段英姿, 客紹英, 王曉英, 張勝珍, 馬艷芝

(1.唐山師范學院生命科學系, 河北 唐山 063000; 2.河北農(nóng)業(yè)大學, 河北 保定 071000)

油牡丹屬于芍藥屬(Paeonia)牡丹組(Sect.Moutan),也稱油用牡丹、食用牡丹、藥用牡丹,是一種新興的木本油料作物。牡丹籽可榨油,根可入藥,花可觀賞,屬我國特有資源植物。2011年國家批準牡丹籽油為新資源食品[1]。目前油牡丹的研究主要集中在引種[2-3]、栽培[4-5]、營養(yǎng)物質(zhì)[6-7]、成分分析[8-10]、牡丹籽油提取及品質(zhì)[11-13]、理化性質(zhì)[14-15]、產(chǎn)業(yè)發(fā)展[16-17]等方面。我國種植且有良好表現(xiàn)的油用牡丹主要是鳳丹牡丹(Paeoniaostill)和紫斑牡丹(Paeoniarockii)兩大類[18],其品種繁多,種源混雜,呈現(xiàn)遺傳多樣性狀態(tài)。如河南紫斑牡丹[19]和甘肅紫斑牡丹[20]雖都稱紫斑牡丹,但核型不同。為豐富油用牡丹優(yōu)良資源及開發(fā)利用,可系統(tǒng)分析不同品種油牡丹的遺傳學背景。

核型分析是細胞水平研究植物親緣關系的有效方法之一,與核型似近系數(shù)聚類分析[21]結(jié)合已廣泛應用植物[22-23]親緣關系及進化程度的研究,關于油牡丹及與其他牡丹親緣進化關系的核型研究已有報道[24-26]。但是未見多種油牡丹品種核型比較及核型似近系數(shù)聚類分析的相關報道。本研究以引自甘肅蘭州產(chǎn)油高、市場份額大、表現(xiàn)好的15個不同花色紫斑牡丹為材料,采用常規(guī)根尖壓片法分析其核型,并在核型不對稱性程度分析上初步比較了兩種核型不對稱系數(shù)As.K[27]和AI[28]結(jié)果,作CVCL-CVCI散點圖和核型似近系數(shù)聚類分析,綜合分析不同紫斑牡丹的核型特征、進化程度及親緣關系,為油牡丹的資源利用,并了解其花型花色遺傳規(guī)律及品種選育等提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材 料

15個紫斑牡丹材料均來自甘肅蘭州甘肅花多多農(nóng)業(yè)科技有限公司,詳見表1。

表1 試驗材料Table 1 Experimental materials

1.2 方 法

1.2.1染色制片

將15個紫斑牡丹品種栽于盆中,待長出新根后,取根尖1～2 cm參照段英姿和馬艷芝[22]的方法制片,1 mol/L HCl溶液室溫條件下解離17 min,切取分生區(qū)部分于載玻片上用改良的苯酚品紅染液染色1～2 min,壓片后于Nikon E100顯微系統(tǒng)鏡檢,拍照。

1.2.2核型分析

染色體數(shù)目的確定、核型應分析的細胞數(shù)目和核型標準參照李懋學和陳瑞陽[29]的方法,用Photoshop CS6軟件測量染色體長度,并配對。參照Stebbins[30]的方法進行核型分類,參照喬永剛和宋蕓[31]的方法繪制模式圖,核型不對稱系數(shù)As.K參照Arano[27]的方法計算,核型不對稱系數(shù)AI參照Paszko[28]的方法計算,并作CVCL-CVCI散點圖。

1.2.3核型似近系數(shù)聚類分析

參照吳昌謀[32]的方法計算核型似近系數(shù)及遺傳距離,并進行核型似近系數(shù)聚類分析[33]。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同油用紫斑牡丹品種的核型比較

15個紫斑牡丹品種的染色體圖、核型及模式圖見圖1,染色體各參數(shù)見表2和表3。由圖1可知,15種紫斑牡丹的染色體數(shù)目相同,均為2n=10條,染色體基數(shù)x=5,屬二倍體物種。

表2 15個紫斑牡丹品種的染色體參數(shù)Table 2 Chromosomes parameters of 15 varieties of Paeonia rockii

表3 15個紫斑牡丹品種染色體的核型Table 3 The karyotype of 15 varieties of Paeonia rockii

15個紫斑牡丹品種的染色體相對長度在15.39%～25.33%之間,其中“燕尾白”的變化范圍最大,其次是“紫蓮燈”和“藍鶴齊鳴”,“玉瓣繡球”的變化范圍最小,其次是“紅蓮”“玫瑰撒金”和“墨冠玉珠”。

15個紫斑牡丹品種的染色體長度比均小于2,在1.38～1.65之間,種間差異不大。其中“玉瓣繡球”的染色體長度差異最小,其次是“玫瑰撒金”和“紅蓮”,“燕尾白”的染色體長度差異最大。

根據(jù)相對長度系數(shù)可知,15個紫斑牡丹品種皆由中長(M2)和中短(M1)染色體組成,“粉西施”“矮紅繡球”和“紅蓮”染色體長短組成相同,且M2多于M1,其他品種染色體長短組成相同,均為M1多于M2。

15個紫斑牡丹品種的染色體類型為中部(m)、近端部(sm)或近中著絲粒染色體(st),且m型數(shù)量多于sm型和st型。“紅蓮”由m型和st型染色體組成,核型公式為2n=2x=8m+2st。其他14種紫斑牡丹皆由m、sm和st三種類型染色體組成,核型公式均為2n=2x=6m+2sm+2st。

圖1 15個紫斑牡丹品種的染色體圖片、核型圖及核型模式圖 Fig.1 Chromosome picture,karyotypes and idlograms of 15 varieties of Paeonia rockii

由圖1可知,15個紫斑牡丹品種都有隨體,不過隨體的數(shù)量和位置有差異。每個品種的第4對和第5對染色體均有隨體,有的在第1對上,有的在第2對上,有的第1對和第2對均有。每種紫斑牡丹的細胞中,兩條同源染色體并不是都有隨體,一般是其中一條有隨體,且不同細胞隨體的數(shù)量有所差異,結(jié)果見表3。

15個紫斑牡丹品種的著絲點指數(shù)在0.16～0.47之間,種間差異不明顯,平均指數(shù)0.37～0.39。臂比在1.15～5.18之間,其中“夜光杯”臂比差異最大,“灰鶴”差異最小,平均臂比在1.90～2.18之間,差異不大。15個品種的臂比超過2的百分比均為20%,核型均屬于2A型。

2.2 不同油用紫斑牡丹的核型進化程度分析

核型進化程度由核型不對稱系數(shù)來衡量[27]。15個紫斑牡丹品種的核型不對稱系數(shù)As.K在60.21%～62.13%之間,差異較小,比較接近50%,且核型均屬于2A型,核型對稱程度較高,說明15個紫斑牡丹品種進化程度均較為原始。“矮紅繡球”和“玫瑰撒金”的核型不對稱系數(shù)As.K最大,均為62.13%,是進化程度最高的,“紅蓮”的最小,最原始。進化程度為:“矮紅繡球”=“玫瑰撒金”>“夜光杯”>“燕尾白”>“玉瓣繡球”>“粉西施”>“世紀巨星”>“北極光”>“灰鶴”>“墨冠玉珠”>“紫云峰”>“紫蓮燈”>“藍鶴齊鳴”>“紫樓藏玉”>“紅蓮”。

Paszko[28]認為,新的核型不對稱系數(shù)AI能更準確地反映核型的不對稱性程度。由表3可知,15個紫斑牡丹品種的核型不對稱系數(shù)AI在3.86～5.81之間,變異幅度與核型不對稱系數(shù)As.K相近?！把辔舶住钡暮诵筒粚ΨQ系數(shù)AI最大,“紅蓮”的核型不對稱系數(shù)AI最小。依據(jù)核型不對稱系數(shù)AI,進化程度由高到低依次為:“燕尾白”“夜光杯”“紫蓮燈”“藍鶴齊鳴”“粉西施”“紫云峰”“北極光”“世紀巨星”“玉瓣繡球”“墨冠玉珠”“矮紅繡球”“紫樓藏玉”“玫瑰撒金”“灰鶴”“紅蓮”。

2.3 不同油用紫斑牡丹品種的親緣關系分析

2.3.1CVCL-CVCI散點圖

近緣類群之間的親緣關系也可由CVCL-CVCI散點圖[28]分析,萬娟等[34]、劉紅昌等[35]用此方法作了相關研究。由圖2可知,15種紫斑牡丹分布在4個區(qū)域,“藍鶴齊鳴”“紫云峰”“世紀巨星”“紫蓮燈”“北極光”“粉西施”“夜光杯”7個品種離得最近,集中在一個區(qū)域;“矮紅繡球”“玉瓣繡球”“紅蓮”“墨冠玉珠”“玫瑰撒金”“紫樓藏玉”6個品種離得較近,集中在一個區(qū)域;“灰鶴”離“紫樓藏玉”較近,但又獨立一隅,“燕尾白”離得最遠。從區(qū)域分布可初步看出15個紫斑牡丹品種親緣關系的遠近。

圖2 CVCL -CVCI散點圖 Fig.2 The scatter diagram of CVCL against CVCI

2.3.2不同油用紫斑牡丹品種的核型似近系數(shù)和遺傳距離及聚類結(jié)果

15個紫斑牡丹品種間的似近系數(shù)都比較大(表4),在0.93以上?！笆兰o巨星”和“北極光”之間的核型似近系數(shù)最大(0.999),核型進化距離最小(0.011),親緣關系最近;其次是“粉西施”和“紅蓮”;“燕尾白”和“紅蓮”的核型似近系數(shù)最小(0.930 6),核型進化距離最大(0.072),親緣關系最遠,其他種間的似近系數(shù)差異不大。

表4 15個紫斑牡丹品種的核型似近系數(shù)和進化距離Table 4 The karyotype resemblance-near coefficient and evolution distance of 15 varieties of Paeonia rockii

當核型似近系數(shù)為0.990 9時,15個紫斑牡丹品種聚為四類:“藍鶴齊鳴”“紫蓮燈”“紫云峰”“世紀巨星”“北極光”“粉西施”和“夜光杯”聚為第Ⅰ類,“灰鶴”和“紫樓藏玉”聚為第Ⅱ類,“矮紅繡球”“紅蓮”“玫瑰撒金”“玉瓣繡球”和“墨冠玉珠”聚為第Ⅲ類,“燕尾白”為第Ⅳ類;當似近系數(shù)為0.985 0時聚為三類,此時第Ⅰ類和第Ⅱ類聚為第Ⅴ類,當似近系數(shù)為0.975 4時聚為兩類,第Ⅴ類與第Ⅲ類聚為第Ⅵ類,“燕尾白”與其他油用牡丹遺傳距離最遠,還是單獨一類(圖3)。

圖3 15個紫斑牡丹品種的核型似近系數(shù)聚類分析 Fig.3 Clustering drawing of 15 varieties of Paeonia rockii by karyotype resemblance-near coefficients

3 討 論

芍藥屬染色體基數(shù)x=5[26],紫斑牡丹屬芍藥屬牡丹組,15個紫斑牡丹品種雖然花色不同,但均為二倍體,染色體數(shù)目相同,2n=10條,這與其他學者對鳳丹牡丹[24]、紫斑牡丹[25]、楊山牡丹[36]等的研究結(jié)果一致,均為二倍體,染色體數(shù)目也是2n=10條。

不考慮隨體,文獻報道較多的牡丹品種核型主要有兩種:2n=2x=6m+2sm+2st,2n=2x=10=8m+2st,如李思峰等[37]的楊山牡丹、王凱琪等[38]的黃牡丹、李子峰等[24]的鳳丹白牡丹、張贊平[19]的河南紫斑牡丹屬第一種核型,王凱琪等[38]的矮牡丹、于玲等[20]的5種甘肅紫斑牡丹屬第二種核型,史倩倩等[39]報道的30個中原牡丹品種核型均屬第一種核型,侯小改等[40]報道的14個牡丹品種中有4種屬于第一種核型,有8種屬于第二種核型。本研究中15個不同花色紫斑牡丹品種的核型亦分為兩類,除了“紅蓮”屬第二種核型外,其余14種都屬于第一種核型。說明牡丹品種雖繁多,但核型組成相對穩(wěn)定。本研究中“夜光杯”的核型屬于第一種,而于玲等[20]研究的“夜光杯”的核型屬于第二種,這可能與同一品種經(jīng)過多年的種植篩選發(fā)生了結(jié)構變異有關。

雖然在15個紫斑牡丹品種中都發(fā)現(xiàn)了隨體,但是隨體的數(shù)量和位置有差異,隨體主要在第1,2,4,5對染色體上,這與史倩倩等[39]研究結(jié)果類似。本研究發(fā)現(xiàn),品種內(nèi)同株根尖不同細胞觀察到的隨體數(shù)量和位置有差異,有的細胞觀察不到隨體,有的細胞在第5對上有,有的第1對或第4對上有;有的觀察到同源染色體中的一條有,有的一對同源染色體都有,體現(xiàn)了隨體的不穩(wěn)定性?？赡芘c制片、觀察、判斷等有關[36,40-41]。芍藥屬植物染色體的隨體屬于微型隨體[36],因此在染色體制片操作中如果染色體濃縮過度和施壓過重,就觀察不到,或者兩個微型隨體相連也不易被觀察到,只有隨體較延伸時才易被識別,因此會出現(xiàn)上述隨體有無、雜合和純合的多態(tài)現(xiàn)象。在核型分析中,隨體是重要的核型特征,具有種的特異性。對于牡丹這種微型隨體的有無、雜合和純合的多態(tài)現(xiàn)象,作者認為可作為牡丹的一個細胞學特征,但在確定牡丹的核型時,因為隨體的數(shù)量和位置往往取決于制片效果,不能準確確定隨體的數(shù)量和位置,因此是否作為此物種的特異性值得進一步探討。

15個紫斑牡丹品種的核型均屬于較為對稱的2A型,核型不對稱系數(shù)As.K在60.21%～62.13%之間,比較接近50%,進化比較原始。這與王凱琪等[38]、史倩倩等[39]、張贊平和侯小改[36]研究的牡丹品種結(jié)果類似,可以看出牡丹的核型進化比較原始。核型不對稱系數(shù)AI在3.86～5.81之間,數(shù)值比較小,也反映了在進化上比較原始,但是核型不對稱系數(shù)As.K和AI分別分析15個紫斑牡丹品種核型進化程度的結(jié)果不同。這可能與兩者涉及的參數(shù)不同有關,核型不對稱系數(shù)As.K用到的參數(shù)為長臂總長和全組染色體總長,參數(shù)比較單一;核型不對稱系數(shù)AI涉及的參數(shù)為染色體長度和著絲點指數(shù),變異系數(shù)是由相應標準差和平均值計算而得。目前報道中用核型不對稱系數(shù)As.K分析核型進化程度的最多,至于兩種方法中哪種能更準確地反映核型的不對稱性程度,有待進一步證明。

CVCL-CVCI散點圖結(jié)果在一定程度上反映了15個紫斑牡丹品種的親緣關系,15個品種分別集中在4個區(qū)域,“灰鶴”雖單獨一隅但離“矮紅繡球”“玉瓣繡球”“紅蓮”“墨冠玉珠”“玫瑰撒金”“紫樓藏玉”這一區(qū)域較近,說明其親緣關系也較近。這與核型似近系數(shù)聚類分析結(jié)果有相似之處,當核型似近系數(shù)為0.990 9時,15個紫斑牡丹品種聚為4類(圖3):除“灰鶴”和“紫樓藏玉”聚為一類外,其他三類聚類結(jié)果與散點圖結(jié)果相同。但當核型似近系數(shù)為0.985 0時,15個紫斑牡丹品種聚為3類,此時“灰鶴”“紫樓藏玉”和“藍鶴齊鳴”和“紫蓮燈”“紫云峰”“世紀巨星”“北極光”“粉西施”和“夜光杯”聚為一類,與散點圖結(jié)果相反。這兩種方法都反映了親緣關系,CVCL-CVCI散點圖分析涉及到染色體長度和著絲點指數(shù)各參數(shù),核型似近系數(shù)聚類分析除染色體長度、著絲點指數(shù)各參數(shù)外還有臂比等參數(shù),后者分析涉及參數(shù)多,分析更全面細致。

4 結(jié) 論

15種油牡丹雖都屬紫斑牡丹,但核型各參數(shù):染色體相對長度、平均著絲點指數(shù)、臂比、平均臂比、染色體長度比、核不對稱系數(shù)等大小是有差異的;品種間各核型參數(shù)大小變化范圍相近,核型進化程度均較原始,且核型似近系數(shù)比較高,在0.93之上,說明這15種油牡丹親緣關系比較近;核型進化程度和親緣關系與花色、花型不存在相關性。