楊學(xué)山 李潔春 楊 柳 李俊娥 祝 霞

(1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,蘭州 730070; 2.甘肅省葡萄與葡萄酒工程學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,蘭州 730070)

0 引言

釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae,S.cerevisiae)在酒精發(fā)酵過程中代謝產(chǎn)生的高級醇、酯、醛、酸等化合物,是塑造葡萄酒香氣風(fēng)格與典型性的關(guān)鍵因子[1-2]。但在葡萄酒釀造過程中,發(fā)酵菌株會受到高糖、低pH值、乙醇、氧化脅迫等因素的影響,導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)的抗氧化防御系統(tǒng)失衡,產(chǎn)生活性氧(Reactive oxygen species,ROS),破壞細(xì)胞脂質(zhì)、蛋白質(zhì)和DNA等細(xì)胞成分,抑制菌株的生長和發(fā)酵[3-4]。此外,ROS還會干擾輔助因子的平衡,改變或破壞靶分子結(jié)構(gòu),導(dǎo)致關(guān)鍵酶活力降低或喪失,影響發(fā)酵香氣物質(zhì)的合成[5]。因此,提高發(fā)酵過程中釀酒酵母菌株的抗氧化能力,保持其較高的細(xì)胞活力對葡萄酒釀造具有重要意義。目前,國際葡萄與葡萄酒組織已批準(zhǔn)酵母多糖作為發(fā)酵助劑應(yīng)用于釀酒生產(chǎn)[6],加之使用綠色安全、便捷、可控和通用性較強(qiáng),使其成為提升葡萄酒品質(zhì)的研究熱點(diǎn)。

在葡萄酒實(shí)際釀造生產(chǎn)中,不同葡萄品種間的酶類和非酶類抗氧化成分組成相對復(fù)雜且差異較大。而人工配制的模擬葡萄汁成分明確,既可以滿足微生物生長的營養(yǎng)需求,又可以消除發(fā)酵體系中其他抗氧化成分對試驗(yàn)結(jié)果的影響。為此,本文以模擬葡萄汁為試材,在酒精發(fā)酵前添加不同質(zhì)量濃度的水溶性β-葡聚糖,探究其對酵母細(xì)胞的抗氧化活性和揮發(fā)性香氣化合物的影響規(guī)律,以期為深入解析水溶性β-葡聚糖對葡萄酒發(fā)酵香氣化合物的促進(jìn)作用機(jī)制及其生產(chǎn)應(yīng)用提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

釀酒酵母菌株Aroma White,購自意大利Enartis公司。

水溶性β-葡聚糖SG 90,購于安琪酵母股份有限公司;糖鏈結(jié)構(gòu)以β-1,3糖苷鍵為主,含有部分β-1,6糖苷鍵支鏈,純度85%以上,分子質(zhì)量200～500 ku,具有良好的水溶性,推薦用量200～500 mg/L。

苯乙醇、正戊醇、正辛醇、乙酸乙酯、乙酸異戊酯、乙酸苯乙酯、乙酸己酯、癸酸乙酯、辛酸乙酯、己酸乙酯、丁酸乙酯等香氣標(biāo)準(zhǔn)品均購自美國Sigma公司。

SOD、ATP酶活力測定試劑盒,還原型谷胱甘肽(Glutathione,GSH)、ROS、丙二醛(Malondialdehyde,MDA)檢測試劑盒,購自南京建成生物工程研究所;L-蘋果酸、纖維二糖、肌醇、B族維生素、生物素等均為國產(chǎn)分析純,購自上海源葉生物科技有限公司;檸檬酸、硫酸鎂、硫酸錳、酒石酸氫鉀、偏重亞硫酸鈉等常規(guī)試劑均為國產(chǎn)分析純,購自天津光復(fù)化工研究所。

1.2 儀器與設(shè)備

TRACE1310-ISQ型氣相色譜-質(zhì)譜儀,美國Thermo Scientific公司;DB-WAX型氣相色譜柱(30 m×0.25 mm,0.25 μm),美國Agilent Technologies公司;固相微萃取頭,50/30 μm DVB/CAR-PDMS,上海安譜科學(xué)儀器有限公司;DK-S12型電熱恒溫水浴鍋,上海森信試驗(yàn)儀器有限公司;PHS-3C型pH計(jì),上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司;LRH-150型生化培養(yǎng)箱,上海一恒科學(xué)儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1模擬葡萄汁體系構(gòu)建

模擬葡萄汁的配制參考文獻(xiàn)[14]的方法。其中葡萄糖100 g/L、果糖100 g/L;磷酸氫二銨1 500 mg/L、磷酸二氫鉀750 mg/L、硫酸鉀500 mg/L、氯化鈣0.117 mg/L;肌醇20 mg/L、維生素B515 mg/L、維生素B10.25 mg/L、維生素B60.25 mg/L、生物素0.003 mg/L、維生素B32 mg/L;L-蘋果酸3.0 g/L、檸檬酸300 mg/L、酒石酸氫鉀2.5 g/L。模擬汁添加40 mg/L SO2(偏重亞硫酸鈉計(jì)),NaOH調(diào)節(jié)pH值至3.5。

1.3.2釀酒酵母菌株活化與模擬葡萄汁發(fā)酵

按產(chǎn)品說明書推薦方法對釀酒酵母菌株進(jìn)行活化。將活性干酵母溶于10倍體積無菌水中,37℃靜置20 min,再加入等體積的模擬汁,28℃活化 25 min。根據(jù)課題組前期研究結(jié)果[15],將活化后的Aroma White菌株(0.2 g/L),接種于分別添加300、400、500 mg/L水溶性β-葡聚糖的模擬葡萄汁中,以未添加水溶性β-葡聚糖為對照(CK),20℃恒溫培養(yǎng)箱進(jìn)行酒精發(fā)酵,殘?zhí)琴|(zhì)量濃度小于4 g/L時(shí)結(jié)束發(fā)酵。從接入釀酒酵母菌株(0 h)開始,每隔24 h測定酵母細(xì)胞的生物量(以600 nm波長處的吸光度(OD600)表征),繪制Aroma White菌株生長曲線。平行重復(fù)3次,結(jié)果取平均值。下同。

1.3.3釀酒酵母細(xì)胞抗氧化活性測定

1.3.3.1Aroma White細(xì)胞中ATP酶活力測定

分別在發(fā)酵的第2(初期)、3(中前期)、4(中期)、7天(末期)取樣(下同)。參照文獻(xiàn)[16]的方法并做修改,10 mL發(fā)酵樣液在3 500 r/min條件下離心10 min后傾倒上清液,收集酵母細(xì)胞;ATP酶活力測定不能引入磷,因此用5 mL 0.9% NaCl洗滌3次后,稱量,再次加入0.9% NaCl,冰水浴超聲破碎(4℃,功率360 W,開啟5 s,停止7 s,共計(jì)1 min),制成0.063 g/mL的勻漿。其余操作按照試劑盒說明書進(jìn)行。

1.3.3.2Aroma White細(xì)胞中SOD酶活力測定

參照文獻(xiàn)[16]的方法并做修改,收集酵母細(xì)胞,準(zhǔn)確稱取組織質(zhì)量,用20倍體積的磷酸鹽緩沖液(Phosphate buffer saline,PBS)以1 000 r/min離心10 min洗滌酵母細(xì)胞,重復(fù)2次后,再加入20倍體積的0.9% NaCl,以3 500 r/min離心10 min,冰水浴條件下超聲破碎,制成10%的組織勻漿,將勻漿稀釋5倍,按照試劑盒說明書進(jìn)行測定。

1.3.3.3Aroma White細(xì)胞中GSH含量測定

按照1.3.3.2節(jié)的方法,制成10%的細(xì)胞勻漿,按照南京建成試劑盒說明書進(jìn)行測定。

1.3.3.4Aroma White細(xì)胞中ROS含量測定

取發(fā)酵樣液,3 500 r/min離心10 min收集細(xì)胞,PBS洗滌1～2次,將離心收集的細(xì)胞用PBS重懸,按照試劑盒說明書加入熒光探針(2′,7′-Dichlorodihydrofluorescein diacetate,DCFH-DA),按預(yù)試驗(yàn)確定的濃度10 μmol/mL進(jìn)行試驗(yàn)。在最佳激發(fā)波長500 nm、最佳發(fā)射波長525 nm條件下進(jìn)行熒光檢測。

1.3.3.5Aroma White細(xì)胞中MDA含量測定

按照1.3.3.2節(jié)的方法制成10%的細(xì)胞勻漿,參照MDA含量測定試劑盒說明書進(jìn)行操作。

1.3.4揮發(fā)性香氣物質(zhì)分析

參照文獻(xiàn)[17]的香氣物質(zhì)萃取方法及GC-MS(氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用)條件,并略作修改。

1.3.4.1香氣成分富集

取8 mL待測酒樣,添加2.5 g NaCl、10 μL 2-辛醇(質(zhì)量濃度為81.06 mg/L),放入恒溫加熱磁力攪拌器中,40℃水浴平衡30 min,插入萃取針(旋出萃取頭),頂空萃取30 min。

1.3.4.2GC-MS條件

GC條件:色譜柱DB-WAX 60 m×2.5 mm×0.25 μm,進(jìn)樣口溫度240℃,傳輸線溫度230℃,離子源溫度250℃,不分流進(jìn)樣;載氣(He)流速1 mL/min;進(jìn)樣時(shí)間5 min;柱溫升溫程序:40℃保持5 min,以3.5℃/min升至180℃,保持15 min。

MS條件:電子轟擊離子源(EI);電子能量70 eV;傳輸線溫度180℃;離子源溫度200℃;質(zhì)譜掃描范圍50～350 m/z。

定性定量分析:通過NIST-11、Wiley及香精香料譜庫對香氣化合物質(zhì)譜圖進(jìn)行初步檢索比對,并結(jié)合人工圖譜解析進(jìn)行定性分析,確認(rèn)各個(gè)香氣物質(zhì)的化學(xué)成分。對已有標(biāo)準(zhǔn)品的高級醇、酯類和萜烯類等化合物,利用標(biāo)準(zhǔn)曲線(R2>0.995)定量,無標(biāo)準(zhǔn)品的化合物采用化學(xué)結(jié)構(gòu)、官能團(tuán)相似、碳原子數(shù)相近的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)進(jìn)行半定量。

1.4 數(shù)據(jù)分析

測定均重復(fù)3次,取平均值,試驗(yàn)數(shù)據(jù)用Microsoft Excel 2010 計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)偏差,采用SPSS 19.0進(jìn)行方差分析,用Duncan’s多重差異顯著分析;并用Origin 2018作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 水溶性β-葡聚糖對Aroma White菌株生長的影響

由圖1可知,在整個(gè)酒精發(fā)酵過程中,不同質(zhì)量濃度的水溶性β-葡聚糖對Aroma White菌株生物量均具有明顯的促進(jìn)作用。發(fā)酵3 d后,酵母細(xì)胞的生長趨于穩(wěn)定;在發(fā)酵時(shí)間為第7天時(shí),釀酒酵母細(xì)胞的OD600由大到小依次為300 mg/L(2.509)、400 mg/L(2.461)、500 mg/L(2.398)、CK(2.046)。與CK相比,分別提高22.63%、20.28%和17.20%。綜合分析,在模擬葡萄汁酒精發(fā)酵時(shí)添加水溶性β-葡聚糖有利于Aroma White菌株的生長,且添加量為300 mg/L時(shí)效果最佳。

圖1 水溶性β-葡聚糖對釀酒酵母生物量的影響

2.2 水溶性β-葡聚糖對Aroma White菌株抗氧化能力的影響

2.2.1ATP酶活力

ATP酶廣泛存在于細(xì)胞膜系統(tǒng)上,在能量轉(zhuǎn)換、物質(zhì)運(yùn)輸傳遞方面起著至關(guān)重要的作用,主要通過調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)外滲透壓平衡和細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)與功能的完整性維持細(xì)胞正常的生理活性[18]。如圖2(不同小寫字母表示在P<0.05水平下組內(nèi)差異顯著,下同)所示,受試組酵母細(xì)胞的ATP酶活力在中、后期顯著升高(P<0.05),在第4天時(shí)明顯高于對照組(P<0.05),分別比CK增加39.59%、36.43%和21.90%。不同質(zhì)量濃度的水溶性β-葡聚糖處理組之間也存在差異,其中300 mg/L處理組在酒精發(fā)酵第7天時(shí),ATP酶活力最高,比CK顯著增加57.04%;400 mg/L和500 mg/L處理組比CK分別提高37.24%和30.13%。

圖2 水溶性β-葡聚糖對釀酒酵母細(xì)胞中ATP酶活力的影響

2.2.2SOD酶活力

SOD酶作為酵母的主要抗氧化酶,能特異性地清除體內(nèi)的氧自由基,SOD酶活力的變化能夠直接地反映酵母細(xì)胞對氧化脅迫應(yīng)答的水平[19]。從圖3可知,在發(fā)酵的前期和中期,酵母細(xì)胞中的SOD酶活力增高。在發(fā)酵的第2天,300 mg/L和400 mg/L 水溶性β-葡聚糖處理組SOD酶活力分別比CK增加了24.85%和12.25%;酒精發(fā)酵第4天,300 mg/L處理組SOD酶活力最高,比CK提高22.43%。說明外源性添加水溶性β-葡聚糖能增加菌株SOD酶活力,從而提高細(xì)胞的抗氧化能力。

圖3 水溶性β-葡聚糖對釀酒酵母細(xì)胞中SOD酶活力的影響

2.2.3GSH含量

還原型谷胱甘肽(GSH)和氧化性谷胱甘肽(Glutathione oxidized,GSSG)的氧化還原平衡對于調(diào)節(jié)細(xì)胞ROS水平至關(guān)重要,其中GSH可將部分巰基形成的二硫橋還原,防止含巰基的蛋白質(zhì)與酶免受過氧化物的損害[20-22]。由圖4可知,各處理組細(xì)胞中GSH含量(質(zhì)量比)在發(fā)酵過程中均高于CK(P<0.05),酒精發(fā)酵第7天,300 mg/L處理組的GSH含量最高,比CK提高76.50%,表明水溶性β-葡聚糖作為氧化刺激物,可以通過氧化應(yīng)激來誘導(dǎo)提高GSH的合成代謝。綜上,在酒精發(fā)酵前添加水溶性β-葡聚糖可明顯促進(jìn)酵母細(xì)胞中GSH的含量,且質(zhì)量濃度為300 mg/L時(shí)效果最佳。

圖4 水溶性β-葡聚糖對釀酒酵母細(xì)胞中GSH含量的影響

2.2.4ROS含量

在正常的生理代謝活動中,適宜水平的ROS可作為細(xì)胞信號傳導(dǎo)、基因表達(dá)和調(diào)控動態(tài)氧化平衡的媒介。當(dāng)細(xì)胞內(nèi)ROS含量過高時(shí),會攻擊DNA與蛋白質(zhì),并通過誘發(fā)過氧化作用影響細(xì)胞膜的流動性與穩(wěn)定性[23]。圖5表明,在酒精發(fā)酵過程中,酵母細(xì)胞中的ROS含量逐漸降低(以熒光值表征細(xì)胞內(nèi)ROS含量)。在發(fā)酵第2天時(shí),處理組細(xì)胞中的ROS含量均顯著低于CK(P<0.05);第3天時(shí),各組細(xì)胞中ROS含量由小到大依次為300 mg/L、400 mg/L、500 mg/L、CK,300 mg/L處理組較CK、400 mg/L和500 mg/L處理組分別降低44.14%、16.95%和21.20%;在第7天,各處理組中ROS含量無明顯差異,但與CK差異顯著(P<0.05)。

圖5 水溶性β-葡聚糖對釀酒酵母細(xì)胞中ROS含量的影響

2.2.5MDA含量

釀酒酵母細(xì)胞在發(fā)酵過程中可以產(chǎn)生氧自由基,攻擊生物膜的多不飽和脂肪酸,引起脂質(zhì)過氧化作用。MDA是膜脂過氧化的主要產(chǎn)物之一,可作為評價(jià)其作用強(qiáng)弱的重要指標(biāo)[20,22]。由圖6可知,酒精發(fā)酵前添加水溶性β-葡聚糖會降低釀酒酵母細(xì)胞內(nèi)MDA含量。在發(fā)酵的第2天,處理組與CK不顯著,第3、4天,處理組的MDA含量均顯著低于CK(P<0.05)。其中第4天時(shí),供試組MDA含量由小到大依次為300 mg/L組(1.49 mg/g)、500 mg/L組(2.17 mg/g)、400 mg/L組(2.74 mg/g)、CK組(4.22 mg/g),其中300 mg/L處理組較對照組顯著降低64.69%。由此表明,添加水溶性β-葡聚糖在酒精發(fā)酵(AF)前期和中期顯著減弱了膜脂過氧化反應(yīng),減弱了MDA對酵母細(xì)胞膜的損傷,且以添加質(zhì)量濃度為300 mg/L時(shí)效果最佳。

圖6 水溶性β-葡聚糖對釀酒酵母細(xì)胞中MDA含量的影響

2.3 水溶性β-葡聚糖對揮發(fā)性香氣化合物的影響

外源性添加不同質(zhì)量濃度的水溶性β-葡聚糖模擬汁發(fā)酵酒樣中的主要香氣物質(zhì)GC-MS檢測結(jié)果如圖7(圖中星號表示處理組與CK或處理組之間差異顯著(P<0.05),ns表示處理組之間差異不顯著(P>0.05))所示。試驗(yàn)共檢測出89種香氣化合物,其中酯類37種、高級醇類21種、酸類15種、萜烯類4種、其他類13種。

圖7 不同處理組酒樣的揮發(fā)性香氣物質(zhì)

酯類物質(zhì)對葡萄酒的花果香氣具有積極貢獻(xiàn),主要包括乙酸酯、脂肪酸乙酯和其他酯類。本試驗(yàn)共檢出4種乙酸酯,占酯類物質(zhì)總量的9.42%～16.42%。各處理組之間乙酸酯類物質(zhì)總量之間無顯著差異(P>0.05),但與CK相比,水溶性β-葡聚糖處理組的乙酸乙酯含量分別顯著增加19.84%、9.55%和31.32%(圖7a)。與CK相比,300 mg/L和400 mg/L處理組中脂肪酸乙酯含量分別顯著增加了47.32%和51.42%(圖7b)。各處理組中辛酸乙酯和癸酸乙酯的含量最高,尤其是辛酸乙酯含量比CK分別提升45.39%、47.65%和51.42%。酯類物質(zhì)總質(zhì)量濃度由高到低為400 mg/L組(10 626.40 μg/L)、300 mg/L組(10 434.24 μg/L)、500 mg/L組(9 096.53 μg/L)、CK組(6 509.88 μg/L)(圖7d)。

在所有的發(fā)酵酒樣中,異戊醇的含量最高,約占高級醇類化合物含量的55%以上。其次是苯乙醇和異丁醇。300 mg/L和400 mg/L處理組之間的異戊醇含量沒有顯著差異,但顯著高于CK(P<0.05)(圖7e)。各試驗(yàn)組共檢出14種酸類物質(zhì),質(zhì)量濃度依次為913.91、1 120.29、1 187.56、1 214.85 μg/L(圖7f)。與對照組相比,300、400、500 mg/L處理組的辛酸含量分別提升28.88%、27.42%、29.94%,但均未超過感官閾值,對葡萄酒香氣不存在負(fù)面影響。處理組萜烯類物質(zhì)比CK顯著增加,但是各處理組之間不存在顯著差異(P>0.05)(圖7g)。

參考文獻(xiàn)[1]的方法,選擇所有風(fēng)味活性值(Odor activity value,OAV)大于0.1的發(fā)酵香氣成分進(jìn)行主成分分析(Principal component analysis,PCA)。由圖8可知,PC1和PC2分別占數(shù)據(jù)總體方差的61.04%和25.45%,二者累計(jì)貢獻(xiàn)率為86.49%,可明顯區(qū)分水溶性β-葡聚糖處理組與CK酒樣。辛酸乙酯、辛酸、癸酸乙酯,花香、熱帶水果、脂肪味及300 mg/L和400 mg/L處理組酒樣主要分布在第一象限;己酸乙酯和500 mg/L處理組酒樣分布在第四象限,而CK酒樣分布在第三象限且無任何香氣成分分布?？傮w分析,水溶性β-葡聚糖處理有利于促進(jìn)辛酸乙酯、癸醛、丁酸乙酯、癸酸乙酯、辛酸、芳樟醇等香氣化合物的生成,酒樣的花香、熱帶水果和柑橘類香氣潛在特征較CK更加突出。

圖8 水溶性β-葡聚糖處理酒樣中香氣化合物及香氣特征的主成分分析

2.4 釀酒酵母細(xì)胞ATP酶活力及抗氧化能力與揮發(fā)性香氣化合物的相關(guān)性分析

將增香效果最突出的300 mg/L水溶性β-葡聚糖處理組中,OAV大于0.1的揮發(fā)性香氣化合物,分別與釀酒酵母細(xì)胞ATP酶活力及抗氧化能力進(jìn)行Pearson相關(guān)性分析。結(jié)果表明(圖9),辛酸乙酯質(zhì)量濃度與ATP酶活力存在強(qiáng)正相關(guān)性(r=0.92),與ROS質(zhì)量濃度和MDA含量存在強(qiáng)負(fù)相關(guān)(r<-0.9)。辛酸乙酯質(zhì)量濃度與SOD酶活力和GSH含量均存在較強(qiáng)正相關(guān)性(r>0.8),辛酸、辛酸乙酯、芳樟醇質(zhì)量濃度與ROS含量和MDA含量存在較強(qiáng)的負(fù)相關(guān)性(r<-0.8),乙酸異戊酯質(zhì)量濃度與MDA和ROS含量存在正相關(guān)性(r>0.6),這可能與釀酒酵母細(xì)胞合成分泌的酯酶對不同酯類底物的水解平衡有密切關(guān)系。

圖9 釀酒酵母細(xì)胞抗氧化能力與揮發(fā)性香氣化合物的相關(guān)性熱圖

3 討論

文獻(xiàn)[18]發(fā)現(xiàn)細(xì)胞對大部分的外界脅迫反應(yīng)都集中在線粒體,尤其是在電子傳遞鏈(Electron-transport chain,ETC)上。外界的脅迫使酵母細(xì)胞的ATP需求增加,當(dāng)線粒體無法產(chǎn)生足夠的ATP支撐細(xì)胞抵抗脅迫時(shí),就會影響到細(xì)胞增殖。本試驗(yàn)結(jié)果表明,外源性添加水溶性β-葡聚糖可以顯著增加釀酒酵母ATP酶活力,以利于增強(qiáng)線粒體功能來提高細(xì)胞對多種脅迫的耐受性。GSH可使細(xì)胞內(nèi)巰基酶的活性基團(tuán)維持還原狀態(tài),保證了抗氧化酶發(fā)揮生理功能[21];同時(shí)GSH自身也可夠清除ROS自由基,延遲細(xì)胞凋亡[24]。本試驗(yàn)中,水溶性β-葡聚糖能顯著提高釀酒酵母細(xì)胞中SOD和GSH活性(P<0.05),降低MDA水平,且與其抗氧化能力之間存在一定劑量-效應(yīng)關(guān)系。其中300 mg/L水溶性β-葡聚糖處理組中抗氧化酶活力較高,尤其是發(fā)酵中、末期,GSH對細(xì)胞維持較高水平的抗氧化能力具有積極作用,從而使發(fā)酵菌株保持較高的生物量,有利于合成和分泌更多的揮發(fā)性香氣化合物。

本試驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí),添加300 mg/L的水溶性β-葡聚糖后,模擬汁發(fā)酵酒樣中的乙酸酯、脂肪酸乙酯類和高級醇的含量顯著增加(P<0.05)。究其原因,可能與水溶性β-葡聚糖提高了ATP酶的活力有關(guān)[25]?；盍︼@著增高的ATP酶可催化產(chǎn)生更多的ATP參與脂肪酸活化,并促進(jìn)酯化反應(yīng)的進(jìn)行,提高了酒樣中己酸乙酯、丁酸乙酯、辛酸乙酯、癸酸乙酯等中鏈脂肪酸乙酯的含量。水溶性β-葡聚糖處理組中高級醇含量顯著高于對照組(P<0.05),也可能與S.cerevisiae中ATP酶活力增強(qiáng),分解更多的ATP有利于為Ehrlich途徑提供能量[26]。此外,模擬汁發(fā)酵酒樣也檢測到了微量的萜烯類化合物,300 mg/L 處理組中萜烯類化合物含量較對照組增加80.10%,這與發(fā)酵過程酵母中的ROS降低,減少了萜烯類等香氣物質(zhì)的氧化降解作用直接相關(guān)[27],也與文獻(xiàn)[28]研究證明GSH可以降低某些重要的酯類、萜烯類等香氣化合物的氧化損失結(jié)果一致。

相關(guān)性熱圖分析結(jié)果表明,300 mg/L水溶性β-葡聚糖處理對苯乙醇、正辛醇的生成促進(jìn)作用最為明顯,表明水溶性β-葡聚糖處理有利于促進(jìn)酵母細(xì)胞的Harris代謝途徑,提升酒樣的醇香和花香。脂肪酸參與酯類物質(zhì)生成,是合成酯類風(fēng)味化合物不可或缺的前體物質(zhì),其含量對于水果香氣特征的感知至關(guān)重要[29]。水溶性β-葡聚糖處理組的辛酸含量較對照組均有增加,同時(shí)引起了辛酸乙酯含量較對照組均顯著增加。其中300 mg/L處理組辛酸乙酯含量增加最為明顯,推測可能是水溶性β-葡聚糖促進(jìn)了酵母脂肪酸的代謝,進(jìn)一步轉(zhuǎn)化生成了脂肪酸乙酯,這與文獻(xiàn)[30]的研究結(jié)果類似。但抗氧化活性與其他酯類化合物的轉(zhuǎn)化水解平衡,尤其對酯酶活力的調(diào)控關(guān)系需要進(jìn)一步探討。

4 結(jié)束語

在模擬葡萄汁中外源性添加水溶性β-葡聚糖,能夠促進(jìn)酒精發(fā)酵過程中酵母細(xì)胞的生長,有效降低細(xì)胞內(nèi)ROS的積累,使ATP酶活力、SOD酶活力和GSH含量保持相對較高的水平,抑制MDA的生成,具有良好的抗氧化能力。同時(shí),300 mg/L水溶性β-葡聚糖還可以明顯提高模擬葡萄汁發(fā)酵酒樣中酯類、高級醇類物質(zhì)的含量,且與釀酒酵母細(xì)胞的抗氧化能力呈高度正相關(guān)。綜合分析,外源性添加300 mg/L水溶性β-葡聚糖,可以促進(jìn)釀酒酵母的生長、提高細(xì)胞抗氧化水平,增強(qiáng)發(fā)酵香氣化合物的合成,具有應(yīng)用在葡萄酒/果酒增香釀造的潛力。