忻運(yùn) 魏佳鳴

（上海市食品藥品包裝材料測(cè)試所 上海 201203）

高壓滅菌器是生物制藥行業(yè)的核心關(guān)鍵設(shè)備，適用于耐高溫、高壓、高濕的醫(yī)用器械或其他待滅菌品[1]。美國(guó)注射劑協(xié)會(huì)（Parenteral Drug Association，PDA）第48 號(hào)技術(shù)報(bào)告提示：GMP 要求的滅菌柜是一種濕熱滅菌柜，其建造應(yīng)符合制藥行業(yè)衛(wèi)生設(shè)計(jì)要求[2]。WHO對(duì)驗(yàn)證的定義是：通過(guò)一系列活動(dòng)產(chǎn)生文件證明某一程序（操作）能夠達(dá)到某個(gè)預(yù)期的目的[3]。

濕熱滅菌程序依賴于飽和蒸汽的直接接觸，此過(guò)程中蒸汽與液態(tài)水處于平衡狀態(tài)。濕熱滅菌過(guò)程中物理和微生物結(jié)果之間的一致性是滅菌驗(yàn)證中最重要的部分[4]。按照賦予被滅菌品的殺滅效力衡量，應(yīng)當(dāng)從物理和生物兩方面來(lái)證明最低合格滅菌程序的合理性[5]。物理確認(rèn)的目的是獲取物理數(shù)據(jù)并證明程序始終達(dá)到滅菌程序設(shè)計(jì)時(shí)確定的熱穿透要求。生物指示劑（biological indicator，BI）的目標(biāo)是獲取所開發(fā)的滅菌程序?qū)嶋H達(dá)到了生物殺滅效力，BI 的選擇取決于滅菌方法和滅菌程序[6]。

本研究參考國(guó)內(nèi)外濕熱滅菌指導(dǎo)原則，通過(guò)濕熱滅菌法嚴(yán)格實(shí)踐不同裝載程序和裝載模式下的滅菌工藝，嚴(yán)謹(jǐn)分析各項(xiàng)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)結(jié)果，為實(shí)驗(yàn)室濕熱滅菌提供一定的數(shù)據(jù)支撐。提出滅菌實(shí)驗(yàn)人員應(yīng)更多關(guān)注滅菌器冷點(diǎn)分析、最難裝載模式探討、D 值（decimal reduction time，是一個(gè)以分鐘計(jì)的時(shí)間單位，指某BI 或某菌群中90%的原有存活菌被殺滅所需的時(shí)間）與初始污染菌研究，為今后良好合規(guī)的濕熱滅菌器驗(yàn)證作參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器設(shè)備

HX-650-2D 型雙扉穿墻式滅菌器（德國(guó)Systec 公司）；TS Pro logger 型無(wú)線測(cè)溫儀；ETS-20 型溫度標(biāo)準(zhǔn)器；KB400 型培養(yǎng)箱（德國(guó)Binder 公司）；MIR-254 型培養(yǎng)箱（日本Sanyo 公司）。

1.2 自含式壓力蒸汽滅菌生物指示劑

SA/6 型BI（批號(hào)SA-659，產(chǎn)品標(biāo)稱存活孢子數(shù)2.5×106spores/unit，D 121 ℃值2.2 min、SASU/6 型BI（批號(hào)SASU-322，產(chǎn)品標(biāo)稱存活孢子數(shù)2.3×106spores/unit，D 115 ℃值1.4 min），EZS/6 型BI（批號(hào)S-533，產(chǎn)品標(biāo)稱存活孢子數(shù)1.7×106spores/unit，D 121 ℃值2 min）均購(gòu)自美國(guó)Mesalabs 公司。

1.3 BD 測(cè)試包

CI-BDTLF 型Bowie-Dick（BD） 測(cè) 試 包（ 美 國(guó)Mesalabs 公司，批號(hào)BDT0321）。

1.4 方法

1.4.1 驗(yàn)證計(jì)劃與裝載模式

本次濕熱滅菌驗(yàn)證計(jì)劃的裝載類型分為固體裝載和液體裝載，滅菌驗(yàn)證計(jì)劃見表1，裝載模式見表2。無(wú)線測(cè)溫探頭和BI 分布點(diǎn)見圖1，其中探頭之間間隔15 cm均勻分布在滅菌腔內(nèi)，熱穿透時(shí)用滅菌膠帶將BI 與探頭固定，為確保驗(yàn)證數(shù)據(jù)精確，配備14 個(gè)無(wú)線測(cè)溫探頭（2個(gè)備用）均經(jīng)過(guò)前/后校準(zhǔn)，目的是全面評(píng)估測(cè)溫以及賦予探頭新的偏差補(bǔ)償，各裝載模式見圖2[7-8]。

圖1 無(wú)線測(cè)溫探頭和BI分布點(diǎn)

圖2 物料裝載示意圖

表1 驗(yàn)證計(jì)劃

表2 溫度、裝載方式及物料信息

1.4.2 滅菌程序

滅菌程序的選擇根據(jù)被滅菌品性質(zhì)決定，具體可參考圖3 濕熱滅菌工藝決策樹[9-10]。本次固體待滅菌品和121 ℃液體待滅菌品參考采用“過(guò)度殺滅法”，115 ℃待滅菌品為不耐熱品參考采用“按產(chǎn)品特性設(shè)計(jì)法”——生物負(fù)載/生物指示劑法。針對(duì)飽和蒸汽滅菌程序中蒸汽質(zhì)量的重要性需進(jìn)行BD 測(cè)試以評(píng)估空氣去除和蒸汽 質(zhì)量的有效性。

圖3 濕熱滅菌工藝決策樹

1.4.3 滅菌驗(yàn)證可接受標(biāo)準(zhǔn)

利用無(wú)線測(cè)溫儀分析腔體內(nèi)溫度數(shù)據(jù)以監(jiān)測(cè)物理殺滅效果，經(jīng)取樣培養(yǎng)，BI 呈陰性、陽(yáng)性對(duì)照品呈陽(yáng)性、陰性對(duì)照品呈陰性，表明微生物滅菌效果好。滅菌驗(yàn)證可接受標(biāo)準(zhǔn)見表3。

表3 滅菌驗(yàn)證可接受標(biāo)準(zhǔn)

2 結(jié)果

滅菌15 min 驗(yàn)證后各項(xiàng)數(shù)據(jù)結(jié)果均符合“1.4.3 節(jié)表述的可接受標(biāo)準(zhǔn)”（表4）。

表4 滅菌驗(yàn)證數(shù)據(jù)

各滅菌程序中典型的熱穿透溫度曲線圖譜以及BD測(cè)試通過(guò)的顯影圖和滅菌后BI 狀況分別見圖4、圖5 和圖6。

圖4 滅菌工藝溫度曲線圖

圖5 BD測(cè)試通過(guò)的顯影圖

圖6 滅菌后BI狀況

3 討論

3.1 D 值與初始污染菌研究

所有測(cè)試結(jié)果均符合滅菌驗(yàn)證可接受標(biāo)準(zhǔn)。需要說(shuō)明的是115 ℃液體滅菌程序的日常被滅菌品（RV 沙門菌增菌體液培養(yǎng)基）的滅菌溫度不可超過(guò)115 ℃[11]。在生物負(fù)載/生物指示劑法工藝中，BI 是通過(guò)生物學(xué)的方法來(lái)驗(yàn)證滅菌效果，只要D 值足夠即使初始微生物數(shù)量低于106，使用BI 仍然可以驗(yàn)證滅菌效果。D 值是評(píng)價(jià)滅菌生物指示劑產(chǎn)品質(zhì)量的關(guān)鍵性技術(shù)參數(shù)，D 值越大，耐熱微生物殺滅速度越慢，該菌株的耐熱性越強(qiáng)[12]。對(duì)滅菌耐受性差的物品，其無(wú)菌保證應(yīng)通過(guò)比較BI 與物品滅菌前微生物的污染水平（耐受性及微生物污染數(shù)量）及滅菌程序驗(yàn)證所獲得的數(shù)據(jù)進(jìn)行評(píng)估。建議今后115℃滅菌驗(yàn)證重點(diǎn)關(guān)注耐受性差的物品初始污染菌監(jiān)測(cè)以及D 值的研究，探索BI 的耐熱性與日常滅菌過(guò)程中出現(xiàn)的生物負(fù)荷耐熱性的不同，從而支持滅菌工藝的有效性，這也是新版藥典滅菌法以及國(guó)外各類指南中著重強(qiáng)調(diào)的。

3.2 冷點(diǎn)分析

通過(guò)分析9 次穿透數(shù)據(jù)以及無(wú)線測(cè)溫探頭分布位置可知，121 ℃固體程序冷點(diǎn)三次都分布在1#點(diǎn)位；115℃液體程序三次冷點(diǎn)分布在5#，8#，9#點(diǎn)位；121 ℃液體程序三次冷點(diǎn)分布在3#，6#，7#點(diǎn)位。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，121 ℃固體程序冷點(diǎn)固定，因?yàn)闇y(cè)溫探頭均放置在相對(duì)密閉的不銹鋼醫(yī)械器皿里面，所以這個(gè)區(qū)域是冷點(diǎn)區(qū)域。115 ℃液體程序冷點(diǎn)分布于8#點(diǎn)位區(qū)域周圍15 cm 左右，原因一是無(wú)線測(cè)溫探頭放置在大容量的灌封溶液里面，原因二是這個(gè)位置靠近排水口，所以這個(gè)區(qū)域是冷點(diǎn)區(qū)域。121 ℃液體程序冷點(diǎn)三次都比較分散，原因一是混合裝載模式空間有限且不均勻、原因二是溶液體積不均衡、原因三是待滅菌品在滅菌器網(wǎng)籃上的位置改變，上述原因都會(huì)影響改變冷點(diǎn)位置。

建議進(jìn)行冷點(diǎn)研究以發(fā)現(xiàn)待滅菌品的最慢加熱位置。液體裝載冷點(diǎn)研究時(shí)可以通過(guò)將多個(gè)探頭放置于整個(gè)容器不同位置或水平面進(jìn)行試驗(yàn)來(lái)確定，所有試驗(yàn)數(shù)據(jù)匯總確定冷點(diǎn)位置或區(qū)域。固體裝載冷點(diǎn)研究時(shí)，需要就待滅菌品的質(zhì)量、空氣移除挑戰(zhàn)和冷凝積水的可能性進(jìn)行評(píng)估。

3.3 最難裝載

雖然本次滅菌以滿載進(jìn)行測(cè)試，但我們認(rèn)為最難滅菌的裝載未必是最大裝載或最小裝載，建議專門進(jìn)行滅菌器最難裝載模式驗(yàn)證。可以運(yùn)用主位點(diǎn)/主溶液方法來(lái)研究最難裝載模式，此方法可以最小化測(cè)試工作量。對(duì)于固體裝載，比如兩端開口的管子中間是最慢加熱位置，因?yàn)樵撐恢玫目諝庾铍y排除、蒸汽也最難滲入。對(duì)于液體裝載主溶液就是指一個(gè)產(chǎn)品家族內(nèi)所有溶液中賦予BI 最高D 值或抗性的溶液。熱穿透測(cè)試也可以使用替代溶液，但需要通過(guò)評(píng)估和比較整個(gè)產(chǎn)品的溶液黏度證明替代溶液黏度具有代表性。

綜上所述，高溫濕熱滅菌受到溫度、時(shí)間、物理殺滅力、生物殺滅力等多種因素影響。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果累計(jì)專業(yè)數(shù)據(jù)、積累寶貴經(jīng)驗(yàn)，可為濕熱滅菌器驗(yàn)證提供了一定參考依據(jù)。