王林業(yè),章石楠,胡國(guó)元,石 田,李淑萍,韓生義*

(1.互助縣紅崖子鄉(xiāng)畜牧獸醫(yī)站,青海 互助 810507;2.青海大學(xué)畜牧獸醫(yī)科學(xué)院,青海省動(dòng)物疾病病原診斷與綠色防控技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,青海 西寧 810016)

傳染性胸膜肺炎、小反芻獸疫和巴氏桿菌病是藏羊養(yǎng)殖中重要的傳染病,對(duì)養(yǎng)羊行業(yè)危害極大[1]。其中,傳染性胸膜肺炎又被稱為羊支原體病,是由山羊支原體山羊亞種、絲狀支原體山羊亞種以及綿羊肺炎支原體引起的一種高度接觸性傳染病,該病的發(fā)病率和死亡率都很高[2,3],在我國(guó)大部分省份均有不同程度的流行,尤其在河北、河南和山東等地較為嚴(yán)重。此外,青藏高原、蒙新高原及其鄰近地區(qū)也是羊支原體病的高發(fā)地[4]。2006-2008年在對(duì)青海省綿羊支原體的血清學(xué)調(diào)查中發(fā)現(xiàn),青海省綿羊支原體感染率高于西部其它地區(qū)[5]。

小反芻獸疫又稱羊瘟,是由小反芻獸疫病毒引起的一種烈性傳染病,其發(fā)病率及死亡率可高達(dá)100%[6],以發(fā)燒、口腔潰瘍、胃炎、腹瀉以及肺炎為主要特征[7]。該病極易通過(guò)直接接觸、間接接觸及飛沫傳播進(jìn)行擴(kuò)散,部分病羊痊愈后其排泄物和分泌液中仍能檢測(cè)出病毒殘留[8]。小反芻獸疫于2013年首次在新疆爆發(fā),2013-2021年國(guó)內(nèi)報(bào)告了5 934例病例,發(fā)現(xiàn)疫情主要集中在東北和西北地區(qū),其中青海報(bào)告病例數(shù)占全國(guó)總病例的4.80%[9]。

羊巴氏桿菌病是由多殺性巴氏桿菌引起的一種重要傳染病,具有潛伏期短、傳播速度快、死亡率高、可呈爆發(fā)性流行等特點(diǎn),其中急性病例以敗血癥、出血性炎癥和急性死亡為主要特征,慢性病例常表現(xiàn)為肺炎、皮下結(jié)締組織和關(guān)節(jié)及臟器出現(xiàn)化膿性病灶[10]。多殺性巴氏桿菌按莢膜類型可分為A、B、D、E和F 5種血清型,國(guó)內(nèi)羊源多殺性巴氏桿菌主要以B型為主[11]。目前,青海省羊巴氏桿菌病的發(fā)病率和病原特性等流行病學(xué)特征暫無(wú)相關(guān)調(diào)查數(shù)據(jù)。

鑒于以上3種羊的重要傳染病近年來(lái)在青海省缺乏可靠的調(diào)查數(shù)據(jù),本研究采用ELISA抗體檢測(cè)方法對(duì)青海省互助縣部分藏羊養(yǎng)殖場(chǎng)開展了羊傳染性胸膜肺炎、小反芻獸疫和羊巴氏桿菌病的血清學(xué)檢測(cè)調(diào)查,旨在掌握青海省藏羊重要傳染病的流行情況,為藏羊健康養(yǎng)殖和疫病防控提供數(shù)據(jù)支持和科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品

從青海省互助縣3個(gè)藏羊養(yǎng)殖合作社采集藏羊血液樣品共計(jì)80份,于4℃條件下保存,待血清析出后,收集血清冷凍保存,待檢。

1.2 試驗(yàn)試劑

支原體ELISA抗體檢測(cè)試劑盒(哈爾濱國(guó)生生物有限公司);小反芻獸疫競(jìng)爭(zhēng)ELISA抗體檢測(cè)試劑盒(蘭州獸研生物科技有限公司);多殺性巴氏桿菌抗體(PM-Ab)ELISA科研試劑盒(江蘇酶標(biāo)生物科技有限公司)。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1羊傳染性胸膜肺炎 根據(jù)支原體ELISA抗體檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行檢測(cè),具體操作如下:

設(shè)置陰性對(duì)照及陽(yáng)性對(duì)照,各做2個(gè)重復(fù),將陰、陽(yáng)性對(duì)照血清及待檢測(cè)樣品加入到包被板相應(yīng)孔中,100 μL/孔。在37℃條件下孵育1 h。

孵育結(jié)束后,甩去包被板各孔中的液體,用洗滌液洗滌包被板,250 μL/孔,洗滌3次。

向各孔加入兔抗牛IgG酶標(biāo)抗體,100 μL/孔,在37℃條件下孵育1 h后洗滌。

加入底物顯色液,100 μL/孔,室溫避光孵育9 min。

加入終止液,15 min內(nèi)在450 nm波長(zhǎng)下讀取 OD值。

判定標(biāo)準(zhǔn):當(dāng)陽(yáng)性對(duì)照血清OD450nm值≥0.8、陰性對(duì)照血清 OD450nm值<0.1時(shí)試驗(yàn)結(jié)果有效。待檢樣品的S/P值≥0.418時(shí),判定為陽(yáng)性,待檢樣品的S/P 值<0.418時(shí),判定為陰性。

1.3.2小反芻獸疫 根據(jù)小反芻獸疫競(jìng)爭(zhēng)ELISA抗體檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行檢測(cè),具體操作如下:

設(shè)置陰性對(duì)照血清2孔和陽(yáng)性對(duì)照血清2孔,每孔加入相應(yīng)血清50 μL;空白對(duì)照2孔,每孔加100 μL 1×PBST;單克隆抗體對(duì)照4孔,每孔加50 μL 1×PBST溶液。

待檢血清孔每孔加入待檢血清樣品50 μL。除空白對(duì)照外,其他各孔加單克隆抗體工作液50 μL,在37℃條件下孵育1 h。

取出酶標(biāo)板甩干,用1×PBST洗滌4～5次;每孔加入免抗鼠酶標(biāo)工作液50 μL,在37℃條件下孵育1 h后洗滌。

每孔加入底物溶液50 μL,置37℃避光靜置反應(yīng)15 min。

每孔加入50 μL終止液。450 nm波長(zhǎng)下讀取各孔的OD值。

判定標(biāo)準(zhǔn):當(dāng)陰性對(duì)照血清PI<40%、陽(yáng)性對(duì)照血清PI>60%時(shí)檢測(cè)結(jié)果成立,否則該次檢測(cè)結(jié)果無(wú)效。診斷或進(jìn)行流行病學(xué)調(diào)查時(shí),待檢血清PI≥50%為陽(yáng)性,PI<50%為陰性。

1.3.3多殺性巴氏桿菌 根據(jù)多殺性巴氏桿菌抗體(PM-Ab)ELISA科研試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行檢測(cè),具體操作如下:

設(shè)置陰、陽(yáng)性對(duì)照孔和樣本孔,陰、陽(yáng)性對(duì)照孔中加入相應(yīng)血清各 50 μL;樣本孔先加待測(cè)樣本 10 μL,再加樣本稀釋液40 μL。

陰、陽(yáng)性對(duì)照孔和樣本孔中每孔加入辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的檢測(cè)抗原100 μL,在37℃條件下孵育1 h。

棄去孔中液體,用吸水紙拍干,每孔加滿洗滌液,靜置 1 min,甩去洗滌液,如此重復(fù)洗板 5次。

每孔加入底物A、B各50 μL,在37℃條件下避光孵育15 min。

每孔加入終止液50 μL,15 min內(nèi)在450 nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔的 OD 值。

判定標(biāo)準(zhǔn):當(dāng)陽(yáng)性對(duì)照孔OD平均值≥1.00、陰性對(duì)照孔OD平均值≤0.15時(shí),樣品OD值<臨界值判為陰性,樣品OD值>臨界值判為陽(yáng)性。

2 結(jié)果

由表1可見,在80份被檢血清中,支原體陽(yáng)性0份,陽(yáng)性率為0;小反芻獸疫陽(yáng)性30份,陽(yáng)性率為37.50%;多殺性巴氏桿菌陽(yáng)性1份,陽(yáng)性率為1.25%。

表1 互助縣藏羊養(yǎng)殖場(chǎng)血清抗體陽(yáng)性率檢測(cè)結(jié)果

3 討論

在本次檢測(cè)的80份藏羊血液樣本中,支原體、小反芻獸疫病毒和多殺性巴氏桿菌病的抗體的陽(yáng)性率分別為0、37.50%和1.25%。通過(guò)對(duì)上述3個(gè)養(yǎng)殖場(chǎng)進(jìn)行實(shí)地走訪和調(diào)查,未發(fā)現(xiàn)明顯的羊傳染性胸膜肺炎和羊巴氏桿菌發(fā)病情況。據(jù)報(bào)道,新疆、甘肅、陜西和內(nèi)蒙地區(qū)的血清樣品中,羊傳染性胸膜肺炎抗體和巴氏桿菌抗體陽(yáng)性率較高,分別為98%和94.22%[12];內(nèi)蒙古呼倫貝爾和拉薩羊病料中多殺性巴氏桿菌的分離率分別為60%[13]和22.20%[14]。與以上地區(qū)相比,青海省藏羊傳染性胸膜肺炎和巴氏桿菌病發(fā)病率很低。研究發(fā)現(xiàn),我國(guó)西北地區(qū)為小反芻獸疫的高發(fā)地區(qū),小反芻獸疫是一種急性病毒性傳染病,世界衛(wèi)生組織將其規(guī)定為必須報(bào)告的疫病,我國(guó)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部將其列為一類動(dòng)物疫病。其特征是發(fā)病急劇、高熱稽留、眼鼻分泌物增加、口腔糜爛、腹瀉和肺炎[15]。

這3種疫病都極具傳染性,且發(fā)病率和死亡率很高,一旦感染會(huì)對(duì)畜牧業(yè)發(fā)展帶來(lái)巨大威脅,因此在藏羊養(yǎng)殖過(guò)程中應(yīng)加強(qiáng)防控工作,對(duì)羊群進(jìn)行定期監(jiān)測(cè),并對(duì)養(yǎng)殖場(chǎng)進(jìn)行定期消毒,制定規(guī)范的疫苗免疫程序,定期進(jìn)行預(yù)防接種。