辛 卉 周平生 徐 鵬 周志剛

(1 江西中醫(yī)藥大學(xué)研究生院,南昌,330004; 2 江西中醫(yī)藥大學(xué)國際教育學(xué)院,南昌,330004; 3 江西中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)學(xué)院,南昌,330004)

子宮內(nèi)膜異位癥(Endometriosis,EMT)是婦科常見病,疼痛是其最常見的臨床癥狀,并伴有其他癥狀,如盆腔包塊、性交痛和不孕等,對女性日常生活有嚴(yán)重影響[1]。目前EMT的發(fā)病機制尚不明確,但大部分學(xué)者認(rèn)為黏附、侵襲、血管生成是EMT的基本病理過程。中醫(yī)認(rèn)為EMT病機多為瘀血阻滯于胞宮,沖任失調(diào)所致[2]。有研究證明艾灸結(jié)合藥物治療對于EMT患者治療效果優(yōu)于單純針刺患者[3]。研究表明EMT的形成與多條信號通路相關(guān),其中磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(Phosphatidylinositol-3-kinase/Protein Kinase B/Mammalian Target of Rapamycin,PI3K/AKT/mTOR)信號通路在EMT發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮了重要作用[4]。本研究旨在通過觀察隔藥餅灸關(guān)元穴對于子宮內(nèi)膜異位導(dǎo)致的痛經(jīng)小鼠子宮PI3K、AKT、mTOR表達(dá)的影響,闡明隔藥餅灸對于PI3K/AKT/mTOR信號通路的影響與隔藥餅灸治療EMT的作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 選用雌性重度聯(lián)合免疫缺陷病(Server Combined Immune Deficiency,SCID)小鼠42只,6～8周齡,體質(zhì)量15～20 g,由湖南斯萊克景達(dá)實驗動物有限公司提供,動物許可證號:SCXK(湘)2019-0004,符合動物實驗標(biāo)準(zhǔn),在江西中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物科技中心提供的無特定病原體(Specific Pathogen Free,SPF)級實驗室內(nèi)飼養(yǎng)。飼養(yǎng)條件:每籠5只,12 h光照/黑暗,室溫(24±2)℃,相對濕度45%～60%,排風(fēng)壓差>10 Pa,滅菌飼料自由進(jìn)食進(jìn)水。本研究通過江西中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物倫理委員會審批(倫理審批號:JZLLSC20210077)。

1.1.2 藥物 藥餅(將附子、肉桂、紅花、丹參、木香、當(dāng)歸按照質(zhì)量10∶2∶3∶4∶2∶3的比例制成藥粉,以黃酒調(diào)和做成直徑約1 cm,厚度約0.5 cm大小的藥餅);艾絨(江西鄱艾科技有限公司,批號:20190411);縮宮素注射液(上海上藥第一生化藥業(yè)有限公司,批號:200519);戊酸雌二醇片(拜耳醫(yī)藥保健有限公司廣州分公司,批號:450A);達(dá)那唑膠囊(江蘇聯(lián)環(huán)藥業(yè)股份有限公司,批號:03020181201)。

1.1.3 試劑與儀器 BCA蛋白定量試劑盒(批號:20201026)、ECL超敏發(fā)光試劑盒(批號:20201125)、電泳液(批號:20201027)、轉(zhuǎn)膜液(批號:20201027)、彩色預(yù)染蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)(批號:20201129)、辣根過氧化物酶標(biāo)記抗兔/抗小鼠二抗(批號:20201129),以上試劑均購自上海威奧生物科技有限公司。小型垂直電泳槽(型號:165-8001)、迷你濕轉(zhuǎn)印槽(型號:170-3930)、基礎(chǔ)電源(型號:164-5050),以上儀器均購自美國Bio-Rad伯樂公司;組織勻漿器(北京鼎昊源公司,型號:TL-2010S);全波長酶標(biāo)儀(Thermo,美國,型號:MutiskanTM GO)。

1.2 方法

1.2.1 分組與模型制備 將42只小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d后,根據(jù)隨機區(qū)組分組法將小鼠分為正常組(n=8)和造模組(n=34)。除正常組外,造模組均參照造模方法建立子宮內(nèi)膜異位小鼠模型[5],手術(shù)前2 d給予補佳樂0.5 mg/kg灌胃,使小鼠處于統(tǒng)一動情期(陰道涂片為大量無核角化細(xì)胞)。采用3%戊巴比妥鈉溶液(50 mg/kg)腹腔注射麻醉小鼠,縱向切開腹壁,暴露左側(cè)子宮,并結(jié)扎子宮兩端,取中間一段子宮;縱向剖開取出的子宮,將子宮內(nèi)膜及肌層分離成大小為5 mm×5 mm的片段,用7-0無菌眼科線將子宮內(nèi)膜面固定于腹腔內(nèi)壁上,并在腹腔內(nèi)適量撒入頭孢氨芐膠囊粉末,最后逐層關(guān)腹、消毒。7 d后隨機挑選2只造模的小鼠,頸椎脫臼法處死觀察病灶處內(nèi)膜形態(tài)和體積,當(dāng)病灶部位出現(xiàn)直徑5～8 mm的半透明囊腫,內(nèi)有液體積聚,并且有血管形成,則提示造模成功。隨后按照隨機區(qū)組分組法分為4組:模型組、西藥組、隔藥餅灸組、艾灸加西藥組,每組8只。

1.2.2 給藥方法 1)造模結(jié)束后第28天起,隔藥餅灸組小鼠在關(guān)元穴進(jìn)行隔藥餅灸,1次/d,每只灸4壯/次,持續(xù)時間約15 min,連續(xù)14 d。2)造模結(jié)束后第28天起,艾灸加西藥組先給予達(dá)那唑混懸液(以36 mg/kg給藥)灌胃,而后再在關(guān)元穴隔藥餅灸,1次/d,每只4壯/次,連續(xù)14 d。3)造模結(jié)束后第28天起,西藥組每天給予達(dá)那唑混懸液(以36 mg/kg給藥)灌胃,連續(xù)14 d。4)造模結(jié)束后第28天起,正常組和模型組均給予等容積的生理鹽水灌胃,連續(xù)14 d。

1.2.3 取材 末次治療24 h后,在無菌條件下開腹,暴露腹腔后找到并分離出異位子宮內(nèi)膜組織,使用磷酸鹽緩沖溶液(Phosphate Buffered Saline,PBS)緩沖液清洗后,存于-80 ℃冰箱用于后續(xù)蛋白質(zhì)印跡法(Western Blotting)實驗檢測。

1.2.4 檢測指標(biāo)與方法

1.2.4.1 小鼠扭體反應(yīng) 自治療第8天起,每次治療結(jié)束1 h后,通過對小鼠注射2個單位縮宮素后觀察并記錄30 min內(nèi)小鼠扭體反應(yīng)的次數(shù)。小鼠扭體反應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)為:小鼠軀干伸展,腹部雙側(cè)向內(nèi)凹同時收縮,一側(cè)后肢與臀部發(fā)生內(nèi)旋[6]。

1.2.4.2 小鼠子宮異位組織(囊泡)體積及其抑制率 造模4周后,在無菌條件下開腹,用游標(biāo)卡測量并記錄異位內(nèi)膜(囊泡)的體積長(mm)×寬(mm)×高(mm);末次治療24 h后,麻醉小鼠后逐層開腹,觀察異位子宮組織(囊泡)形態(tài)及大小并測量其長、寬、高(mm),計算其體積及抑制率[7]:異位內(nèi)膜組織(囊泡)生長抑制率=(治療前異位內(nèi)膜組織體積-治療后異位內(nèi)膜組織體積)/治療前異位內(nèi)膜組織體積×100%。

1.2.4.3 蛋白質(zhì)印跡法檢測 用酶抑制劑三聯(lián)裝提取小鼠子宮內(nèi)膜異位組織總蛋白,用蛋白質(zhì)定量試劑盒(BCA Protein Assay Kit,BCA kit)法測出其總蛋白濃度。采用蛋白質(zhì)印跡法,經(jīng)電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉后加入PI3K、AKT、mTOR、甘油醛-3-磷酸脫氫酶(Glyceraldehyde-3-phosphate Dehydrogenase,GAPDH)一抗孵育(1∶1 000)過夜后,再洗膜后繼續(xù)二抗孵育(1∶2 000)2 h,再進(jìn)行洗膜、曝光顯影、定影,分析蛋白表達(dá)水平。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠扭體反應(yīng)結(jié)果 與正常組比較,模型組、西藥組、隔藥餅灸組、艾灸加西藥組小鼠扭體反應(yīng)次數(shù)增多,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01);與模型組比較,西藥組、隔藥餅灸組、艾灸加西藥組小鼠扭體反應(yīng)次數(shù)低于模型組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);與西藥組比較,隔藥餅組、艾灸加西藥組小鼠扭體反應(yīng)次數(shù)減少,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

表1 各組小鼠扭體反應(yīng)結(jié)果次,n=8)

2.2 各組小鼠生長抑制率和異位組織體積比較 西藥、隔藥餅灸、艾灸加西藥均可以縮小囊泡生長體積,隔藥餅灸組與艾灸加西藥組小鼠囊泡生長抑制率低于西藥組小鼠;與模型組比較,西藥組、隔藥餅灸組、艾灸加西藥組小鼠治療后異位子宮組織體積均減小(均P<0.05);與西藥組比較,隔藥餅灸組和艾灸加西藥組小鼠治療后異位子宮組織體積均減小(P<0.05);隔藥餅灸組小鼠與艾灸加西藥組比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表2,圖1。

圖1 各組小鼠囊泡大小比較

表2 各組小鼠生長抑制率和異位子宮組織體積比較

2.3 各組小鼠子宮PI3K/AKT/mTOR表達(dá)比較 與正常組比較,模型組小鼠異位內(nèi)膜組織中的PI3K、AKT、mTOR表達(dá)增高,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05);與模型組比較,西藥組、隔藥餅灸組、艾灸加西藥組小鼠異位內(nèi)膜組織中的PI3K、AKT、mTOR表達(dá)均下降,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05);與西藥組比較,艾灸加西藥組、隔藥餅灸組小鼠異位內(nèi)膜組織中的PI3K、AKT、mTOR表達(dá)均下降,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05);與隔藥餅灸組比較,艾灸加西藥組小鼠異位內(nèi)膜組織中的PI3K、AKT、mTOR表達(dá)均下降(均P<0.05)。見表3,圖2。

圖2 各組小鼠異位子宮PI3K/AKT/mTOR電泳條帶

表3 各組小鼠子宮PI3K/AKT/mTOR表達(dá)比較

3 討論

EMT是婦科常見病,其主要表現(xiàn)為進(jìn)行性持續(xù)加重的經(jīng)期腹痛、慢性盆腔痛、不孕癥等。研究表明,周期性痛經(jīng)可使女性產(chǎn)生焦慮、抑郁等負(fù)面情緒,影響患者身心健康,給患者日常生活及工作帶來困擾[8-10]。

根據(jù)EMT病因及臨床表現(xiàn),在中醫(yī)學(xué)中可將其歸屬于“痛經(jīng)”“月經(jīng)不調(diào)”等范疇[11]。隔藥餅灸作為隔物灸中較為常見的一種類型,具有鮮明的中醫(yī)治療優(yōu)勢[12-13],一方面能發(fā)揮灸的作用,另一方面通過皮膚組織對藥物的進(jìn)一步吸收從而發(fā)揮其藥理效應(yīng),充分發(fā)揮了艾灸與藥物和穴位之間多重相互作用。雖然目前灸法的作用機制尚不明確,有研究表明隔藥餅灸可抑制EMT血管的異常增生[14],并且可以影響EMT裸鼠異位內(nèi)膜組織微RNA(miRNA)的表達(dá),揭示了隔藥餅灸的作用機制[15-16]。研究發(fā)現(xiàn)針灸治療EMT主要取穴為關(guān)元、三陰交等,以任脈、足太陰脾經(jīng)為主[17]。前期文獻(xiàn)研究發(fā)現(xiàn)針灸治療EMT的療效優(yōu)于中、西藥組;在痛經(jīng)視覺模擬評分法評分方面,針灸效果更佳[18]?！夺t(yī)宗金鑒·刺灸心法要訣》中有:“關(guān)元補虛瀉濁遺。”關(guān)元穴是任脈上重要的穴位,具有培腎固本、補氣回陽的功效,也是臨床治療痛經(jīng)的常用穴之一。楊東霞等[19]、李茜[20]的研究發(fā)現(xiàn)近年來通過艾灸關(guān)元穴等治療EMT療效優(yōu)于其他治療方法,并且散結(jié)止痛、活血化瘀效果明顯。在隔藥餅灸中,藥餅的主要成分有附子、肉桂、紅花、丹參、木香等。其中附子、肉桂善于補火助陽、回陽救逆、散寒止痛、溫通經(jīng)脈,紅花、丹參善于活血通經(jīng)、散瘀止痛,木香可以行氣止痛等。雖然目前尚不能明確隔藥餅灸的作用機制,但在藥餅灸及穴位刺激的共同作用下,EMT模型小鼠扭體次數(shù)顯著低于模型組,證明在關(guān)元穴上進(jìn)行隔藥餅灸治療能夠有效緩解EMT小鼠疼痛癥狀,具有良好的鎮(zhèn)痛效果。

EMT的發(fā)病機制目前尚不明確,但有研究表明相關(guān)信號通路的異常激活以及多細(xì)胞因子的共同作用都會影響異位內(nèi)膜的黏附、侵襲,血管生成及凋亡[14,21-22]。PI3K/AKT/mTOR是EMT發(fā)病中的一條關(guān)鍵信號通路[23],廣泛存在于細(xì)胞中,具有調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長、增殖、凋亡的作用。在EMT中,當(dāng)炎癥介質(zhì)刺激細(xì)胞后,活化細(xì)胞內(nèi)的PI3K且磷酸化蛋白活化AKT[24];被激活后的PI3K-AKT通過磷酸化進(jìn)一步將活化mTOR,mTOR受p-AKT調(diào)控,作為其下游靶蛋白,活化后的mTOR能促進(jìn)細(xì)胞的生長、增殖及凋亡[25]。LIU等[26]研究發(fā)現(xiàn)抑制PI3K/AKT/mTOR信號通路可以緩解EMT模型大鼠坐骨神經(jīng)痛癥狀。梁莉等[27]研究發(fā)現(xiàn)EMT痛經(jīng)大鼠異位內(nèi)膜組織PI3K-AKT信號通路相關(guān)基因蛋白PI3K、AKT水平與異位內(nèi)膜生長正相關(guān)。

通過測定各組小鼠異位內(nèi)膜組織中的PI3K、AKT及mTOR表達(dá)水平,以及異位內(nèi)膜組織體積觀察比較,本研究認(rèn)為EMT的異位內(nèi)膜生長與組織中PI3K、AKT及mTOR蛋白高表達(dá)相關(guān),而隔藥餅灸組的PI3K、AKT及mTOR蛋白水平降低更為顯著,推測在關(guān)元穴上進(jìn)行隔藥餅灸應(yīng)該能夠有效抑制EMs模型小鼠異位內(nèi)膜組織中PI3K、AKT及mTOR的表達(dá),從而抑制PI3K/AKT/mTOR信號通路激活,緩解小鼠痛經(jīng)癥狀,對EMT起到正向的治療作用。

綜上所述,從行為學(xué)角度,通過小鼠扭體反減少,觀察到隔藥餅灸對于EMT的痛經(jīng)癥狀具有良好的鎮(zhèn)痛作用。從形態(tài)學(xué)角度觀測到囊泡體積的減小及生長抑制率的降低證明隔藥餅灸對于EMT小鼠異位病灶的生成具有抑制作用。從分子水平角度,在進(jìn)行隔藥餅灸治療后,PI3K、AKT表達(dá)水平降低,進(jìn)而抑制PI3K/AKT/mTOR信號通路、抑制PI3K及AKT進(jìn)一步磷酸化,弱化mTOR的激活,從分子層面證明隔藥餅灸對于EMT模型小鼠是有效的。因此,我們推測在關(guān)元穴實施隔藥餅灸,可以減輕疼痛烈度并抑制囊泡生長,其作用機制可能與抑制PI3K/AKT/mTOR信號通路中關(guān)鍵蛋白PI3K、AKT及mTOR的表達(dá)有關(guān)。

利益沖突聲明:無。