桑繼亮,馬江濤

1.開封市第二中醫(yī)院,河南 開封 475000; 2.河南省洛陽正骨醫(yī)院,河南省骨科醫(yī)院,河南 鄭州 450003

骨質(zhì)疏松癥(osteoporosis,OP),是一種骨形成與骨吸收動態(tài)平衡紊亂的代謝性骨病,其特征是骨量降低、骨微結(jié)構(gòu)破壞和骨脆性增加,由此引發(fā)的脆性骨折或骨質(zhì)疏松性骨折(osteoporotic fracture,OPF)不僅導(dǎo)致橈骨遠端、腰椎和股骨頸骨折,還給家庭和社會帶來沉重的心理負擔和經(jīng)濟負擔[1]。中國骨質(zhì)疏松癥流行病學調(diào)查報告指出,我國50歲以上人群OP患病率為19.2%,男女比例為15;65歲以上人群OP患病率為32.0%,男女比例為15[2]。肌少癥(sarcopenia,SP)是以肌力、肌量和肌肉功能的漸進性和全身性下降為特征的全身性肌肉疾病,SP引起患者跌倒、骨折、住院、致殘和致死風險增加。由于SP診斷標準不一,其發(fā)病率范圍為8.55%～36.50%[3]。OP常常合并SP,到底是OP引起SP,還是SP引起OP,或者兩者同時發(fā)病,目前尚無定論。目前,國內(nèi)外學者已開始關(guān)注骨質(zhì)疏松合并肌少癥,即肌少-骨質(zhì)疏松癥(osteosarcopenia,OS),然而受限于缺乏成熟的體內(nèi)模型,本病的基礎(chǔ)研究一直無法廣泛開展。去勢模型(ovariectomy,OVX)是國內(nèi)外研究絕經(jīng)后OP的“金標準”,也是FDA和WHO推薦的研究絕經(jīng)后OP的最佳模型,已被廣泛應(yīng)用[4-5]。眾多研究表明,骨質(zhì)疏松和肌萎縮之間存在復(fù)雜聯(lián)系[6-9],廢用性O(shè)P模型也表現(xiàn)出肌萎縮[10-11]。然而去勢模型除了骨質(zhì)疏松,是否也能出現(xiàn)肌萎縮目前尚不清楚。本研究通過構(gòu)建大鼠去勢模型并進行藥物干預(yù),研究去勢對大鼠骨骼和肌肉的影響,以及肌骨寧對去勢大鼠骨質(zhì)疏松及肌萎縮的保護作用。

1 材料

1.1 動物SPF級6月齡雌性SD大鼠60只,體質(zhì)量300～350 g,購于河南省實驗動物中心,動物合格證號:SCXK(豫)2017-0001。動物實驗方案經(jīng)河南省洛陽正骨醫(yī)院動物實驗倫理委員會批準(批準號:KY2021-003-01)。大鼠于SPF級實驗室飼養(yǎng),溫度(23±3)℃,濕度(50±10)%,每天光照 12 h,喂食普通飼料及無菌用水。

1.2 藥品和試劑肌骨寧(杜仲、菟絲子、黃芪、丹參、甘草)水煎劑由河南省洛陽正骨醫(yī)院中藥房提供;戊酸雌二醇片(拜耳醫(yī)藥保健有限公司,批號:國藥準字J20171038,規(guī)格:1 mg);氯化鈉注射液(廣西裕源藥業(yè)有限公司,批號:國藥準字H19010205);注射用青霉素鈉(山東魯抗醫(yī)藥股份有限公司,批號:國藥準字H37020080)。40 ng·L-1多聚甲醛(蘭杰柯科技有限公司,貨號:BL539A);無水乙醇(上?？泼鸦瘜W科技有限公司,貨號:C007983);新型脫鈣液(北京索萊寶科技有限公司,貨號:E1171);蘇木素伊紅染液(上海碧云天生物技術(shù)有限公司,貨號:C0105M);大鼠血清堿性磷酸酶(alkaline phosphatase,AKP)ELISA檢測試劑盒(上海滬鼎生物,貨號:D-30037);大鼠血清I型前膠原氨基端肽(type I procollagen amino terminal peptide,PINP)、I型膠原交聯(lián)羧基末端肽(type I collagen cross-linked carboxy terminal peptide,β-CTx)、胰島素樣生長因子1(insulin-like growth factor 1,IGF-1)、雌二醇(estradiol,E2)ELISA檢測試劑盒(武漢酶免生物科技有限公司,貨號:MM-20710R1、MM-20172R1、MM-0197R1、MM-0575R1)。

1.3 儀器BSA124S型分析天平(德國賽多利斯集團);YLS-13A型大小鼠抓力測定儀(濟南益延科技發(fā)展有限公司);Discovery A型雙能X線骨密度儀(美國Hologic公司);micro CT儀(瑞士Scanco Medical公司);JJ-12J型脫水機、JB-P5型包埋機(武漢俊杰電子有限公司);RM2016型病理切片機(上海徠卡儀器有限公司);KD-P型組織攤片機(浙江省金華市科迪儀器設(shè)備有限公司);CX43型正置熒光顯微鏡(日本奧林巴斯公司)。

2 方法

2.1 動物分組、造模及給藥60只雌性SPF級SD大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后,按隨機數(shù)字表法分為正常組、假手術(shù)組、模型組、肌骨寧組和雌激素組。除正常組及假手術(shù)組外,其余大鼠采用去勢法切除雙側(cè)卵巢,假手術(shù)組切除卵巢附近等量脂肪組織,逐層縫合肌肉和皮膚,術(shù)后每只大鼠肌肉注射青霉素鈉8萬單位,每天1次,連續(xù)3 d。造模3個月后,進行藥物干預(yù),給藥劑量按照人與大鼠體表面積折算,肌骨寧給藥劑量為2.083 g·kg-1·d-1,雌二醇給藥劑量為0.104 mg·kg-1·d-1,即肌骨寧組大鼠每天灌胃給予2.083 g·kg-1肌骨寧水煎劑,雌激素組大鼠每天灌胃0.104 mg·kg-1雌二醇溶液,其余組大鼠每天灌胃等體積的生理鹽水,灌胃體積為 10 mL·kg-1,連續(xù)灌胃3個月。

2.2 大鼠抓力檢測分別在造模前、用藥前和取材前測量大鼠前爪抓力。使用大小鼠抓力儀每周定時測量大鼠前爪抓力(forelimb grip strength)。測試前讓大鼠在抓力儀上適應(yīng)3 min,然后快速抓住鼠尾,待大鼠前爪抓牢后,沿鼠尾輕輕地水平向后拉,使后肢懸空,連續(xù)測量3次,記錄儀器最大抓力讀數(shù),用三次抓力的平均值反映前爪肌肉力量。

2.3 取材及相關(guān)臟器質(zhì)量檢測麻醉大鼠后,腹主動脈采血,離心機分離血清,超低溫冰箱凍存。完整分離左側(cè)股骨、腓腸肌、比目魚肌、子宮、肝臟和腎臟等組織,剔除周圍組織,預(yù)冷PBS漂洗,吸水紙吸去表面水分,分析天平分別稱取子宮、肝臟和腎臟的質(zhì)量。稱質(zhì)量后放入10 mL離心管中,多聚甲醛固定。

2.4 雙能X線骨密度儀檢測麻醉大鼠后,用雙能X線骨密度儀“小動物”模式中“大鼠全身”和“區(qū)域高分辨率”分別測量大鼠全身骨密度(bone mineral density,BMD)、股骨BMD、瘦肉量、脂肪量、骨礦量和四肢瘦肉量等,計算大鼠全身骨礦含量(全身骨礦含量/體質(zhì)量,bone mineral content,BMC)和脂肪含量百分比(全身脂肪含量/體質(zhì)量,fat content,FAT)。根據(jù)多個肌少癥工作組制訂的標準[12-15],計算大鼠骨骼肌質(zhì)量指數(shù)(全身骨骼肌量/體質(zhì)量,skeletal mass index,SMI)和相對骨骼肌質(zhì)量指數(shù)(四肢骨骼肌量/體質(zhì)量,RSMI)。

2.5 micro CT檢測對離體股骨進行micro CT掃描,掃描條件設(shè)定為電壓80 KV,電流100 μA,掃描厚度為14 μm。通過儀器自帶分析軟件(CTAn)框取松質(zhì)骨,選擇股骨遠端生長板上方1 mm的松質(zhì)骨作為感興趣區(qū),分析骨體積分數(shù)(bone volume fraction,BV/TV)、骨表面密度(bone surface density,BS/TV)、骨小梁厚度(trabecular thickness,Tb.Th)、骨小梁數(shù)(trabecular number,Tb.N)和骨小梁分離度(trabecular separation,Tb.Sp),并通過儀器自帶分析軟件(CTvox)重構(gòu)股骨遠端三維圖像。

2.6 大鼠血清學檢測根據(jù)ELISA試劑盒說明,采用ELISA法檢測大鼠血清AKP、PINP、β-CTx、IGF-1、E2含量。

2.7 病理染色股骨遠端和腓腸肌先后進行HE染色,顯微鏡下觀察股骨遠端和腓腸肌的病理變化。

3 結(jié)果

3.1 各組大鼠一般情況比較實驗過程中,假手術(shù)組大鼠因術(shù)后傷口感染死亡1只,肌骨寧組大鼠因灌胃刺傷呼吸道死亡2只,最終納入研究的動物數(shù)量為57只。各組大鼠行為活動正常,毛發(fā)光澤干凈,飲食飲水正常,分泌物及二便正常。

3.2 各組大鼠子宮、肝臟和腎臟質(zhì)量比較對各組大鼠的子宮、肝臟和腎臟質(zhì)量檢測發(fā)現(xiàn),模型組、肌骨寧組和雌激素組大鼠的子宮質(zhì)量較正常組和假手術(shù)組降低,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05);而各組肝臟、腎臟質(zhì)量無明顯變化,表明去勢可顯著引起大鼠子宮萎縮,而對肝臟和腎臟無影響,證明模型構(gòu)建成功。見圖1。

注:A:肝臟質(zhì)量比較;B:腎臟質(zhì)量比較;C:子宮質(zhì)量比較;與正常組比較,aP<0.05;與假手術(shù)組比較,bP<0.05;與模型組比較,cP<0.05。

3.3 各組大鼠體成分比較與正常組和假手術(shù)組比較,模型組大鼠的BMC下降,FAT增加,差異均具有統(tǒng)計學意義(P<0.05),表明去勢可引起大鼠骨礦含量下降,脂肪含量增加。與模型組比較,肌骨寧和雌激素可增加去勢大鼠BMC,降低FAT,差異均具有統(tǒng)計學意義(P<0.05),表明肌骨寧和雌激素均可增加去勢大鼠BMC、降低FAT,調(diào)節(jié)大鼠體成分變化。見圖2。

注:A:BMC水平比較;B:FAT水平比較;與正常組比較,aP<0.05;與假手術(shù)組比較,bP<0.05;與模型組比較,cP<0.05。

3.4 各組大鼠體質(zhì)量及抓力比較分別在造模前、用藥前和取材前對各組大鼠體質(zhì)量及前爪抓力進行測量,發(fā)現(xiàn)各組大鼠體質(zhì)量差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。造模前,各組大鼠前爪抓力差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05);取材前,肌骨寧組和雌激素大鼠組的前爪抓力較模型組有增加趨勢,但差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05),表明肌骨寧和雌激素有增加去勢大鼠前爪抓力的趨勢。見圖3。

注:A:各組大鼠體質(zhì)量的連續(xù)性比較;B:各組大鼠取材前體質(zhì)量比較;C:各組大鼠前爪抓力的連續(xù)性比較;D:造模前、取材前各組大鼠前爪抓力比較。

3.5 各組大鼠骨骼肌質(zhì)量指數(shù)和相對骨骼肌質(zhì)量指數(shù)比較與假手術(shù)組比較,模型組大鼠SMI和RSMI下降,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),表明去勢可導(dǎo)致大鼠骨骼肌萎縮。與模型組比較,肌骨寧組和雌激素組大鼠SMI和RSMI增加,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),表明肌骨寧和雌激素防治去勢導(dǎo)致的大鼠骨骼肌萎縮。見圖4。

注:A:各組大鼠四肢感興趣區(qū);B:各組大鼠SMI比較;C:各組大鼠RSMI比較;與假手術(shù)組比較,bP<0.05;與模型組比較,cP<0.05。

3.6 各組大鼠骨密度比較與正常組和假手術(shù)組比較,模型組大鼠全身BMD和股骨BMD下降,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),表明去勢大鼠發(fā)生骨質(zhì)疏松。與模型組比較,肌骨寧組和雌激素組大鼠全身BMD和股骨BMD增加,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),表明肌骨寧和雌激素均可防治去勢引起的骨質(zhì)疏松。見圖5。

注:A:全身BMD水平比較;B:股骨BMD水平比較;與正常組比較,aP<0.05;與假手術(shù)組比較,bP<0.05;與模型組比較,cP<0.05。

3.7 各組大鼠股骨骨微結(jié)構(gòu)比較與正常組和假手術(shù)組比較,模型組大鼠股骨BV/TV、BS/BV、BS/TV、Tb.Th和Tb.N降低,Tb.Sp明顯增加,差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05),表明股骨遠端骨小梁稀疏,體積減小,骨小梁數(shù)目和厚度明顯下降,骨小梁分離度明顯增加,股骨遠端發(fā)生骨質(zhì)疏松。與模型組比較,肌骨寧組和雌激素組大鼠股骨BV/TV、BS/BV、BS/TV、Tb.Th和Tb.N增加,Tb.Sp下降,差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05),表明肌骨寧和雌激素明顯增加骨小梁體積、數(shù)目和厚度,減小骨小梁分離度,防治OP,這與股骨遠端三維重建結(jié)果相一致。見圖6—圖7。

注:A:BV/TV水平比較;B:BS/BV水平比較;C:BS/TV水平比較;D:Tb.Th水平比較;E:Tb.Sp水平比較;F:Tb.N水平比較;與正常組比較,aP<0.05;與假手術(shù)組比較,bP<0.05;與模型組比較,cP<0.05。

3.8 大鼠血清學檢測與正常組和假手術(shù)組比較,模型組大鼠血清骨形成標志物AKP、IGF-1和E2水平下降,骨吸收標志物β-CTx水平增加,差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05),表明去勢可抑制大鼠骨形成,促進骨吸收。與模型組比較,肌骨寧組和雌激素組大鼠血清骨形成標志物AKP、IGF-1和E2水平增加,骨吸收標志物β-CTx水平下降,差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05),表明肌骨寧和雌激素抑制去勢大鼠的骨吸收,促進骨形成,防治去勢大鼠的骨質(zhì)疏松。見圖8。

注:A:AKP水平比較;B:β-CTx水平比較;C:TGF-1水平比較;D:E2水平比較;與正常組比較,aP<0.05;與假手術(shù)組比較,bP<0.05;與模型組比較,cP<0.05;與肌骨寧組比較,dP<0.05。

3.9 各組大鼠腓腸肌和股骨病理染色比較

3.9.1 股骨HE染色與正常組和假手術(shù)組比較,模型組大鼠股骨骨小梁數(shù)量明顯減少,厚度下降,連續(xù)性中斷,分離度增加,骨髓脂肪化嚴重。與模型組比較,肌骨寧組和雌激素組大鼠股骨骨小梁數(shù)量明顯增加,厚度增加,分離度減小,骨髓脂肪化減輕,表明肌骨寧和雌激素均可防治骨質(zhì)疏松。見圖9。

圖9 各組大鼠股骨HE染色比較(×200)

3.9.2 腓腸肌HE染色與正常組和假手術(shù)組比較,模型組大鼠腓腸肌肌纖維排列紊亂,肌間隙增寬,肌纖維萎縮,肌細胞核皺縮減小。與模型組比較,肌骨寧組和雌激素組大鼠腓腸肌肌纖維排列緊密,肌間隙減小,肌纖維增粗,肌細胞核增多增大,表明肌骨寧和雌激素均可防治肌萎縮。見圖10。

圖10 各組大鼠腓腸肌HE染色比較(×200)

4 討論

中醫(yī)認為OP屬 “骨痿”“骨枯”“骨痹”等范疇,腎虛是根本,腎精充盛,骨髓充盈,則骨骼強壯有力;脾虛血瘀,運化無力,血瘀氣滯,腎精不足以充養(yǎng)骨髓,則發(fā)為本病?！把a腎健脾活血”是防治OP及OPF的主要治療原則。中醫(yī)認為SP屬 “肉痿”范疇,脾虛肉萎。脾腎虧虛,骨枯肉萎[16-19]。肌骨寧由馬江濤博士領(lǐng)銜研發(fā),從系統(tǒng)藥理學、中藥藥理學、體內(nèi)外實驗等多方面深入研究,經(jīng)過反復(fù)組方分析,研制而成。全方共五味中藥,包括杜仲、菟絲子、黃芪、丹參和甘草。針對OP“腎虛脾虛血瘀”的病機,方中杜仲、菟絲子補腎壯骨,黃芪補氣健脾,丹參補血活血,甘草調(diào)和諸藥,共湊補腎健脾活血、壯骨強肌止痛之功效。組方精簡,效果顯著,已被制成膏方廣泛用于臨床。

去勢模型是研究絕經(jīng)后OP的“金標準”,去勢引起骨質(zhì)疏松已經(jīng)毋庸置疑,然而去勢能否引起肌萎縮目前報道較少。國外學者將5月齡和10月齡的SD大鼠分成假手術(shù)組和去勢組并分別配對喂養(yǎng),發(fā)現(xiàn)10月齡的SD大鼠發(fā)生骨質(zhì)疏松和肌肉萎縮[20]。本研究表明,與正常組和假手術(shù)組比較,模型組大鼠全身BMD和股骨BMD明顯下降,股骨遠端骨小梁稀疏,數(shù)量減小,厚度下降,分離度增加,骨髓脂肪化加重,血清骨形成標志物下降,骨吸收標志物增加,表明OVX大鼠發(fā)生骨質(zhì)疏松。除了骨質(zhì)疏松,OVX大鼠也明顯發(fā)生骨骼肌萎縮。與正常組和假手術(shù)組比較,模型組大鼠SMI和RSMI明顯下降,腓腸肌肌纖維排列紊亂,肌纖維間結(jié)締組織增生,肌核明顯皺縮,肌肉脂肪化嚴重,表明OVX大鼠發(fā)生肌萎縮?？梢?去勢不僅引起大鼠骨質(zhì)疏松,而且引起大鼠肌萎縮。

目前OP治療僅限于“抗骨質(zhì)疏松”,而忽視了骨質(zhì)疏松可能伴隨肌萎縮,能否使用中藥同時防治骨質(zhì)疏松和肌萎縮呢?本研究進一步運用中藥肌骨寧干預(yù)OVX大鼠模型,明確肌骨寧對骨質(zhì)疏松和肌萎縮的防治作用。研究表明,與模型組比較,肌骨寧組和雌激素組大鼠全身BMD和股骨BMD明顯提高,股骨遠端骨小梁數(shù)量增加,厚度增加,分離度減小,骨髓脂肪化減輕,血清骨形成標志物增加,骨吸收標志物減少,提示肌骨寧和雌激素可防治去勢大鼠的骨質(zhì)疏松。除了防治骨質(zhì)疏松,肌骨寧和雌激素也能防治肌萎縮。與模型組比較,肌骨寧組和雌激素組大鼠前爪抓力有增加趨勢,SMI和RSMI明顯增加,腓腸肌肌纖維排列緊密,肌纖維間結(jié)締組織減少,肌核明顯增大,肌肉脂肪化減輕,表明肌骨寧和雌激素均可防治肌萎縮。此外,長期使用E2的副作用包括胃部不適、惡心、頭痛、體質(zhì)量增加和子宮出血,甚至會增加子宮內(nèi)膜癌的發(fā)病率。與E2比較,肌骨寧更便宜,副作用更少。因此,許多患者可能更容易接受肌骨寧?？傊?肌骨寧和E2均能有效改善OS大鼠的骨骼和肌肉表型,盡管仍需要大量高質(zhì)量的隨機對照試驗研究來驗證,但肌骨寧和E2可能是治療OS的潛在藥物。

本研究發(fā)現(xiàn)去勢引起大鼠骨質(zhì)疏松和肌萎縮,肌骨寧和雌激素均能防治骨質(zhì)疏松和肌萎縮。根據(jù)上述研究,結(jié)合國內(nèi)外報道[7,21-23],認為骨質(zhì)疏松和肌萎縮之間存在生理病理上的聯(lián)系,兩者可能有共同的調(diào)控機制。肌肉和骨骼位置毗鄰,肌肉為骨骼運動提供動力來源,骨骼為肌肉生長提供物理支撐;肌肉除牽拉刺激骨細胞生長外,還可作為內(nèi)分泌器官分泌骨因子,促進骨細胞生長;骨骼也可作為內(nèi)分泌器官分泌骨因子,刺激肌細胞增長。肌肉和骨骼在生物力學穩(wěn)態(tài)、內(nèi)分泌穩(wěn)態(tài)、基因作用等方面存在復(fù)雜深入的關(guān)系,因此研究者稱其為“肌骨串擾”[24-26]。有研究認為,GH/IGF-1/PI3K/Akt信號通路與兩者的發(fā)病密切相關(guān)[7],其中雌激素、睪酮、生長激素和IGF-1可能起到重要作用。骨質(zhì)疏松和肌萎縮患者中較低的維生素D水平可能與兩者的發(fā)病相關(guān)[27]。研究認為,骨骼肌Akt1/2基因缺失導(dǎo)致小鼠OS發(fā)病,并引起小鼠壽命縮短[28]。有研究認為,骨質(zhì)疏松和肌萎縮兩者經(jīng)常同時存在[9,29-31],稱之為OS,OS患者跌倒、骨折、住院、殘疾和死亡風險遠高于僅患骨質(zhì)疏松或肌少癥者,并且發(fā)病機制復(fù)雜。本研究也證實,合成代謝類激素IGF-1和E2在OVX大鼠模型中含量明顯變低,藥物干預(yù)后明顯增加,合成代謝類激素可能和OS的生理病理相關(guān)。

無論是骨質(zhì)疏松,還是肌萎縮,甚至是肌少—骨質(zhì)疏松癥,單單“從骨論治”已經(jīng)明顯不妥,“肌骨同治”才是最佳選擇。肌骨寧基于OP“腎虛脾虛血瘀”病機,“肌骨同治”,強肌壯骨,為骨質(zhì)疏松合并肌萎縮患者提供了中醫(yī)方案。