差異。使用性別和年齡為協(xié)變量的二元邏輯Logistic回歸模型分析PD組與對照組SNPs等位基因和單倍群的頻率,計(jì)算比值比(OR)和 95%置信區(qū)間(95%CI)。

2 結(jié) 果

2.1D-loop控制區(qū)域測序結(jié)果分析 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物片段為1 876 bp,包括線粒體D-loop控制區(qū)域、MT-TF基因和部分的MT-RNR1基因。在452例受檢者中一共檢測到338個(gè)變體,包括突變、插入和缺失。采用最小等位基因頻率(MAF)>5%,發(fā)現(xiàn)有49個(gè)SNP位點(diǎn)、2個(gè)缺失和3個(gè)插入。這些位點(diǎn)的D-loop位置、堿基改變、所占的頻率、位于高變區(qū)位置及其功能位置見表1。

表1 鑒定出的頻率大于5%的54個(gè)變體

2.2病例組與對照組的同質(zhì)性分析 采用篩選出的54個(gè)頻率>5%的變體對兩組樣本進(jìn)行多重對應(yīng)分析。結(jié)果表明兩組質(zhì)心重疊,這表明病例和對照在遺傳背景上非常匹配(圖1)。遺傳同質(zhì)性較高,兩組樣本的種群來源相近,可以用于統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

(1)+:每個(gè)檢測樣本;1:PD患者,2對照組;(2)O:分別為病例組和對照組的質(zhì)心圖1 PD組與對照組D-loop區(qū)域變體的多重對應(yīng)分析

2.3D-loop控制區(qū)域多態(tài)性與PD的相關(guān)性 使用年齡和性別作為協(xié)變量進(jìn)行邏輯回歸分析。首先對個(gè)體攜帶D-loop控制區(qū)域的變體個(gè)數(shù)與PD的相關(guān)性進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。攜帶變體個(gè)數(shù)與PD的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)無關(guān)(P>0.05)。對54個(gè)SNP與PD發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的關(guān)系進(jìn)行了逐一鑒定。5個(gè)SNP與PD顯著相關(guān),分別為:320C/T、16140T/C、16189T/C、16224T/C、16290C/T。320C/T、16189C/T、16224T/C與16290C/T在PD患者中的攜帶頻率明顯高于對照組。而16140T/C在PD組的攜帶頻率較對照組明顯偏低。見表2。

表2 鑒定出的與PD風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)的變體〔n(%)〕

2.4線粒體DNA單倍群與PD相關(guān)性 依據(jù)D-loop控制區(qū)域測序結(jié)果序列并結(jié)合編碼區(qū)序列的分析,實(shí)驗(yàn)樣本被劃分為不同的單倍群,主要為L3的子單倍群N和M。在233例對照組中,最常見的單倍群是D (18.88%),其次是單倍群 B (15.88%)、R9(12.45%)、F(10.31%)、A (8.15%)。在亞單倍群中最常見的是D4(12.87%)。通過Logistic回歸分析結(jié)果顯示,PD組和對照組之間未檢測到單倍群頻率的差異(P>0.05)。見表3。但在單倍群B(P=0.078,OR=0.623,95%CI=0.369～1.054)和單倍群B4中發(fā)現(xiàn)與PD的存在邊際顯著關(guān)聯(lián)。通過分層分析發(fā)現(xiàn),在男性中單倍群R9(P=0.045,OR=0.396,95%CI=0.160～0.980)和單倍群F(P=0.038,OR=0.354,95%CI=0.132～0.945)在兩組之間存在顯著性差異。在女性中,單倍群M7(P=0.016,OR=0.260,95%CI=0.087～0.779)在PD組與對照組之間也具有顯著性差異。因此在中國西南地區(qū)四川漢族人群中,線粒體DNA單倍群與PD的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)存在相關(guān)性。

3 討 論

線粒體基因組的D-loop區(qū)域的功能仍然知之甚少,目前的研究〔13〕表明與線粒體DNA復(fù)制、脫氧核糖核酸(dNTP)代謝、DNA重組、DNA拓?fù)涞裙δ芫哂忻芮凶饔?。因此D-loop區(qū)發(fā)生變異,可能會影響其調(diào)控復(fù)制和轉(zhuǎn)錄的作用,進(jìn)一步影響細(xì)胞的能量代謝,從而致病。

Wu等〔14〕第1個(gè)對亞洲人群中通過對D-loop區(qū)域進(jìn)行測序后分析與PD相關(guān)的mtDNA變異,結(jié)果表明與PD密切相關(guān)的是6個(gè)SNP,包括151T/C、189G/A、318C/T、16086C/T、16134T/C和16271C/T。Liou等〔10〕研究雖然不是對D-loop區(qū)域進(jìn)行全測序,但發(fā)現(xiàn)了3個(gè)D-loop T146C、T16189C、G16319A與PD的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)顯著相關(guān)。這與本研究結(jié)果均不一致,無法復(fù)制出相似的變體。可能的原因首先是由于D-loop控制區(qū)域的多態(tài)性較高,與PD相關(guān)的mtDNA多態(tài)位點(diǎn)具有人群差異。其次是因?yàn)楸狙芯繕颖玖啃?為差異提供了可能的解釋。再次由于mtDNA在不同民族及地理位置上存在不同的多態(tài)性及移民、遺傳選擇和環(huán)境等多種因素都有可能影響其多態(tài)性。D-loop區(qū)域多態(tài)性較高,與PD相關(guān)聯(lián)的SNPs具有明顯的地區(qū)差異,具有較高的特異性,因此不適用于作為PD普遍易感因子。

本研究未檢測四川地區(qū)漢族人群PD病例和對照之間的單倍群頻率差異。但在單倍群B和單倍群B4中發(fā)現(xiàn)與PD的存在邊際顯著關(guān)聯(lián)。在中國人群的研究中,一項(xiàng)小樣本研究來自中國福建漢族人群發(fā)現(xiàn)單倍型B可能會降低漢族人群早發(fā)型帕金森病(EOPD)和50歲以下人群的罹患EOPD的風(fēng)險(xiǎn),而單倍型D可能會導(dǎo)致50歲以下人群發(fā)生PD的風(fēng)險(xiǎn)更高〔15〕。另一項(xiàng)兩階段來自中國臺灣人群的研究發(fā)現(xiàn)攜帶線粒體單倍體B5的受試者對PD具有抗藥性〔10〕。另一項(xiàng)分析mtDNA變體及其發(fā)生PD風(fēng)險(xiǎn)的研究來自浙江漢族人群表明,攜帶單體組A5的受試者易感,而單體組B5攜帶者對疾病的抵抗力更高〔14〕。同時(shí)該研究的空間分析表明單倍群B5分布與PD患病率之間呈負(fù)相關(guān)。而本研究未發(fā)現(xiàn)單倍群B或者B5與中國四川地區(qū)漢族人群PD發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的關(guān)聯(lián),也沒有發(fā)現(xiàn)先前研究單倍群A5在PD患者與對照之間的差異。疾病和對照組之間缺乏足夠的患者數(shù)量或人群亞結(jié)構(gòu)差異被認(rèn)為是影響結(jié)果的主要原因〔16〕。很多單倍群相關(guān)的病例對照研究缺乏復(fù)制隊(duì)列這樣的第2個(gè)對照組。為了可靠地檢測單倍群與復(fù)雜人類疾病之間的關(guān)聯(lián),需要非常大的病例和對照樣本量。

綜上,線粒體D-loop區(qū)變體及單倍群與PD的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)可能存在一定的相關(guān)性。雖然本研究樣本量較小,但擴(kuò)充了漢族人群相關(guān)的數(shù)據(jù),為將來多中心的研究提供一定的數(shù)據(jù)。而mtDNA SNPs及單倍群與PD的相關(guān)性還需更多大樣本研究來證實(shí)。