郭利,任夢雪,侯梓桐,陳紫薇,周琳,陳瑞雪

中國中醫(yī)科學(xué)院廣安門醫(yī)院,北京 100053

復(fù)發(fā)性流產(chǎn)(recurrent spontaneous abortion,RSA)是指與同一性伴侶發(fā)生兩次及以上孕24周內(nèi)的妊娠丟失[1],困擾著1%～5%的育齡期女性[2]。RSA與多種因素相關(guān),但臨床上仍約50%的患者病因不明[3],臨床診療棘手,是目前生殖醫(yī)學(xué)亟待解決的熱點難題之一。研究表明,既往多次流產(chǎn)史是產(chǎn)科并發(fā)癥的高危因素,RSA患者具有更高罹患心血管疾病、靜脈血栓栓塞性疾病的風(fēng)險,甚至與過早死亡存在相關(guān)性[4-5],因此防治RSA具有重要的臨床和社會意義。中醫(yī)學(xué)將RSA歸屬于“滑胎”“數(shù)墮胎”“屢孕屢墮”等范疇,認(rèn)為母體沖任損傷、胎元不固是其主要病機(jī),臨床多從腎虛、脾腎虛弱、氣血兩虛、血熱和血瘀等角度論治[6]。基于“治未病”和“預(yù)培其損”理念,中醫(yī)藥通過孕前干預(yù)在提高RSA患者再次妊娠率和保胎成功率方面具有顯著而獨特的優(yōu)勢。四物湯出自《仙授理傷續(xù)斷秘方》,由熟地黃、當(dāng)歸、白芍、川芎組成,功專補(bǔ)血養(yǎng)血活血,為婦科調(diào)經(jīng)、種子的基礎(chǔ)方,被譽(yù)為“補(bǔ)血第一方”“婦科第一方”。導(dǎo)師陳瑞雪教授長期從事RSA相關(guān)臨床研究,常以氣血立論,擅長以四物湯為基礎(chǔ)方加減防治RSA,臨床療效顯著[7],但其作用機(jī)制尚不明確,臨床推廣應(yīng)用較為局限。本文通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對接探討四物湯治療RSA的活性成分、核心靶點及信號通路,初步揭示其內(nèi)在機(jī)理,為進(jìn)一步實驗研究指明方向。

1 資料與方法

1.1 搜集四物湯活性成分及作用靶點在中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺(traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform,TCMSP,http://tcmspw.com/tcmsp.php)中檢索熟地黃、當(dāng)歸、白芍、川芎的化學(xué)成分,并設(shè)置口服生物利用度(oral bioavailability,OB)≥30%、類藥性指數(shù)(drug-likeness,DL)≥0.18,搜集有效活性成分及作用靶點,再通過Cytoscape3.9.0繪制四物湯“活性成分-作用靶點”網(wǎng)絡(luò)圖。

1.2 篩選RSA相關(guān)靶點及四物湯治療RSA的潛在靶點在線人類孟德爾遺傳數(shù)據(jù)庫(online mendelian inheritance in man,OMIM,https://www.omim.org)和Genecards(https://www.genecards.org)數(shù)據(jù)庫中檢索“recurrent spontaneous abortion” “RSA”等關(guān)鍵詞獲取疾病靶點,其中Genecards數(shù)據(jù)庫靶點篩選條件為Score值大于中位數(shù),將兩個數(shù)據(jù)庫檢索結(jié)果合并去重得到RSA相關(guān)靶點。將RSA相關(guān)靶點與四物湯活性成分相關(guān)靶點導(dǎo)入Venn Diagram,獲得四物湯與RSA的共同靶點,即為四物湯治療RSA的潛在靶點。

1.3 構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)在STRING數(shù)據(jù)庫(https://string-db.org)中設(shè)定“Homo Sapiens”“medium confidence>0.4”,構(gòu)建共同靶點的PPI網(wǎng)絡(luò),再通過CytoScape3.9.0可視化展示并篩選核心靶點。

1.4 富集分析將共同靶點導(dǎo)入DAVID數(shù)據(jù)庫(https://david.ncifcrf.gov/)進(jìn)行基因本體(gene ontology,GO)富集分析和京都基因與基因組百科全書(kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG)信號通路富集分析,通過微生信平臺(http://www.bioinformatics.com.cn/)以氣泡圖形式展示結(jié)果。

1.5 分子對接通過PubChem數(shù)據(jù)庫(http://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov)獲取主要活性成分的3D結(jié)構(gòu)式,并運用Open Babel軟件將其轉(zhuǎn)化為mol2格式。在PDB數(shù)據(jù)庫(https://www.rcsb.org)下載關(guān)鍵靶點蛋白結(jié)構(gòu)式,并運用Pymol、AutoDock Tools1.5.7軟件處理蛋白,最后使用AutoDock4進(jìn)行分子對接,Pymol軟件將對接結(jié)果可視化。

2 結(jié)果

2.1 四物湯活性成分及作用靶點基于TCMSP獲得四物湯活性成分24個,對應(yīng)242個作用靶點,合并去重后活性成分共20個,作用靶點103個,見表1。將結(jié)果導(dǎo)入Cytoscape3.9.0軟件,繪制四物湯“活性成分-作用靶點”網(wǎng)絡(luò)圖,見圖1,該網(wǎng)絡(luò)由121個節(jié)點和260條邊組成。根據(jù)Network Analyzer計算Degree值,排名前6位的活性成分為β-谷甾醇、豆甾醇、山柰酚、楊梅素、谷甾醇、(+)-兒茶素,見表2。

注:圓形為藥材;六邊形為活性成分,其中A1、B1、C1為共有成分;菱形為作用靶點;SDH:熟地黃;DG:當(dāng)歸;BS:白芍;CX:川芎。

表1 四物湯組方中藥活性成分及作用靶點數(shù)目

表2 四物湯排名前6位的活性成分

2.2 RSA相關(guān)靶點從Genecards數(shù)據(jù)庫檢索出 2 481 個RSA靶點,其中Score值中位數(shù)為3.01,故篩選分值大于3.01的靶點與OMIM數(shù)據(jù)庫篩選的靶點合并去重,最終獲取1539個RSA相關(guān)靶點。通過Venn Diagram共獲得64個共同靶點,見圖2。

圖2 四物湯與RSA靶點韋恩圖

2.3 共同靶點PPI網(wǎng)絡(luò)將 64個共同靶點導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫獲取PPI信息,再運用CytoScape 3.9.0進(jìn)行可視化,見圖3,圖中的64個節(jié)點代表蛋白質(zhì),516條邊代表蛋白質(zhì)之間的相互作用關(guān)系。根據(jù)Network Analyzer共獲得12個核心靶點,以柱狀圖可視化展示,見圖4。

圖3 共同靶點PPI網(wǎng)絡(luò)圖

圖4 PPI核心靶點

2.4 GO和KEGG富集分析運用DAVID數(shù)據(jù)庫進(jìn)行GO和KEGG富集分析。GO功能富集分析共獲得283個生物過程(biological processes,BP)、32個細(xì)胞組分(cellular components,CC)及74個分子功能(molecular functions,MF)。其中BP主要涉及調(diào)節(jié)細(xì)胞對多種化合物的應(yīng)答,如雌二醇(response to estradiol)、脂多糖(response to lipopolysaccharide)、腫瘤壞死因子(response to tumor necrosis factor)等,調(diào)控平滑肌細(xì)胞的增殖(positive regulation of smooth muscle cell proliferation)及血管生成(angiogenesis)等;CC主要涉及膜筏(membrane raft)、膜腔(caveola)、細(xì)胞外間隙(extracellular space)等;MF在酶結(jié)合(enzyme binding)、蛋白質(zhì)結(jié)合(protein binding)、類固醇結(jié)合(steroid binding)等方面較為顯著。KEGG富集分析共獲得88條信號通路,主要涉及癌癥(pathways in cancer)、乙型肝炎(hepatitis B)、結(jié)核(tuberculosis)、腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor,TNF)信號通路等,而血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)、細(xì)胞凋亡(apoptosis)、缺氧誘導(dǎo)因子(hypoxia inducible factor,HIF)、Toll樣受體(Toll-like receptor)等信號通路也表現(xiàn)出較高的顯著性。最后通過微生信平臺將結(jié)果可視化處理,見圖5—圖8。

圖5 GO功能富集分析(BP)

圖6 GO功能富集分析(CC)

圖7 GO功能富集分析(MF)

圖8 KEGG信號通路富集分析

2.5 分子對接通過VLOOKUP函數(shù)將四物湯活性成分及作用靶點與共同靶點相對應(yīng),以獲取四物湯關(guān)鍵活性成分,排名前4位的活性成分為山柰酚、β-谷甾醇、楊梅素、豆甾醇。將PPI核心靶點中排名前6位的靶點蛋白白細(xì)胞介素-6(interleukin-6,IL-6)(1ALU)、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)(7JRA)、蛋白激酶1(protein kinase1,AKT1)(4GV1)、雌激素受體1(estrogen receptor 1,ESR1)(1GWQ)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(cysteinyl aspartate specific proteinase 3,CASP3)(5IBP)、前列腺素內(nèi)過氧化物合成酶2(prostaglandin-endoperoxide synthase 2,PTGS2)(5KIR)分別與4個關(guān)鍵活性成分進(jìn)行分子對接,以考察四物湯治療RSA的活性成分與關(guān)鍵靶點之間的結(jié)合模式及結(jié)合能力強(qiáng)弱。分子對接顯示,除CASP3與山柰酚外,活性成分與關(guān)鍵靶點之間的結(jié)合能均<-5 kcal·mol-1,表明兩者結(jié)合活性較好[8],見表3。其中,TNF與 β-谷甾醇、PTGS2與豆甾醇的結(jié)合活性尤為突出,IL-6與山柰酚形成氫鍵最多,用Pymol軟件將其對接結(jié)果可視化,見圖9。

圖9 四物湯活性成分與部分關(guān)鍵靶點對接模式圖

表3 分子對接結(jié)合能 (kcal·mol-1)

3 討論

《景岳全書·婦人規(guī)》云:“婦人所重者在血,血能構(gòu)精,胎孕乃成”[9],《傅青主女科》載:“精滿則子宮易于攝精,血足則子宮易于容物”[10],皆強(qiáng)調(diào)精血充足是正常妊娠的必要條件。婦人以血為本,精血同源,RSA患者屢孕屢墮往往耗傷腎精而致陰血不足。加之患者多伴焦慮、抑郁情緒,肝失疏泄,日久化火而暗耗陰血,陰血愈加不足,因此補(bǔ)血養(yǎng)血是治療RSA的重要思路。四物湯是補(bǔ)血養(yǎng)血兼活血行血的經(jīng)典方劑,方中熟地黃大補(bǔ)肝腎精血;當(dāng)歸養(yǎng)血調(diào)經(jīng),還可補(bǔ)血活血,為婦科調(diào)經(jīng)要藥;白芍酸斂,可柔肝養(yǎng)肝,充養(yǎng)女子之先天;川芎活血祛瘀,行氣止痛,為血中氣藥。諸藥合用,使補(bǔ)血而不滋膩,行氣而不傷血,臨床以四物湯組方治療婦科類疾病療效顯著。清代醫(yī)家汪昂云:“凡血證,通宜四物湯”[11]。

為探究四物湯治療RSA的潛在作用機(jī)制,本文運用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)技術(shù)共獲取四物湯活性成分20個,治療RSA的靶點64個,并篩選出β-谷甾醇、山柰酚、豆甾醇、楊梅素等關(guān)鍵活性成分,表明四物湯可能是通過這些活性成分對RSA發(fā)揮治療作用。β-谷甾醇可通過下調(diào)Toll樣受體4(Toll-like receptor 4,TLR4)、髓樣分化因子88(myeloid differentiation factor 88,MyD88)、IL-1受體關(guān)聯(lián)激酶1(IL-1 receptor associated kinase 1,IRAK1)的表達(dá),抑制炎癥信號通路關(guān)鍵分子的活化,減少分泌IL-6、TNF-α等炎性因子,起到抗炎作用[12]。山柰酚作為黃酮類化合物,其作用涉及抗炎、抗氧化、保護(hù)損傷組織等[13]。豆甾醇具有較強(qiáng)的抗氧化作用,還可能通過調(diào)控雌激素信號通路上絲裂原活化蛋白激酶3(mitogen-activated protein kinase 3,MAPK3)等表達(dá),減少炎癥反應(yīng)[14]。楊梅素具有抗氧化、抑制炎癥因子等作用,還可拮抗血小板活化因子,從而改善微循環(huán),保護(hù)血管[15]。

通過PPI網(wǎng)絡(luò)可以發(fā)現(xiàn)IL-6、TNF、AKT1、ESR1、CASP3、PTGS2等是四物湯治療RSA的核心靶點,表明四物湯可能通過這些蛋白質(zhì)保護(hù)妊娠。IL-6主要參與調(diào)節(jié)胚胎發(fā)育和妊娠過程中母胎界面免疫耐受功能[16],過低的IL-6不利于胎盤血管生成可致流產(chǎn)[17]。TNF可通過促進(jìn)滋養(yǎng)細(xì)胞凋亡、興奮子宮平滑肌收縮、激活機(jī)體凝血系統(tǒng)、激發(fā)母體與胚胎組織免疫排斥等導(dǎo)致流產(chǎn)發(fā)生[18]。研究表明,RSA患者血清組織呈現(xiàn)IL-6減少、TNF-α升高的特點[19]。AKT1主要參與血管生成、血管擴(kuò)張和血管重構(gòu)過程,可通過調(diào)節(jié)磷脂酰肌醇3激酶(phosphatidylinositol 3 kinase,PI3K)/AKT1信號通路促進(jìn)母胎界面血管生成,降低流產(chǎn)率[20]。ESR1基因突變可通過改變血清雌激素水平影響妊娠,可能是URSA發(fā)病機(jī)制之一[21]。CASP3可通過促進(jìn)滋養(yǎng)層細(xì)胞中的細(xì)胞凋亡導(dǎo)致RSA發(fā)生和發(fā)展[22]。PTGS2負(fù)責(zé)誘導(dǎo)產(chǎn)生前列腺素,而前列腺素可通過多種細(xì)胞過程促進(jìn)母體免疫耐受,影響妊娠進(jìn)程[23]。

對核心靶點進(jìn)行GO功能富集分析發(fā)現(xiàn),四物湯主要通過調(diào)節(jié)細(xì)胞應(yīng)答、基因轉(zhuǎn)錄,調(diào)控平滑肌細(xì)胞的增殖及血管生成等生物過程對RSA發(fā)揮治療作用。KEGG信號通路分析顯示核心靶點參與的通路主要涉及RSA發(fā)病機(jī)制中的TNF、VEGF、HIF-1、Toll樣受體等信號通路。VEGF可促進(jìn)微血管通透性和血管生成,其表達(dá)下調(diào)與RSA關(guān)系密切[24]。HIF-1α能調(diào)節(jié)多種基因的表達(dá),與血管形成、細(xì)胞凋亡等多種生物學(xué)效應(yīng)相關(guān),參與子宮內(nèi)膜蛻膜化過程的調(diào)節(jié),維持正常妊娠[25]。動物研究顯示,RSA模型小鼠中HIF-1αmRNA及蛋白表達(dá)水平均下降[26]。Toll受體主要表達(dá)于免疫細(xì)胞,參與機(jī)體免疫反應(yīng),其異常表達(dá)可誘發(fā)母胎界面免疫排斥反應(yīng),導(dǎo)致反復(fù)妊娠丟失。研究發(fā)現(xiàn),RSA患者蛻膜和血清組織中均存在TLR4高表達(dá)[27]。分子對接結(jié)果表明,四物湯關(guān)鍵活性成分山柰酚、β-谷甾醇、楊梅素、豆甾醇與核心靶點IL-6、TNF、AKT1、ESR1、CASP3、PTGS2的結(jié)合活性基本良好,在分子層面進(jìn)一步驗證了四物湯治療RSA的潛在作用機(jī)制。

本研究結(jié)果提示,四物湯可能通過山柰酚、β-谷甾醇、楊梅素、豆甾醇等活性成分與IL-6、TNF、AKT1、ESR1、CASP3、PTGS2等核心靶點發(fā)生相互作用,通過調(diào)控TNF、VEGF、HIF-1、Toll樣受體等多種信號通路,調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡與炎癥反應(yīng)、改善母胎界面免疫微環(huán)境以及促進(jìn)血管生成,從而改善不良妊娠結(jié)局,提高妊娠成功率。但本研究結(jié)果是以分子大數(shù)據(jù)為基礎(chǔ)的分子機(jī)制的探討,今后尚需通過設(shè)計嚴(yán)謹(jǐn)?shù)膶嶒烌炞C,以提高結(jié)論的科學(xué)性和準(zhǔn)確性。