馮 毅 ，王小峰 ，白西民 ，姚 勝 ，黨俊濤 ，趙云潔 ，蔡 冰

（1）渭南市中心醫(yī)院神經(jīng)外科;2）病理科，陜西 渭南 714000）

膠質(zhì)瘤是常見的原發(fā)性腦腫瘤。據(jù)報(bào)道，每年約有14 000 例新增的膠質(zhì)瘤患者[1]，且老年人具有較高的發(fā)病率。盡管目前手術(shù)切除以及放化療等醫(yī)學(xué)技術(shù)取得了很大的進(jìn)步，但患者的預(yù)后仍然較差，臨床上仍無(wú)法徹底治愈惡性程度較高的膠質(zhì)瘤。因此，探索膠質(zhì)瘤的潛在發(fā)病機(jī)制，尋找新的預(yù)后標(biāo)志物迫在眉睫。miRNA 是由18～25 個(gè)核苷酸組成的非編碼RNA，已被廣泛報(bào)道參與調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的生理過(guò)程[2-3]，通過(guò)與靶mRNA 的異常表達(dá)和交叉調(diào)節(jié)可作為腫瘤的診斷和預(yù)后標(biāo)志物。例如：miR-4 319 在甲狀腺癌組織和細(xì)胞中下調(diào)，抑制甲狀腺癌細(xì)胞的增殖、遷移和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化[4]。miR-149 是腫瘤中具有廣泛調(diào)控作用的miRNA，由2q37.3 上的MIR149 基因編碼。Xu B 等[5]報(bào)道，促進(jìn)miR-149-5p 表達(dá)可增強(qiáng)替莫唑胺對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的毒性。但miR-149-5p 在膠質(zhì)瘤中的作用機(jī)制尚不清楚。因此，本研究將探討miR-149-5p 對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞惡性生物學(xué)行為的調(diào)控作用及其具體作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 臨床樣本收集

收集在渭南市中心醫(yī)院就診并確診為膠質(zhì)瘤患者的腫瘤組織樣本30 例，在距腫瘤組織2 cm處獲得相鄰的癌旁組織樣本（即對(duì)照組），在收樣前患者知情并簽署知情同意書。采集樣本的患者除手術(shù)治療外未接受其他治療。本研究工作遵循世界醫(yī)學(xué)協(xié)會(huì)赫爾辛基宣言進(jìn)行，同時(shí)獲得了渭南市中心醫(yī)院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)（2023 研004-3）。

1.2 細(xì)胞系

膠質(zhì)瘤細(xì)胞系A(chǔ)172（貨號(hào)：CL-0012，Pricella，武漢）、U251（貨號(hào)：CL-0237，Pricella，武漢）、HS683（貨號(hào)：CL-0362，Pricella，武漢）、H4（貨號(hào)：CBP60590，Cobioer，南京）。人正常星形膠質(zhì)細(xì)胞HA1800（貨號(hào)：AC340443）和293T 細(xì)胞（貨號(hào)：KMCC-001-0255）購(gòu)自上海中喬新舟生物科技有限公司。

1.3 主要試劑

90%高糖DMEM 培養(yǎng)基、DMEM 培養(yǎng)基購(gòu)自上海中喬新舟生物科技有限公司。PrimeScript?RT 試劑盒和gDNA Eraser 購(gòu)自Takara。NC mimic、miR-149-5p mimic、NC inhibitor 和miR-149-5p inhibitor 序列合成由吉瑪基因提供技術(shù)支持。MSH5 抗體購(gòu)自ThermoFisher Scientific。GAPDH、GSK3β、β-catenin、AXIN2 一抗購(gòu)自Abcam。Annexin V-FITC/PI 凋亡試劑盒、胰蛋白酶、CCK-8 試劑盒和雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒購(gòu)自北京Solarbio。Hoechst33342 試劑、Wnt 通路抑制劑Triptonide 以及Wnt 通路激活劑HLY78 購(gòu)自MedChemExpress。熒光顯微鏡購(gòu)自萊卡。離心機(jī)購(gòu)自深圳瑞沃德。細(xì)胞培養(yǎng)箱購(gòu)自Eppendorf。Bio-RAD 蛋白成像系統(tǒng)購(gòu)自上海艾研。

1.4 細(xì)胞培養(yǎng)

A172、U251、HS683、H4 細(xì)胞分別接種于含10% FBS、1% P/SH 的DMEM 培養(yǎng)基。A1800 細(xì)胞接種于含10% FBS 的高糖DMEM 培養(yǎng)基中。293T 細(xì)胞培養(yǎng)在含10% FBS、1% Glutamax 和1%雙抗的DMEM 培養(yǎng)基內(nèi)。培養(yǎng)基置于37 ℃、5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中。

1.5 細(xì)胞轉(zhuǎn)染和處理

取生長(zhǎng)良好的A172 細(xì)胞，經(jīng)胰蛋白酶消化后接種于不含抗生素的培養(yǎng)基中。次日，根據(jù)Lipofectamine 2000 脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑盒說(shuō)明書，分別將NC mimic、miR-149-5p mimic、NC inhibitor和miR-149-5p inhibitor、sh-NC、sh-MSH5、sh-MSH5+miR-149-5pinhibitor 以及 pcDNA-MSH5分別轉(zhuǎn)染至A172 細(xì)胞。待細(xì)胞培養(yǎng)48 h 后，分別檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率，成功轉(zhuǎn)染的細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。轉(zhuǎn)染的pcDNA-MSH5 的A172 細(xì)胞再根據(jù)試劑說(shuō)明分別用Triptonide 和HLY78 處理。

1.6 RT-qPCR 實(shí)驗(yàn)

TRIzol 試劑提取總RNA，并使用PrimeScript?RT 試劑盒和gDNA Eraser 將1 000 ng RNA 逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。使 用SYBR? Premix Ex Taq? II 和Applied Biosystems 7 500 實(shí)時(shí)PCR 系統(tǒng)進(jìn)行實(shí)時(shí)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。2-ΔΔCt法計(jì)算目標(biāo)基因的相對(duì)表達(dá)。U6 作為miRNA 的內(nèi)參。引物序列見表1。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequences

1.7 CCK-8 實(shí)驗(yàn)

CCK-8 用于測(cè)定細(xì)胞活力。調(diào)整細(xì)胞密度，向96 孔板的每孔中接種1 000 個(gè)A172 細(xì)胞，每孔100 μL。培養(yǎng)板置于5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。在培養(yǎng)的第0、24、48、72、96 h 向每孔中添加10 μL CCK-8 試劑，通過(guò)酶標(biāo)儀測(cè)定細(xì)胞的光密度值。

1.8 Western blot 實(shí)驗(yàn)

細(xì)胞在冰上含有蛋白酶抑制劑的RIPA 溶液中裂解。BCA 試劑盒檢測(cè)蛋白質(zhì)的濃度。將分離的蛋白質(zhì)進(jìn)行SDS-PAGE 凝膠電泳，隨后轉(zhuǎn)移至PVDF 膜 上。將膜與一抗（MSH5：0.05 μg/mL；GAPDH：1∶2 000；GSK3β：1∶2 000；βcatenin：1∶4 000；AXIN2：1 μg/mL）進(jìn)行過(guò)夜孵育，再與辣根過(guò)氧化物酶偶聯(lián)的二抗孵育2 h。經(jīng)ECL 化學(xué)發(fā)光底物曝光后用蛋白成像系統(tǒng)采集圖像。Image J 軟件用于分析條帶灰度值。

1.9 EDU 實(shí)驗(yàn)

收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞培養(yǎng)在96 孔板中，用100 μL 含20 μmol/L EdU 的培養(yǎng)基處理。在37 ℃、5% CO2環(huán)境中孵育2 h，用4%多聚甲醛分別固定各組細(xì)胞30 min，再置于含0.5% Triton-X-100 的PBS 溶液中孵育20 min。Hoechst33342 溶液染細(xì)胞核。熒光顯微鏡觀察染色結(jié)果并拍照記錄。

1.10 Transwell 檢測(cè)遷移和侵襲

成功轉(zhuǎn)染的細(xì)胞經(jīng)胰蛋白酶消化后，收集細(xì)胞并計(jì)數(shù)。將4×104個(gè)細(xì)胞用100 μL 無(wú)血清培養(yǎng)基懸浮制得細(xì)胞懸液并接種至Transwell 小室上室，將含10% FBS 的完全培養(yǎng)基加至小室下室。Transwell 小室置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。隨后用4%多聚甲醛固定細(xì)胞0.1%結(jié)晶紫溶液染色。顯微鏡拍照并計(jì)數(shù)。侵襲實(shí)驗(yàn)接種細(xì)胞前在小室上室中加入稀釋后的Matrigel 基質(zhì)膠，膠凝固后再接種細(xì)胞，其余步驟與遷移實(shí)驗(yàn)相同。

1.11 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期

取生長(zhǎng)良好的各組細(xì)胞，經(jīng)0.25%胰蛋白酶消化后，重懸于PBS 中。然后在冰冷的70%乙醇中過(guò)夜固定。隨后，1 000 r/min 條件下將細(xì)胞離心5 min，并重懸在50 μL RNase A 中，于37 ℃下孵育30 min。將400 μL 碘化丙啶（PI）細(xì)胞懸液中混勻，孵育30 min，通過(guò)流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)。

1.12 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率

采用雙染法Annexin V-FITC/PI 凋亡檢測(cè)試劑盒檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。將轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞接種至6孔板中，加入完全培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h。收集細(xì)胞與Annexin V-FITC 試劑在常溫中避光孵育15 min，然后再與PI 溶液避光孵育15 min。通過(guò)流式細(xì)胞儀測(cè)定細(xì)胞凋亡率。

1.13 雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)

經(jīng)PCR 擴(kuò)增MSH5 的3′-UTR（MSH5-WT）并插入p-GL3 報(bào)告載體中，同時(shí)構(gòu)建與miR-149-5p 具有靶向結(jié)合位點(diǎn)的MSH5 3′-UTR 突變序列（MSH5-MUT），并轉(zhuǎn)入p-GL3 報(bào)告載體。將NC mimic 或miR-149-5p mimic 分 別與MSH5-WT 或MSH5-MUT 經(jīng)Lipofectamine 2000 共轉(zhuǎn)染至293T細(xì)胞中。轉(zhuǎn)染48 h 后，通過(guò)雙熒光素酶測(cè)定法分析熒光素酶活性。海腎熒光素酶活性作為內(nèi)部參照。

1.14 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

每組實(shí)驗(yàn)均進(jìn)行3 次重復(fù)。GraphPad Prism8.0用于數(shù)據(jù)分析并作圖。來(lái)自三個(gè)及以上獨(dú)立重復(fù)實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)均表示為“均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”。非配對(duì)t檢驗(yàn)用于分析2 組間的差異。單因素方差分析用于分析多組間的差異，Tukey 檢驗(yàn)用于多組間的兩兩比較。P＜ 0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 miR-149-5p 在膠質(zhì)瘤組織和細(xì)胞中的表達(dá)

收集膠質(zhì)瘤患者的腫瘤組織及其對(duì)應(yīng)的癌旁組織，通過(guò)RT-qPCR 檢測(cè)顯示，miR-149-5p 腫瘤組織中的表達(dá)顯著低于癌旁組織（圖1A，P＜0.000 1）。此外，miR-149-5p 在人膠質(zhì)瘤細(xì)胞系A(chǔ)172、U251、HS683、H4 中的表達(dá)明顯低于人正常星形膠質(zhì)細(xì)胞HA1800（圖1B，P＜ 0.000 1）。由此，推測(cè)miR-149-5p 在膠質(zhì)瘤組織和細(xì)胞系中的低表達(dá)與膠質(zhì)瘤的發(fā)展密切相關(guān)。

圖1 miR-149-5p 在膠質(zhì)瘤組織和細(xì)胞中的表達(dá)Fig.1 miR-149-5p was downregulated in glioma tissues and cells

2.2 miR-149-5p 對(duì)A172 細(xì)胞惡性生物學(xué)行為的影響

為進(jìn)一步探索miR-149-5p 對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的作用機(jī)制，分別在A172 細(xì)胞中轉(zhuǎn)染NC mimic、miR-149-5p mimic、NC inhibitor 和miR-149-5p inhibitor。檢測(cè)顯示，轉(zhuǎn)染miR-149-5pmimic 明顯增加miR-149-5p 的表達(dá)，轉(zhuǎn)染miR-149-5p inhibitor 組 中miR-149-5p 表達(dá)降 低。CCK-8、EDU、Transwell 以及流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)表明，過(guò)表達(dá)miR-149-5p 明顯抑制A172 細(xì)胞的增殖（圖2B、2C 和2F，P＜ 0.01）、遷移（圖2D 和2G，P＜ 0.05）和侵襲（圖2E 和2H，P＜ 0.01），促進(jìn)G1 期細(xì)胞比例（圖3A 和3B，P＜ 0.01）以及凋亡率（圖3C 和3D，P＜ 0.01）。與NC inhibitor 組相比，敲降miR-149-5p 組中細(xì)胞的增殖活力（P＜ 0.05）、遷移（P＜0.05）和侵襲（P＜ 0.05）能力顯著升高，G1 期細(xì)胞比例（P＜ 0.05）以及凋亡水平（P＜ 0.05）降低。綜上可知。過(guò)表達(dá)miR-149-5p 可顯著抑制A172 細(xì)胞的增殖、轉(zhuǎn)移和細(xì)胞周期，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。敲降miR-149-5p 可明顯促進(jìn)A172 細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為。

圖2 miR-149-5p 對(duì)A172 細(xì)胞惡性生物學(xué)行為的影響Fig.2 Effect of miR-149-5p on malignant biological behavior of A172 cells

圖3 miR-149-5p 對(duì)A172 細(xì)胞惡性生物學(xué)行為的影響Fig.3 Effect of miR-149-5p on malignant biological behavior of A172 cells

2.3 miR-149-5p 靶向MSH5

通過(guò)starbase 數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)，MSH5 與miR-149-5p 具有靶向結(jié)合序列，見圖4A。雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)驗(yàn)證證實(shí)，過(guò)表達(dá)miR-149-5p可明顯抑制MSH5 野生型載體的熒光素酶活性見圖4B，P＜ 0.05），而對(duì)MSH5 突變型載體的熒光素酶活性無(wú)顯著作用（P＞ 0.05。通過(guò)GEPIA 數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)顯示，MSH5 在膠質(zhì)瘤組織中表達(dá)降低（圖4C，P＜ 0.01）。RT-qPCR 發(fā)現(xiàn)，過(guò)表達(dá)miR-149-5p 可抑制MSH5 的蛋白表達(dá)（圖4D，P＜0.01），而敲降miR-149-5p 組A172 細(xì)胞中MSH5表達(dá)顯著增加（圖4E，P＜ 0.01）。由此證實(shí)，miR-149-5p 靶向負(fù)調(diào)控MSH5。

圖4 miR-149-5p 靶向MSH5Fig.4 miR-149-5p targeted MSH5

2.4 miR-149-5p 靶向MSH5 調(diào)控A172 細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為

為進(jìn)一步探索miR-149-5p 調(diào)控MSH5 對(duì)A172 細(xì)胞惡性生物學(xué)行為的影響，分別在A172細(xì)胞中轉(zhuǎn)染sh-NC、sh-MSH5 和sh-MSH5+miR-149-5pinhibitor。Western blot 結(jié)果見圖5A 和5B，轉(zhuǎn)染sh-MSH5 組A172 細(xì)胞中MSH5 的蛋白表達(dá)低于sh-NC 組（P＜ 0.001），轉(zhuǎn)染sh-MSH5+miR-149-5pinhibitor 組中MSH5 的蛋白表達(dá)高于sh-MSH5 轉(zhuǎn)染組（P＜ 0.05）。通 過(guò)CCK-8、EDU、Tranwell 和流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)表明，敲降MSH5 可顯著抑制A172 細(xì)胞的增殖活力（圖5C～5E，均P＜ 0.01）、遷移（圖5F 和5G，P＜ 0.01）和侵襲（圖5H 和5I，P＜ 0.05），促進(jìn)G1 期細(xì)胞比例（圖6A和6B，P＜ 0.01）以及細(xì)胞凋亡率（圖6C 和6D，P＜ 0.001）。同時(shí)敲降miR-149-5p 和MSH5 組中細(xì)胞的增殖（P＜ 0.05）、遷移（P＜ 0.05）和侵襲（P＜ 0.05）能力高于敲降MSH5 組，G1 期細(xì)胞比例（P＜ 0.05）和凋亡（P＜ 0.05）水平低于僅敲降MSH5 組。綜上所述，敲降miR-149-5p 靶向MSH5，可逆轉(zhuǎn)敲降MSH5 對(duì)A172 細(xì)胞惡性生物學(xué)行為的抑制作用。

圖5 miR-149-5p 靶向MSH5 調(diào)控A172 細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為Fig.5 miR-149-5p targeted MSH5 to regulate the malignant biological behavior of A172 cells

圖6 miR-149-5p 靶向MSH5 調(diào)控A172 細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為Fig.6 miR-149-5p targeted MSH5 to regulate the malignant biological behavior of A172 cells

2.5 MSH5 調(diào)控Wnt 信號(hào)通路對(duì)A172 細(xì)胞的作用

Wnt 信號(hào)通路被報(bào)道在膠質(zhì)瘤的發(fā)展進(jìn)程中發(fā)揮著重要作用，因此，筆者進(jìn)一步探討miR-149-5p/MSH5 分子軸是否通過(guò)Wnt 信號(hào)通路而調(diào)控膠質(zhì)瘤的進(jìn)程。分別用Wnt 通路抑制劑Triptonide 以及Wnt 通路激活劑HLY78 處理轉(zhuǎn)染pcDNA-MSH5 的A172 細(xì)胞。檢測(cè)結(jié)果見圖7A，與pcDNA-NC 作用相 比，pcDNA-MSH5 組 中MSH5（圖7B，P＜ 0.001）、GSK3β 表達(dá)降低（圖7C，P＜ 0.001），β-catenin（圖7D，P＜ 0.05）和AXIN2（圖7E，P＜ 0.01）表達(dá)升高。與pcDNA-MSH5 組相比，pcDNA-MSH5+Triptonide 組中GSK3β 表達(dá)升高（P＜ 0.001），β-catenin（P＜ 0.05）和AXIN2（P＜ 0.01）表達(dá)降低；而pcDNA-MSH5+HLY78 組 中GSK3β 表達(dá)降 低（P＜ 0.001），βcatenin（P＜ 0.05）和AXIN2（P＜ 0.05）表達(dá)升高。過(guò)表達(dá)MSH5 且經(jīng)Triptonide 處理可顯著下調(diào)過(guò)表達(dá)MSH5 對(duì)A172 細(xì)胞的增殖（圖7F～7H，均P＜0.01）、遷移（圖7I～7J，P＜ 0.01）和侵襲（圖7K～7L，P＜ 0.01）的促進(jìn)作用以及對(duì)A172 細(xì)胞的G1期細(xì)胞比例（圖8A～8B，P＜ 0.05）和凋亡水平（圖8C～8D，P＜ 0.05）的抑制作用。過(guò)表達(dá)MSH5 且經(jīng)HLY78 處理可顯著上調(diào)過(guò)表達(dá)MSH5對(duì)A172 細(xì)胞的增殖（均P＜ 0.05）、遷移（P＜ 0.05）和侵襲（P＜ 0.05）的促進(jìn)作用以及對(duì)A172 細(xì)胞的G1 期細(xì)胞比例（P＜ 0.05）和凋亡水平（P＜ 0.05）的抑制作用。綜上表明，過(guò)表達(dá)MSH5 通過(guò)激活Wnt 信號(hào)通路促進(jìn)A172 細(xì)胞的惡性表型。

圖7 MSH5 調(diào)控Wnt 信號(hào)通路對(duì)A172 細(xì)胞的作用Fig.7 Effect of MSH5 regulating Wnt signaling pathway on A172 cells

圖8 MSH5 調(diào)控Wnt 信號(hào)通路對(duì)A172 細(xì)胞的作用Fig.8 Effect of MSH5 regulating Wnt signaling pathway on A172 cells

3 討論

膠質(zhì)瘤占原發(fā)性腦腫瘤的80%，由于有空間占位效應(yīng)，使患者的顱內(nèi)壓升高，可能導(dǎo)致患者嘔吐、視力喪失或出現(xiàn)癲癇癥狀[6]。同時(shí)，膠質(zhì)瘤具有較強(qiáng)的侵襲性，手術(shù)很難將病灶完全切除[7]。因此，越來(lái)越多的研究者開始研究靶向治療，以期通過(guò)尋找有效的生物標(biāo)志物為膠質(zhì)瘤提供新的治療方案。

miRNA 在基因表達(dá)中具有重要的調(diào)控作用，據(jù)估計(jì)，約有三分之一的蛋白表達(dá)受miRNA 的調(diào)控[8-9]。miR-149-5p 被證實(shí)在多種腫瘤細(xì)胞中作為抑癌因子抑制腫瘤的進(jìn)程。Li Q 等[10]證明，在胃癌組織和細(xì)胞系中miR-149-5p 低表達(dá)，過(guò)表達(dá)miR-149-5p 顯著抑制胃癌細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。在乳腺癌細(xì)胞中，circ-0072995 通過(guò)靶向下調(diào)miR-149-5p 可促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的惡性表型和無(wú)氧糖酵解[11]。miR-149-5p 靶向下調(diào)RGS17，抑制前列腺癌細(xì)胞的活力、增殖和遷移[12]。在本研究中，筆者發(fā)現(xiàn)miR-149-5p 在膠質(zhì)瘤組織和細(xì)胞系中表達(dá)降低，過(guò)表達(dá)miR-149-5p 顯著抑制膠質(zhì)瘤A172 細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，促進(jìn)細(xì)胞G1 期的比例并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。而敲降miR-149-5p 可促進(jìn)A172 細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移，抑制G1 期細(xì)胞比例以及細(xì)胞凋亡率。此外，miR-149-5p 也被報(bào)道參與炎癥及代謝類疾病的調(diào)控[13-15]。例如：miR-149-5p 可抑制骨關(guān)節(jié)炎和類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎中促炎細(xì)胞因子IL-1β、IL-6 和TNF-α 的水平[15]。黃芪多糖通過(guò)上調(diào)miR-149-5p 的表達(dá)，改善高糖和棕櫚酸誘導(dǎo)的小鼠胰腺β 細(xì)胞的增殖和胰島素的分泌[13]。過(guò)表達(dá)miR-149-5p 顯著聚集尿酸誘導(dǎo)的干細(xì)胞中甘油三酯的積累[16]。

MutS 同源物5（MutS Homolog 5，MSH5）是MutS 蛋白家族的成員，與MSH4 形成異二聚體復(fù)合物，參與DNA 配錯(cuò)修復(fù)和減數(shù)分裂重組，在DNA 雙鏈斷裂的同源重組修復(fù)過(guò)程中發(fā)揮重要作用[17]。研究發(fā)現(xiàn)，MSH4 和MSH5 中的遺傳變異是男性不育的相關(guān)原因[18]。MSH5 突變可損害DNA 同源重組修復(fù)，可能導(dǎo)致非綜合性原發(fā)性卵巢功能不全[19]。敲低lncRNA HCP5 抑制YB1 與MSH 啟動(dòng)子在的結(jié)合，抑制MSH5 的轉(zhuǎn)錄激活，進(jìn)而抑制DNA 雙鏈斷裂的修復(fù)過(guò)程，促進(jìn)卵巢顆粒細(xì)胞的凋亡[20]。本研究中，筆者發(fā)現(xiàn)MSH5 是miR-149-5p 的靶基因，MSH5 在膠質(zhì)瘤組織和細(xì)胞中高表達(dá)，敲降miR-149-5p 靶向上調(diào)MSH5促進(jìn)A172 細(xì)胞惡性表型。

糖原合成酶激酶3-β（glycogen Synthase Kinase 3-β，GSK3β）是GSK3 的兩種異構(gòu)體之一，可通過(guò)介導(dǎo)Wnt/β-catenin 信號(hào)通路參與調(diào)節(jié)糖原合成、蛋白質(zhì)合成、細(xì)胞增殖、細(xì)胞分化以及免疫功能和炎癥等過(guò)程[21-23]。本研究中，筆者證明，過(guò)表達(dá)MSH5 通過(guò)抑制GSK3β，促進(jìn)βcatenin 和AXIN2 表達(dá)，從而促進(jìn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，抑制細(xì)胞凋亡。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)miR-149-5p 在膠質(zhì)瘤組織和細(xì)胞系中低表達(dá)，敲降miR-149-5p 通過(guò)靶向上調(diào)MSH5，抑制GSK3β，促進(jìn)βcatenin 和AXIN2 通路蛋白表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移，并抑制細(xì)胞凋亡。