楊夏楠，趙丹丹，司 晗，楊平娟，樊冬梅

河南科技大學(xué)第一附屬醫(yī)院婦三科，河南 洛陽 471003

子宮內(nèi)膜癌（Endometrial Cancer，EC）是女性中第四大常見癌癥，也是最常見的婦科癌癥。子宮內(nèi)膜癌是一種具有侵襲或轉(zhuǎn)移能力的惡性腫瘤，主要發(fā)生在更年期和絕經(jīng)后婦女中［1］。子宮內(nèi)膜癌根據(jù)病因和臨床行為可以分為I 型和II 型。I 型腫瘤是雌激素依賴性高分化腺癌，起源于子宮內(nèi)膜增生，占子宮內(nèi)膜癌病例的80%。與I 型腫瘤相反，II 型腫瘤是不依賴雌激素的、分化差的腺癌，其起源于萎縮性子宮內(nèi)膜［2］。在我國，隨著社會的發(fā)展和經(jīng)濟(jì)條件的改善，子宮內(nèi)膜癌的發(fā)病率亦逐年升高，因此，闡明子宮內(nèi)膜癌的發(fā)病機(jī)制對提高子宮內(nèi)膜癌患者的生存時間至關(guān)重要。

非SMC 縮合蛋白I 復(fù)合物亞單位H（non-SMS condensin Ⅰcomplex subunit H，NCAPH），稱為凝聚素，在有絲分裂和減數(shù)分裂過程中參與染色體的組裝和分離，對維持染色體的結(jié)構(gòu)和分離至關(guān)重要［3］。近年來，研究發(fā)現(xiàn)，NCAPH 在多種腫瘤的發(fā)生和發(fā)展過程中起重要作用［4］。Kim 等［5］發(fā)現(xiàn)，NCAPH 在胰癌的臨床組織和細(xì)胞系中表達(dá)上調(diào)，且沉默NCAPH 可以通過激活DNA 損傷反應(yīng)（Chk1/Chk2）信號通路誘導(dǎo)染色體的畸變和DNA損傷，進(jìn)而抑制胰癌細(xì)胞的增殖和誘導(dǎo)胰癌細(xì)胞的凋亡［5］。Sun等［6］發(fā)現(xiàn)，超表達(dá)NCAPH 可以促進(jìn)肝細(xì)胞癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，表明NCAPH 可以作為一種新的預(yù)后生物標(biāo)志物和肝細(xì)胞癌患者的潛在治療靶點(diǎn)。Cui 等［7］發(fā)現(xiàn)，NCAPH 的表達(dá)水平在前列腺癌中顯著上調(diào)，且NCAPH 的過表達(dá)與前列腺癌患者的不良生存率有關(guān)。Yin等［8］發(fā)現(xiàn)，NCAPH 在結(jié)腸癌組織中的表達(dá)水平明顯高于其在相鄰非癌組織中的表達(dá)水平，且沉默NCAPH 可以抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖、遷移和異種移植腫瘤的形成。然而，NCAPH在子宮內(nèi)膜癌中的具體作用至今尚不清楚。

本研究通過構(gòu)建NCAPH 沉默的細(xì)胞模型，探究NCAPH在子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲和EMT過程中的作用，為今后子宮內(nèi)膜癌的診斷和治療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

正常人子宮內(nèi)膜細(xì)胞（hEEC），子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞（Ishikawa，RL95-2 和KLE）均購自武漢普諾賽生物科技有限公司；si-NCAPH 和其陰性對照si-NC 購自蘇州貝信生物技術(shù)有限公司；CCK-8試劑盒購買于碧云天生物生物技術(shù)；DMEM 培養(yǎng)基、Trizol 試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光定量PCR 試劑盒均購自上海賽默飛世爾科技有限公司；Lipofectamine 2000購自Invitrogene公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

將子宮內(nèi)膜癌Ishikawa 和KLE 細(xì)胞接種在含有10%胎牛血清和1%雙抗的DMEM 培養(yǎng)基內(nèi)，在恒溫37 ℃含有5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待Ishikawa 和KLE 細(xì)胞生長至培養(yǎng)瓶底部鋪滿細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞傳代，收集生長狀態(tài)良好的細(xì)胞用于后續(xù)實驗。

1.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染

細(xì)胞轉(zhuǎn)染前一天將細(xì)胞接種到6 孔板中，待細(xì)胞轉(zhuǎn)染時長至70%的融合度，使用Lipofectamine 2000將si-NCAPH和si-NC 轉(zhuǎn)染到Ishikawa 和KLE 細(xì)胞中。轉(zhuǎn)染后繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞48 h，然后收取細(xì)胞，通過qRT-PCR 和western blot檢測NCAPH的表達(dá)水平。

1.4 CCK-8

將轉(zhuǎn)染后的Ishikawa 和KLE 細(xì)胞重懸，然后接種到96孔板中，培養(yǎng)24 h、48 h或者72 h后，按照試劑盒操作步驟，每孔加入10 μL 的CCK-8 試劑，在95%空氣、5%CO2的37 ℃條件下孵育3 h，隨后使用酶標(biāo)儀在450 nm 處檢測吸光度OD值。

1.5 劃痕愈合實驗

將轉(zhuǎn)染后的Ishikawa 和KLE 細(xì)胞接種到6 孔板中，待細(xì)胞長至基本融合時用10 μL 無菌槍頭垂直6 孔板劃痕，用PBS 清洗Ishikawa 和KLE 細(xì)胞3 次，然后放入37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，然后在顯微鏡下觀察并隨機(jī)選取5 張視野拍照，通過Image J 圖像處理軟件量化遷移面積，計算其遷移率。

1.6 Transwell實驗

收集轉(zhuǎn)染后的Ishikawa 和KLE 細(xì)胞，用無血清的培養(yǎng)基將其重懸，然后將細(xì)胞懸液接種到預(yù)先涂有基質(zhì)膠的Transwell 上室，下室加入含有血清的完全培養(yǎng)基。在37 ℃、5% CO2的條件下培養(yǎng)24 h后，取出Transwell小室，棄去孔內(nèi)培養(yǎng)基，擦去上層小室內(nèi)的細(xì)胞。將細(xì)胞用甲醇固定30 min，并用0.1%結(jié)晶紫染色10 min，顯微鏡下觀察并隨機(jī)選取5張視野拍照，對侵襲細(xì)胞進(jìn)行計數(shù)。

1.7 RT-qPCR

通過Trizol 試劑（Takara，Tokyo，Japan）從Ishikawa和KLE細(xì)胞中提取的總RNA，使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（Takara）合成cDNA，然后使用SYBR Prellix Ex Taq RT-qPCR 試劑盒（Takara）和NCAPH 特異性引物進(jìn)行RT-qPCR 反應(yīng)。以β-actin 作為內(nèi)參基因，使用2-△△Ct方法計算基因mRNA的相對表達(dá)水平。

1.8 Western Blot

用RIPA 蛋白裂解液從細(xì)胞中提取總蛋白，使用BCA蛋白質(zhì)測定試劑盒測定總蛋白質(zhì)濃度，使用SDS-聚丙烯酰胺凝膠對蛋白質(zhì)進(jìn)行分離，并轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，PVDF膜用5%脫脂牛奶封閉，后加入NCAPH 和β-action 抗體（稀釋比例為1∶1 000），4℃孵育過夜，再加入二抗，37 ℃孵育1 h，通過ECL 化學(xué)發(fā)光液顯影后在化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)拍照，應(yīng)用Image J圖像處理軟件進(jìn)行定量分析。

1.9 統(tǒng)計學(xué)方法

采用Graphpad Prism 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計學(xué)分析，組間數(shù)據(jù)比較采用t檢驗或者單因素方差分析（One-way ANOVA），以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 NCAPH在子宮內(nèi)膜癌中的表達(dá)水平

基于TCGA數(shù)據(jù)庫分析NCAPH在正常子宮內(nèi)膜和子宮內(nèi)膜癌中的表達(dá)水平。如圖1A和1B所示，NCAPH 在癌旁組織的表達(dá)水平明顯低于其在子宮內(nèi)膜癌的表達(dá)水平，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.001）。

圖1 NCAPH在子宮內(nèi)膜癌中的表達(dá)水平

2.2 NCAPH 在子宮內(nèi)膜癌中的診斷價值及其與預(yù)后的關(guān)系

ROC 曲線分析結(jié)果顯示，NCAPH 在子宮內(nèi)膜癌具有臨床診斷價值（圖2A）。此外，使用KM-plotter 在線數(shù)據(jù)庫進(jìn)行生存分析，如圖1B 所示，NCAPH 高表達(dá)子宮內(nèi)膜癌患者的總生存期（圖2B）和無進(jìn)展生存期（圖2C）比NCAPH 低表達(dá)的子宮內(nèi)膜癌患者的總生存期較短，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

圖2 NCAPH在子宮內(nèi)膜癌中的診斷價值及其和預(yù)后的關(guān)系

2.3 NCAPH 在正常子宮內(nèi)膜細(xì)胞及子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞中的表達(dá)水平

使用qRT-PCR 和Western blot 實驗分析正常子宮內(nèi)膜細(xì)胞hEEC 和子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞Ishikawa、RL95-2 和KLE 中NCAPH 的表達(dá)情況。由圖3 可知，與正常子宮內(nèi)膜細(xì)胞hEEC 細(xì)胞相比，NCAPH 在子宮內(nèi)膜癌Ishikawa、RL95-2和KLE 細(xì)胞的表達(dá)明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.001）。

圖3 正常子宮內(nèi)膜細(xì)胞及子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞中NCAPH的表達(dá)

2.4 沉默NCAPH對子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞增殖的影響

用si-NC和si-NCAPH轉(zhuǎn)染Ishikawa和KLE細(xì)胞，轉(zhuǎn)染48 h后，研究用qRT-PCR和Western Blot檢測NCAPH的表達(dá)。圖4A 和4B 結(jié)果顯示，在Ishikawa 和KLE 細(xì)胞中，與si-NC 相比，si-NCAPH 組中NCAPH 的表達(dá)明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.001）。

圖4 沉默NCAPH對Ishikawa和KLE細(xì)胞增殖能力的影響

使用CCK-8 方法檢測沉默NCAPH 對子宮內(nèi)膜癌Ishikawa 和KLE 細(xì)胞增殖活性的影響，如圖4C 和4D 所示，與si-NC 組相比，si-NCAPH 組Ishikawa 和KLE 細(xì)胞的增殖活性明顯下降，且差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.001），表明沉默NCAPH可以降低子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞的增殖能力。

2.5 沉默NCAPH 對子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響

Ishikawa 和KLE 細(xì)胞轉(zhuǎn)染si-NC 或si-NCAPH 24 h 后，研究者進(jìn)行劃痕愈合實驗，評估Ishikawa 和KLE 細(xì)胞的遷移能力。如圖5A 所示，與si-NC 組Ishikawa 和KLE 細(xì)胞的遷移率相比，si-NCAPH 組Ishikawa 和KLE 細(xì)胞的遷移率顯著下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.001）。結(jié)果表明沉默NCAPH 抑制子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞的遷移能力。與此同時，Transwell 小室實驗的結(jié)果表明，與si-NC 組相比，si-NCAPH 組Ishikawa和KLE細(xì)胞的侵襲能力明顯下降，見圖5B。由此可見，沉默NCAPH 可以抑制子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞侵襲和遷移能力。

圖5 沉默NCAPH對Ishikawa和KLE細(xì)胞遷移能力的影響

2.6 沉默NCAPH對子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞中EMT的影響

為了探究沉默NCAPH 對子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞中EMT 的影響，研究使用Western Blot方法檢測了轉(zhuǎn)染48 h后Ishikawa和KLE細(xì)胞中EMT的相關(guān)基因E-鈣黏蛋白（E-cadherin）、波形蛋白（Vimentin）和N-cadherin 的蛋白表達(dá)水平。如圖6A 和6B 所示，在Ishikawa 和KLE 細(xì)胞中，與si-NC 組相比，敲減NCAPH 可以引起Ishikawa 和KLE 細(xì)胞中Ecadherin 的水平顯著升高，而引起Ishikawa 和KLE 細(xì)胞中Vimentin 和N-cadherin 的蛋白表達(dá)水平明顯下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.001）。

圖6 沉默NCAPH抑制Ishikawa和KLE細(xì)胞的EMT

3 討論

子宮內(nèi)膜癌是最常見的女性生殖系統(tǒng)腫瘤之一，并是導(dǎo)致死亡的第三位常見婦科惡性腫瘤（僅次于卵巢癌和宮頸癌）。近年來子宮內(nèi)膜癌的發(fā)病率仍在不斷升高，但是由于女性內(nèi)分泌系統(tǒng)的復(fù)雜性，子宮內(nèi)膜癌的發(fā)病機(jī)制至今尚未完全闡明。研究表明子宮內(nèi)膜癌的發(fā)病機(jī)制可能與基因的異常表達(dá)密切相關(guān)［9］。因此，闡明子宮內(nèi)膜癌的發(fā)病機(jī)制對提高患者的生存時間尤為重要。

已有研究發(fā)現(xiàn)NCAPH 在多種腫瘤的發(fā)生和發(fā)展過程中起重要作用［10］。沉默NCAPH 可以誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞G1細(xì)胞周期停滯，進(jìn)而抑制胃癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲［11］。在漿液性卵巢癌中，NCAPH 的表達(dá)水平明顯升高，且NCAPH 的表達(dá)水平與漿液性卵巢癌的組織學(xué)腫瘤分級和淋巴轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)，而與漿液性卵巢癌患者的總生存時間呈負(fù)相關(guān)。由此可見，NCAPH 有望成為漿液性卵巢癌的預(yù)后標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)。同樣地，Qi等［12］發(fā)現(xiàn)NCAPH 可以通過上調(diào)PI3K/PDK1/AKT通路促進(jìn)卵巢癌的發(fā)展。在宮頸癌中，NCAPH 的表達(dá)水平明顯高于其在正常宮頸和高級別鱗狀上皮內(nèi)病變組織中的表達(dá)水平，且其表達(dá)水平與腫瘤大小、浸潤深度和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移明顯相關(guān)。此外，高表達(dá)NCAPH 的宮頸癌患者的生存結(jié)果明顯比低表達(dá)NCAPH的宮頸癌患者的生存結(jié)果更好，且沉默NCAPH 可以通過PI3K/Akt/SGK 信號通路抑制宮頸癌細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲和上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化［13］。在膀胱癌中，NCAPH可以通過MEK/ERK 信號通路促進(jìn)UMUC3細(xì)胞的增殖，抑制UMUC3細(xì)胞的凋亡［14］。在乳腺癌中，NCAPH 在MCF-7 和MCF-10A 細(xì)胞中的表達(dá)水平明顯升高，且其上調(diào)表達(dá)與乳腺癌患者的預(yù)后不良明顯相關(guān)，表明NCAPH 有可能作為乳腺癌的預(yù)后標(biāo)志物［15］。在非小細(xì)胞癌中，NCAPH 沉默可以抑制A549 和H1299 細(xì)胞的增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞周期在G/M 期停滯，并阻止A549 和H1299 細(xì)胞的集落形成、遷移和侵襲［16］。Shimomura 等［17］研究發(fā)現(xiàn)，NCAPH 在口腔鱗狀細(xì)胞癌中的表達(dá)高于其在正?？谇火つぶ械谋磉_(dá)，且NCAPH 的免疫染色與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和淋巴浸潤密切相關(guān)。此外，機(jī)制研究發(fā)現(xiàn)，NCAPH 可以促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞向口腔鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞的遷移和黏附，降低口腔鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞對鉑類抗癌藥物的敏感性。然而，NCAPH 在子宮內(nèi)膜癌中的功能作用至今尚未見報道。在此，研究通過分析TCGA和KM plotter 數(shù)據(jù)庫發(fā)現(xiàn)，NCAPH 在子宮內(nèi)膜癌組織的表達(dá)水平明顯高于其在子宮內(nèi)膜癌旁組織的表達(dá)水平，且其表達(dá)水平與患者的預(yù)后生存時間呈負(fù)相關(guān)。由此可見，NCAPH 有可能作為促癌基因，在子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生發(fā)展過程中起重要作用。這與Qiu 等［18］的研究結(jié)論一致，NCAPH 在子宮內(nèi)膜癌中上調(diào)并且與較差的臨床病理學(xué)特征相關(guān)。本研究通過在子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞中沉默NCAPH 發(fā)現(xiàn)，沉默NCAPH 能夠?qū)е伦訉m內(nèi)膜癌細(xì)胞的增殖活性降低。此外，劃痕愈合實驗和Transwell實驗結(jié)果顯示，沉默NCAPH能夠顯著抑制子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力。

EMT 是指細(xì)胞失去上皮特性而獲得間質(zhì)特性的動態(tài)可逆過程，在胚胎發(fā)育、傷口愈合、癌癥轉(zhuǎn)移和纖維化等過程中發(fā)揮了重要作用。EMT 的主要特征有細(xì)胞黏附分子（如E-cadherin）表達(dá)的減少、細(xì)胞角蛋白細(xì)胞骨架轉(zhuǎn)化為Vimentin 為主的細(xì)胞骨架及形態(tài)上具有間充質(zhì)細(xì)胞的特征。在EMT過程中，細(xì)胞將失去其黏附和極性特征，上皮細(xì)胞的標(biāo)志物E-cadherin 的表達(dá)水平逐漸降低，而間充質(zhì)細(xì)胞的標(biāo)志物Vimentin 和N-cadherin 的表達(dá)水平會逐漸升高，而且N-cadherin 可以通過其鋅指結(jié)構(gòu)與E-cadherin 啟動子區(qū)域的E-box元件結(jié)合而直接抑制E-cadherin的表達(dá)，從而啟動EMT 過程。然而，NCAPH 是否參與子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞的EMT 過程尚未見報道。本研究通過Western blot 檢測了EMT 相關(guān)基因的表達(dá)水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，沉默NCAPH上調(diào)了子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞中E-cadherin 的表達(dá)水平，同時下調(diào)了Vimentin 和N-cadherin 的表達(dá)水平。這些結(jié)果表明，沉默NCAPH抑制了子宮內(nèi)膜癌的EMT過程。

綜上所述，NCAPH 在子宮內(nèi)膜癌組織和細(xì)胞中異常過表達(dá)，沉默NCAPH 能夠抑制子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲和EMT。因此，NCAPH 有希望成為診斷子宮內(nèi)膜癌患者的有效生物標(biāo)志，并可能作為治療子宮內(nèi)膜癌的潛在基因靶點(diǎn)，但是其中的分子機(jī)制還需要進(jìn)一步的研究和證明。