馬貝貝，田穎穎，楊海潤，王婷婷，張志聰，楊碩，曹欣垚，左澤平*，王志斌*

1.北京同仁堂股份有限公司科學(xué)研究所，北京 100079

2.北京中醫(yī)藥大學(xué) 中藥學(xué)院，北京 102488

睡眠作為一種與人類健康息息相關(guān)的重要生理活動(dòng)，有益于神經(jīng)系統(tǒng)的能量儲(chǔ)存與恢復(fù)，輔助機(jī)體學(xué)習(xí)記憶行為的順利完成[1]。近年來失眠癥已成為臨床最為常見的睡眠障礙[2]，持續(xù)的睡眠啟動(dòng)與維持困難導(dǎo)致的睡眠質(zhì)量和時(shí)間無法滿足日間需求的主觀體驗(yàn)使大部分患者長期遭受焦慮、頭痛、間歇性遺忘等癥狀的困擾[3]，并時(shí)刻暴露于罹患抑郁、心臟病、高血壓、肥胖的風(fēng)險(xiǎn)之下[4]。據(jù)世界衛(wèi)生組織報(bào)告，全球約1/3 的普通人群患有持久性睡眠障礙，約有50%個(gè)體一生中均會(huì)經(jīng)歷失眠癥狀[5]?，F(xiàn)今醫(yī)學(xué)界常用的失眠癥治療藥物主要包括苯二氮類、三環(huán)類抗抑郁藥及褪黑素等，雖可發(fā)揮誘導(dǎo)催眠效果，但頻繁使用會(huì)引發(fā)呼吸抑制、腎功能損害、反彈性失眠及戒斷反應(yīng)等，一些藥物如氯硝西泮和格魯米特甚至?xí)?dǎo)致認(rèn)知功能喪失[6]。中醫(yī)藥作為一種備受推崇的補(bǔ)充與替代醫(yī)學(xué)手段可為失眠癥醫(yī)治提供可靠的選擇方案。

柏子養(yǎng)心丸作為一類傳承源遠(yuǎn)、應(yīng)用廣泛、普遍認(rèn)可的中醫(yī)經(jīng)典名方，首載于明代醫(yī)家彭用光所著的《體仁匯編》中，而后在《古今醫(yī)統(tǒng)大全》《景岳全書》及《湯頭歌訣》等諸典籍中多有出現(xiàn)，現(xiàn)今被收錄于《全國中藥成藥處方集》《中華人民共和國藥典》2020 年版一部及《國家基本藥物目錄》中。柏子養(yǎng)心丸全方具有補(bǔ)氣、養(yǎng)血、安神之功，適用于心血虧損、怔忡驚悸、失眠健忘、盜汗多夢等癥候，臨床多用于治療心脾兩虛型失眠、慢性焦慮癥及心律失常等。據(jù)報(bào)道，柏子養(yǎng)心丸可明顯延長戊巴比妥干預(yù)小鼠的睡眠時(shí)間，增加其睡眠動(dòng)物數(shù)（入睡率）[7]。此外，柏子養(yǎng)心丸聯(lián)合參芪五味子片、歸脾湯及穴位針刺等治療各種失眠癥療效均顯著[8]。但目前國內(nèi)外學(xué)術(shù)界尚未有柏子養(yǎng)心丸作用機(jī)制研究的相關(guān)報(bào)道，且其質(zhì)量標(biāo)志物鮮有探討，這將嚴(yán)重阻礙其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)建立與臨床應(yīng)用推廣。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是一種源于系統(tǒng)生物學(xué)、多重藥理學(xué)和分子網(wǎng)絡(luò)的新方法[9-10]，“網(wǎng)絡(luò)靶點(diǎn)”作為其核心概念可從生物網(wǎng)絡(luò)角度分析中藥方劑的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)，運(yùn)用現(xiàn)代生物信息學(xué)技術(shù)指導(dǎo)中藥質(zhì)量標(biāo)志物的發(fā)現(xiàn)，剖析多組分藥物在生物體內(nèi)的作用機(jī)理，從分子水平整體闡釋疾病、人類生物系統(tǒng)和藥物靶標(biāo)之間的復(fù)雜關(guān)系[11]，這正與中醫(yī)藥“多靶點(diǎn)、多途徑調(diào)控”及“整體辨證論治”的理論觀念相一致，從而成為全面、系統(tǒng)解析中藥復(fù)方作用機(jī)制的強(qiáng)大工具，由此被廣泛應(yīng)用于各類中醫(yī)藥經(jīng)典方劑的有效成分確定、潛在靶點(diǎn)識(shí)別及干預(yù)通路挖掘。分子對接是一種基于計(jì)算機(jī)智能模擬工具預(yù)測分子與蛋白質(zhì)之間的相互作用、結(jié)合模式及親和力的藥物輔助設(shè)計(jì)和篩選技術(shù)，其結(jié)果準(zhǔn)確，成本低廉，已被逐漸用于中藥方劑的活性成分評價(jià)研究。因此，本研究通過整合網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法與分子對接技術(shù)對柏子養(yǎng)心丸的活性成分、調(diào)控靶標(biāo)及作用機(jī)制進(jìn)行多層次、多維度的全面探索，旨在明確其作用靶點(diǎn)，確認(rèn)其質(zhì)量標(biāo)志物，為下一步的功效通路精準(zhǔn)定位及質(zhì)量評價(jià)體系構(gòu)建提供科學(xué)參考。

1 資料與方法

1.1 柏子養(yǎng)心丸的活性成分篩選及靶點(diǎn)收集

通過中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺(tái)（TCMSP）檢索柏子養(yǎng)心丸整方中柏子仁、黨參、黃芪、川芎、當(dāng)歸、茯苓、遠(yuǎn)志、酸棗仁、肉桂、五味子、半夏、甘草、朱砂13 味藥材的化學(xué)成分，以生物利用度（OB）≥30%及類藥性（DL）≥0.18為界定值篩選活性化合物，并搜集其調(diào)控靶點(diǎn)，而后利用Uniprot 數(shù)據(jù)庫對所有靶點(diǎn)基因進(jìn)行ID 名稱規(guī)范。

1.2 失眠癥的治療靶點(diǎn)收集

以“insomnia”“dyssomnia”“sleep disorder”等與失眠癥定義相關(guān)的專業(yè)術(shù)語為關(guān)鍵詞，在GeneCards 數(shù)據(jù)庫（https://www.genecards.org/，Relevance score值≥1）、OMIM數(shù)據(jù)庫（https://omim.org/）、PharmGKB 數(shù)據(jù)庫（https://www.pharmgkb.org/）、TTD 數(shù)據(jù)庫（https://db.idrblab.net/ttd/）檢索失眠癥關(guān)聯(lián)調(diào)控基因，同時(shí)進(jìn)入DrugBank 數(shù)據(jù)庫（https://go.drugbank.com/）搜尋并整理用于失眠癥治療的臨床一線藥品作用靶點(diǎn)作為重要補(bǔ)充，合并以上5 個(gè)數(shù)據(jù)庫的靶點(diǎn)信息，剔除重復(fù)基因后即為失眠癥的治療靶點(diǎn)庫。

1.3 柏子養(yǎng)心丸活性成分-失眠癥治療靶點(diǎn)蛋白相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與分析

以柏子養(yǎng)心丸活性成分的調(diào)控靶點(diǎn)及失眠癥的治療靶點(diǎn)庫為基礎(chǔ)，使用R 語言程序包“venn”將二者取交集并繪制韋恩圖，并進(jìn)一步將交集靶點(diǎn)上傳到STRING 數(shù)據(jù)庫（https://string-db.org/）進(jìn)行蛋白相互作用分析，設(shè)定“Organisms”為“Homo sapiens”，設(shè)定“minimum required interaction score”為0.9，生成的PPI 網(wǎng)絡(luò)圖導(dǎo)入到Cytoscape 3.9.1 軟件中，利用CytoNCA 工具計(jì)算各網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)的連接度（degree）、介度（betweenness）及緊密度（closeness）等參數(shù)，以R 語言程序?qū)γ總€(gè)參數(shù)進(jìn)行中位值過濾循環(huán)，尋找PPI 網(wǎng)絡(luò)中的核心靶點(diǎn)，并基于此構(gòu)建PPI 核心作用模塊。

1.4 柏子養(yǎng)心丸治療失眠癥作用靶點(diǎn)功能與通路的富集分析

使用R 語言中的“BiocManager”平臺(tái)加載“org.Hs.eg.db”程序包，并將以上所述的柏子養(yǎng)心丸活性成分作用靶點(diǎn)與失眠癥治療靶點(diǎn)庫的交集靶點(diǎn)基因symbol 名稱轉(zhuǎn)換為entrezID，而后再采用R語言“clusterProfiler”“enrichplot”“ggplot2”“pathview”等程序包對交集基因進(jìn)行基因本體（GO）功能富集與京都基因與基因組百科全書（KEGG）通路富集分析，設(shè)置P值過濾條件為0.05，選取GO 富集結(jié)果中生物過程（BP）、細(xì)胞組分（CC）、分子功能（MF）3 個(gè)模塊各前10 個(gè)基因功能集合及KEGG 富集結(jié)果中前30 條通路以條形圖（barplot）和氣泡圖（bubble）的形式進(jìn)行可視化。

1.5 柏子養(yǎng)心丸活性成分-治療失眠癥作用靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖的構(gòu)建

使用Cytoscape 3.9.1 軟件將柏子養(yǎng)心丸治療失眠癥的作用靶點(diǎn)（交集靶點(diǎn)）與其關(guān)聯(lián)的活性化合物的相互關(guān)系繪制成網(wǎng)絡(luò)圖，并采用內(nèi)置的CytoNCA 工具分析整個(gè)網(wǎng)絡(luò)中成分與靶點(diǎn)各個(gè)代表節(jié)點(diǎn)的度、介度及緊密度，根據(jù)網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋵W(xué)參數(shù)探討柏子養(yǎng)心丸治療失眠癥的關(guān)鍵藥效成分與核心作用靶點(diǎn)。

1.6 柏子養(yǎng)心丸關(guān)鍵成分與核心靶點(diǎn)的分子對接驗(yàn)證

將分析得到的柏子養(yǎng)心丸關(guān)鍵藥效成分導(dǎo)入PubChem 數(shù)據(jù)庫（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）進(jìn)行檢索，下載其2D 結(jié)構(gòu)后使用ChemOffice 套件中的Chem3D 軟件轉(zhuǎn)換為3D 結(jié)構(gòu)；同時(shí)，結(jié)合Uniprot 數(shù)據(jù)庫查詢到的核心靶點(diǎn)的“Entry Identifier”進(jìn)一步搜索RCSB PDB 數(shù)據(jù)庫（https://www.rcsb.org/）下載其三維空間結(jié)構(gòu)，使用開源Pymol 軟件刪除其中的水分子與有機(jī)小分子，而后導(dǎo)入AutoDockTools 1.5.7 軟件進(jìn)行加氫、加電荷操作，設(shè)置Gridbox 參數(shù)確定對接范圍，最后采用AutoDock Vina 1.1.2 軟件進(jìn)行分子對接驗(yàn)證，根據(jù)配體-蛋白對接模型的最低結(jié)合能判斷成分與靶點(diǎn)的親和能力，使用Pymol 軟件將對接結(jié)果可視化。

1.7 柏子養(yǎng)心丸關(guān)鍵活性成分與潛在靶點(diǎn)的二次挖掘

為了避免在網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)生物信息篩選過程中出現(xiàn)潛在活性成分與調(diào)控靶點(diǎn)的遺漏現(xiàn)象，本研究再次以PPI 核心作用模塊中的關(guān)鍵靶點(diǎn)為源頭，反向追溯其關(guān)聯(lián)的柏子養(yǎng)心丸化學(xué)成分，并使用Pymol、AutoDockTools 1.5.7、AutoDock Vina 1.1.2系列軟件對這些化合物與核心靶點(diǎn)進(jìn)行分子對接考察，根據(jù)結(jié)合能的大小確定潛在的活性成分與作用靶點(diǎn)，以期更全面闡釋柏子養(yǎng)心丸治療失眠癥的作用途徑，補(bǔ)充完善其質(zhì)量標(biāo)志物。

2 結(jié)果

2.1 柏子養(yǎng)心丸活性成分與靶點(diǎn)的篩選

利用TCMSP 數(shù)據(jù)庫初步提取并經(jīng)ADME 篩選后共得到柏子仁化學(xué)成分5 種，半夏化學(xué)成分13種，川芎化學(xué)成分7 種，當(dāng)歸化學(xué)成分2 種，黨參化學(xué)成分21 種，茯苓化學(xué)成分15 種，甘草化學(xué)成分92 種，黃芪化學(xué)成分20 種，酸棗仁化學(xué)成分9種，合并后共得到167 個(gè)活性化合物，見表1。進(jìn)一步收集其相關(guān)作用靶點(diǎn)，合并后共得264 個(gè)調(diào)控基因。

表1 柏子養(yǎng)心丸中的活性成分Table 1 Active ingredients in Baizi Yangxin Pills

2.2 失眠癥疾病相關(guān)靶點(diǎn)的獲取

從GeneCards 數(shù)據(jù)庫收集疾病靶點(diǎn)323 個(gè)，從TTD 數(shù)據(jù)庫收集疾病靶點(diǎn)26 個(gè)，同時(shí)結(jié)合OMIM與PharmGKB 數(shù)據(jù)庫搜集結(jié)果補(bǔ)充相關(guān)靶點(diǎn)，最后，從DrugBank 數(shù)據(jù)庫收集用于失眠癥治療的臨床一線藥物治療靶點(diǎn)178 個(gè)。合并以上5 個(gè)數(shù)據(jù)庫的搜集結(jié)果，剔除重復(fù)基因，共計(jì)得到失眠癥干預(yù)靶點(diǎn)475 個(gè)，各數(shù)據(jù)庫靶點(diǎn)的收集合并情況見圖1。

圖1 失眠癥相關(guān)靶點(diǎn)Fig.1 Related targets of insomnia

2.3 柏子養(yǎng)心丸作用靶點(diǎn)-失眠癥基因PPI 網(wǎng)絡(luò)分析

使用R語言平臺(tái)將收集到的柏子養(yǎng)心丸調(diào)控靶點(diǎn)與失眠癥基因取交集，繪制韋恩圖，見圖2，獲得二者的共同靶點(diǎn)69 個(gè)。將共同靶點(diǎn)上傳到STRING 平臺(tái)繪制PPI 網(wǎng)絡(luò)，見圖3。為了更準(zhǔn)確剖析柏子養(yǎng)心丸治療失眠癥的潛在分子機(jī)制，將PPI 網(wǎng)絡(luò)導(dǎo)入Cytoscape 3.9.1 軟件進(jìn)行節(jié)點(diǎn)區(qū)分與區(qū)域可視化，采用內(nèi)置的CytoNCA 工具計(jì)算各節(jié)點(diǎn)的degree、betweenness、closeness 參數(shù)，以R 語言程序?qū)γ總€(gè)參數(shù)進(jìn)行中位值過濾循環(huán)，發(fā)現(xiàn)PPI網(wǎng)絡(luò)中的核心靶點(diǎn)包括絲裂原激活的蛋白激酶（MAPK3）、CXC 型趨化因子配體8（CXCL8）、細(xì)胞色素P450 3A4 酶（CYP3A4）、血管內(nèi)皮生長因子A（VEGFA）、細(xì)胞色素P450 家族成員1A1（CYP1A1）等，PPI 核心互作模塊見圖4。

圖2 柏子養(yǎng)心丸作用靶點(diǎn)與失眠癥基因交集韋恩圖Fig.2 Venn diagram of the intersection between the targets of Baizi Yangxin Pills and insomnia genes

圖3 柏子養(yǎng)心丸-失眠癥交集基因的PPI 網(wǎng)絡(luò)Fig.3 PPI network of Baizi Yangxin Pills-insomnia intersection genes

圖4 PPI 網(wǎng)絡(luò)中關(guān)鍵靶點(diǎn)的剖析與核心PPI 模塊的構(gòu)建Fig.4 Anatomy of key targets in PPI network and construction of core PPI modules

2.4 GO 功能與KEGG 通路的富集分析

使用R語言平臺(tái)對柏子養(yǎng)心丸治療失眠癥的作用靶點(diǎn)進(jìn)行GO 功能與KEGG 通路富集分析，結(jié)果顯示，柏子養(yǎng)心丸主要參與的BP 主要為對外源性刺激的反應(yīng)（response to xenobiotic stimulus）、對脂多糖的反應(yīng)（response to lipopolysaccharide）、對養(yǎng)分水平的響應(yīng)（response to nutrient levels）等；MF主要富集在G 蛋白偶聯(lián)胺受體活性（G protein coupled amine receptor activity）、神經(jīng)遞質(zhì)受體活性（neurotransmitter receptor activity）、突觸后神經(jīng)遞質(zhì)受體活性（postsynaptic neurotransmitter receptor activity）等；CC 主要存在于突觸膜（synaptic membrane）、突觸后膜（postsynaptic membrane）、膜筏（membrane raft）等。

參與調(diào)控的通路主要涉及神經(jīng)活性配體-受體相互作用（neuroactive ligand receptor interaction）通路、神經(jīng)退行性變-多種疾病通路（pathways of neurodegeneration multiple diseases）、化學(xué)致癌-受體激活（chemical carcinogenesis receptor activation）通路等，見圖5。

圖5 柏子養(yǎng)心丸調(diào)控失眠癥作用靶點(diǎn)的GO 富集分析和KEGG 通路分析Fig.5 GO enrichment analysis and KEGG pathway of the action targets of Baizi Yangxin Pills in regulating insomnia

2.5 柏子養(yǎng)心丸活性成分-調(diào)控失眠癥靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖分析

采用Cytoscape 3.9.1 軟件構(gòu)建柏子養(yǎng)心丸活性化合物調(diào)控失眠癥基因的網(wǎng)絡(luò)圖，見圖6。通過Cytoscape 軟件內(nèi)置CytoNCA 工具對該網(wǎng)絡(luò)圖進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋵W(xué)分析，以各節(jié)點(diǎn)的degree、betweenness及closeness 為參數(shù)進(jìn)行篩選，發(fā)現(xiàn)柏子養(yǎng)心丸治療失眠癥的關(guān)鍵藥效成分主要包括槲皮素、山柰酚、7-O-甲基異微凸劍葉莎醇、7-甲氧基-2-甲基異黃酮、β-谷甾醇、豆甾醇、柚皮素等，見表2。柏子養(yǎng)心丸干預(yù)失眠癥的主要靶點(diǎn)為前列腺素內(nèi)過氧化物合酶2（PTGS2）、雌激素受體1（ESR1）、過氧化物酶體增殖物激活受體（PPARG）、環(huán)加氧酶 1（PTGS1）、糖原合成酶激酶-3β（GSK3β）、腎上腺素能受體β2（ADRβ2）、α1 腎上腺素能受體B（ADRA1B）、乙酰膽堿酯酶（AChE）及毒蕈堿型膽堿受體M1（CHRM1），見表3。

圖6 柏子養(yǎng)心丸活性成分-失眠癥調(diào)控靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖Fig.6 Network image of the active ingredients in Baizi Yangxin Pills and insomnia regulatory targets

表2 柏子養(yǎng)心丸調(diào)控失眠癥的關(guān)鍵藥效成分Table 2 Key medicinal ingredients of Baizi Yangxin Pills for regulating insomnia

表3 柏子養(yǎng)心丸調(diào)控失眠癥的核心作用靶點(diǎn)Table 3 Core targets of the Baizi Yangxin Pills in regulating insomnia

2.6 分子對接驗(yàn)證

將從“柏子養(yǎng)心丸活性成分-失眠癥靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖”中分析得到的關(guān)鍵藥效成分與核心作用靶點(diǎn)進(jìn)行分子對接驗(yàn)證，以結(jié)合能的大小評價(jià)活性分子與靶點(diǎn)蛋白結(jié)合能力，結(jié)合能≤-7 kcal/mol（1 cal＝4.4 J）時(shí)表明二者有較強(qiáng)的結(jié)合力。結(jié)果顯示，7 個(gè)關(guān)鍵藥效成分與9 個(gè)核心靶點(diǎn)均有較好的結(jié)合活性，進(jìn)一步說明柏子養(yǎng)心丸的關(guān)鍵活性成分對失眠癥的核心調(diào)控靶點(diǎn)有較強(qiáng)的親和力，由此在失眠癥的干預(yù)過程中發(fā)揮“多成分-多靶點(diǎn)-多途徑”的治療效果?！俺煞?靶點(diǎn)”的分子對接結(jié)果見表4，活性成分與靶點(diǎn)蛋白結(jié)合形成的代表性穩(wěn)定構(gòu)象見圖7。

圖7 柏子養(yǎng)心丸關(guān)鍵藥效成分與核心靶點(diǎn)的代表性對接構(gòu)象Fig.7 Representative docking conformations of key pharmacodynamic components of Baizi Yangxin Pills and core targets

表4 柏子養(yǎng)心丸活性成分與核心靶點(diǎn)的結(jié)合能力Table 4 Binding ability of the active ingredients of Baizi Yangxin Pills to the core targets

2.7 潛在活性化合物與作用靶點(diǎn)的二次挖掘

為了更全面、準(zhǔn)確、深度剖析柏子養(yǎng)心丸的質(zhì)量標(biāo)志物與體內(nèi)作用機(jī)制，本研究使用PPI 網(wǎng)絡(luò)核心互作模塊中的關(guān)鍵靶點(diǎn)反向追溯其關(guān)聯(lián)的活性化合物，而后進(jìn)一步施行分子對接結(jié)合力考察，以多層次挖掘潛在的藥效成分與治療靶點(diǎn)。結(jié)果顯示，除柚皮素、槲皮素、山柰酚外，木犀草素與黃芩素亦為柏子養(yǎng)心丸潛在的活性組分，見表5。且根據(jù)“成分-靶點(diǎn)”的結(jié)合力可判別出MAPK3、CXCL8、CYP19A1、CYP3A4、CYP1A1、HIF1A、VEGFA 為柏子養(yǎng)心丸治療失眠癥的潛在調(diào)控靶標(biāo)，由此對接生成的穩(wěn)定分子構(gòu)象見圖8。

圖8 PPI 網(wǎng)絡(luò)核心靶點(diǎn)與其關(guān)聯(lián)成分對接的分子構(gòu)象Fig.8 Molecular conformations of the core targets of the PPI network docked with their associated components

表5 PPI 網(wǎng)絡(luò)核心靶點(diǎn)與關(guān)聯(lián)成分的結(jié)合能力Table 5 Binding capacity of core targets of PPI network with associated components

3 討論

失眠癥在中醫(yī)古籍中多以“不寐”“不瞑”“不得眠”“不得臥”等癥候詞出現(xiàn)[12]。《景岳全書》有云：“神安則寐，神不安則不寐，勞倦思慮太過者，必致血液耗亡，神魂無主，所以不眠?！薄端貑枴酚衷疲骸拔覆缓?，則臥不安?！薄额惤?jīng)》曾指出：“凡人之寤寐，由于衛(wèi)氣，衛(wèi)氣者，晝行于陽，則動(dòng)而為寤；夜行于陰，則靜而為寐，”又言：“思慮傷脾，脾血虧虛，經(jīng)年不寐?！薄鹅`樞》記載曰：“衛(wèi)氣不得入于陰，常留于陽，故目不瞑?！薄短绞セ莘健肥鲈唬骸胺蚰懱摬坏盟?，是五臟虛邪之氣干淫于心。心有憂恚，伏氣在膽，所以睡臥不安。心多驚懼，精神怯弱，蓋心氣憂傷，肝膽虛冷，致不得睡也。”由此可見，失眠癥在中醫(yī)理論下解析的病因多在于營衛(wèi)失和、情志內(nèi)傷、飲食不調(diào)、臟腑損傷、氣血虧虛、心神失養(yǎng)等[13]。柏子養(yǎng)心丸全方共13 味藥材，其中柏子仁養(yǎng)心安神，黨參健脾益肺、養(yǎng)血生津；黃芪益氣補(bǔ)中；川芎活血行氣；當(dāng)歸補(bǔ)血活血；茯苓健脾寧心；遠(yuǎn)志安神益智、交通心腎；酸棗仁養(yǎng)心補(bǔ)肝、寧心安神；肉桂補(bǔ)火助陽、溫經(jīng)通脈；五味子益氣生津、補(bǔ)腎寧心；半夏曲燥濕和胃化痰；朱砂清心鎮(zhèn)驚、安神明目；炙甘草補(bǔ)脾和胃、益氣復(fù)脈又可調(diào)和諸藥，全方共奏補(bǔ)氣、養(yǎng)血、安神之功，且與“不寐”之病機(jī)逐一相符，因而成為醫(yī)治失眠癥的經(jīng)典名方。

通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析、拓?fù)鋵W(xué)參數(shù)計(jì)算及潛在活性成分的二次挖掘，槲皮素、山柰酚、木犀草素、黃芩素、柚皮素、β-谷甾醇、豆甾醇、7-O-甲基異微凸劍葉莎醇及7-甲氧基-2-甲基異黃酮被確定為柏子養(yǎng)心丸的有效成分，各個(gè)成分在篩選過程中即可追溯相應(yīng)原藥材歸屬，且與多個(gè)核心靶點(diǎn)具有良好的對接活性，來源方劑配伍理論牢靠，為柏子養(yǎng)心丸專有且可進(jìn)行定性定量檢測，符合劉昌孝院士關(guān)于中藥Q-Maker“有效性”“特有性”“質(zhì)量傳遞與溯源”“可測性”“配伍環(huán)境”所闡釋的科學(xué)內(nèi)涵[14]。據(jù)報(bào)道，槲皮素可明顯縮短失眠模型小鼠的睡眠潛伏期，延長睡眠時(shí)間，可使白細(xì)胞介素-6（IL-6）、γ-氨基丁酸（GABA）和γ-氨基丁酸受體亞基α1（GABRA1）的mRNA 表達(dá)顯著增加[15]。此外，槲皮素還可通過CYP1A 途徑抑制褪黑素在大鼠肝微粒體中的代謝消除[16]。山柰酚通過調(diào)節(jié)GABA 能系統(tǒng)可增強(qiáng)戊巴比妥誘導(dǎo)的小鼠睡眠行為[17]。木犀草素能降低睡眠剝奪大鼠海馬區(qū)的熱休克蛋白（HSP）90 表達(dá)，增加HSP70 表達(dá)，以劑量相關(guān)方式恢復(fù)睡眠剝奪所致的空間記憶障礙[18]，可通過與腺苷A1 及A2A 受體結(jié)合發(fā)揮催眠作用[19]。將黃芩素注射到大鼠的中樞神經(jīng)系統(tǒng)可延長乙醚誘導(dǎo)的睡眠持續(xù)時(shí)間，且具有良好的抗焦慮和鎮(zhèn)靜作用[20]。柚皮素可改善睡眠剝奪并發(fā)癥大鼠的記憶和情緒，減少腦組織細(xì)胞凋亡，且可有效緩解依法韋侖所誘導(dǎo)的睡眠障礙[21]。β-谷甾醇可延長睡眠誘導(dǎo)與睡眠干擾模型小鼠的睡眠時(shí)間，降低睡眠潛伏期，增加腦組織內(nèi)的褪黑素受體1 和2 的mRNA 表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶（ERK）1/2和αCaMKⅡ的磷酸化[22]。豆甾醇可顯著升高小鼠下丘腦γ-氨基丁酸水平，降低谷氨酸含量，鎮(zhèn)靜催眠作用優(yōu)良。以上研究報(bào)告為基于“物質(zhì)-功能”理論確定柏子養(yǎng)心丸的質(zhì)量標(biāo)志物提供了充足的科學(xué)依據(jù)。

通過“活性成分-調(diào)控靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)與PPI 網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建分析，PTGS2、ESR1、PPARG、PTGS1、GSK3β、ADRB2、ADRA1B、AChE、CHRM1 等基因被確定為柏子養(yǎng)心丸治療失眠癥的核心調(diào)控靶點(diǎn)，MAPK3、CXCL8、CYP19A1、CYP3A4、CYP1A1、HIF1A 及VEGFA 為柏子養(yǎng)心丸的潛在作用靶標(biāo)。據(jù)報(bào)道，在急性異相睡眠剝奪過程中，小鼠前額葉皮層富集在TNF 信號(hào)通路中的關(guān)鍵基因PTGS2 上調(diào)[23]。ESR1 基因在調(diào)節(jié)失眠對圍絕經(jīng)期和絕經(jīng)后婦女認(rèn)知功能的影響中發(fā)揮著重要作用[24]，其甲基化比例增加與睡眠障礙顯著相關(guān)[25]。PPARG 基因與中國漢族人群中阻塞性睡眠呼吸暫停綜合征的發(fā)病率存在明顯關(guān)聯(lián)[26]。PTGS1 為皮層及海馬組織中的主要炎性反應(yīng)介質(zhì)，可介導(dǎo)炎癥反應(yīng)參與睡眠調(diào)節(jié)[27]。GSK-3β 參與情緒與晝夜節(jié)律調(diào)節(jié)，是干預(yù)睡眠-覺醒周期和晝夜運(yùn)動(dòng)行為的重要基因[28]。在阿爾茨海默病的斑馬魚模型中，短長度的Aβ 寡聚體可通過ADRB2 受體誘導(dǎo)急性覺醒，進(jìn)而導(dǎo)致動(dòng)物的睡眠活動(dòng)紊亂[29]。對大鼠進(jìn)行異相睡眠剝奪72 h 后，腦組織中的AChE 活性顯著地增加[30]，而通過修復(fù)膽堿能系統(tǒng)功能（抑制AChE 表達(dá)）可治療失眠[31]。CHRM1 被認(rèn)為是調(diào)節(jié)快速眼動(dòng)睡眠的一個(gè)至關(guān)重要基因[32]。MAPK3 是MAP 激酶信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的重要組成部分，其磷酸化與睡眠持續(xù)時(shí)間密切相關(guān)，且睡眠剝奪會(huì)減少海馬體中MAPK3 的表達(dá)損害記憶[33]。CXCL8 在重度阻塞性睡眠呼吸暫停綜合征患者中表達(dá)異常，并導(dǎo)致免疫反應(yīng)與細(xì)胞因子-受體信號(hào)通路的改變[34]。CYP19A1 是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中一種不可或缺的酶，可催化雌激素合成，而雌激素在維持大腦穩(wěn)態(tài)和功能方面起著重要作用[35]。CYP1A1 的活性升高可導(dǎo)致苯巴比妥誘導(dǎo)小鼠的睡眠時(shí)間減少[36]。HIF1A 是褪黑素合成相關(guān)信息傳遞過程中一種重要的晝夜節(jié)律基因[37]，可介導(dǎo)睡眠過程中間歇性缺氧發(fā)生[38]。VEGFA 是一種與血管生成和神經(jīng)發(fā)生相關(guān)的神經(jīng)營養(yǎng)因子，可影響突觸可塑性，并參與睡眠周期調(diào)節(jié)[39]。由此可知，經(jīng)多維分析所挖掘的柏子養(yǎng)心丸作用靶點(diǎn)均與失眠的分子機(jī)制關(guān)聯(lián)緊密。

本研究充分整合網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法與分子對接技術(shù)，對失眠醫(yī)治古方柏子養(yǎng)心丸的核心活性成分與主要作用靶標(biāo)進(jìn)行了多層次反復(fù)挖掘與精準(zhǔn)識(shí)別，確認(rèn)了9 個(gè)有效成分、9 個(gè)關(guān)鍵作用靶點(diǎn)與7個(gè)潛在作用靶點(diǎn)。經(jīng)過文獻(xiàn)檢索與信息收集，各個(gè)質(zhì)量標(biāo)志物與作用靶點(diǎn)均與睡眠障礙息息相關(guān)。通過GO 功能與KEGG 富集分析發(fā)現(xiàn)，柏子養(yǎng)心丸調(diào)控失眠涉及的生物學(xué)過程如外源性刺激的反應(yīng)、對養(yǎng)分水平的響應(yīng)、氧化應(yīng)激反應(yīng)等。因此，未來針對柏子養(yǎng)心丸的研發(fā)除卻推進(jìn)質(zhì)控方法建立與質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)體系優(yōu)化外，還應(yīng)結(jié)合多種心腦血管疾病與代謝類疾病整體研判療效，以此為基礎(chǔ)進(jìn)行靶點(diǎn)驗(yàn)證、通路定位、基因網(wǎng)絡(luò)繪制、體內(nèi)小分子或大分子代謝擾動(dòng)等干預(yù)分子機(jī)制的深入探索。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突