庾 珊，肖 林，龔東平，梁樓峰，梁安偉，許夏懿，林 杰，梁華新

（廣西中醫(yī)藥大學(xué)附屬?lài)?guó)際壯醫(yī)醫(yī)院 疼痛科，南寧 廣西 530200）

我國(guó)不同地區(qū)報(bào)道的成人腰痛患病率為7.21%～39.0%，年患病率為 20.88%～29.88%，已經(jīng)成為我國(guó)一個(gè)非常嚴(yán)峻的公共衛(wèi)生問(wèn)題[1]，而腰椎間盤(pán)退變（lumbar disc degeneration，LDD）是導(dǎo)致下腰痛的重要因素[2]。椎間盤(pán)是人體最大的乏血管神經(jīng)的組織，當(dāng)椎間盤(pán)發(fā)生退變 時(shí)血管神經(jīng)向椎間盤(pán)內(nèi)延伸，極易誘發(fā)椎間盤(pán)退變，進(jìn)而出 現(xiàn)腰痛，但其具體的發(fā)病機(jī)制有待深入探討。髓核（nucleus pulposus，NP）細(xì)胞是椎間盤(pán)中主要的細(xì)胞，其異常增殖或過(guò)度凋亡是LDD 中最明顯的細(xì)胞和生化變化之一。而H2O2和miR-153-3p可能是調(diào)節(jié)這一過(guò)程的重要因素之一。本研究旨在闡明H2O2對(duì)于腰椎髓核細(xì)胞的影響及初步探討miR-153-3p 對(duì)于腰退行性病變的調(diào)節(jié)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來(lái)源

本實(shí)驗(yàn)研究標(biāo)本采用從Sciencell 公司購(gòu)買(mǎi)正常腰椎髓核細(xì)胞：Human Nucleus Pulposus Cells，Catalog #4800。

1.2 實(shí)驗(yàn)分組

實(shí)驗(yàn)分為：（1）對(duì)照組；（2）H2O2組；（3）miR-153-3p inhibitor NC（以下簡(jiǎn)稱(chēng)inhibitor-NC 組）；（4）miR-153-3p inhibitor（以下簡(jiǎn)稱(chēng)inhibitor 組）?？偫龜?shù)n=48，每組例數(shù)n=12。

1.3 標(biāo)本處理方法

對(duì)照組：采用髓核細(xì)胞培養(yǎng)基（DMEM 細(xì)胞培養(yǎng)液、品牌：GIBCO）體外培養(yǎng)；H2O2組：髓核細(xì)胞培養(yǎng)基體進(jìn)行體外培養(yǎng)，并予200 μmol/L H2O2處理6 h；inhibitor 組：加入miR-153-3p inhibitor，是一段序列跟miR-153-3p 序列互補(bǔ)的抑制序列miRNA；inhibitor-NC 組：miR-153-3p inhibitor NC 是一段無(wú)功能序列的miRNA，起對(duì)照作用。實(shí)驗(yàn)時(shí)，按照要求將加入對(duì)應(yīng)分組的RNA。

1.4 檢測(cè)方法

1.4.1 RT-qPCR 檢測(cè)miR-153-3P、COL-Ⅱ、MMP3、Nrf2 總RNA 提取后，反轉(zhuǎn)錄cDNA，根據(jù)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行9PCR。反應(yīng)條件95℃，30 s 預(yù)變性，95℃ 5 s，60℃ 35 s 共40 個(gè)循環(huán)。相對(duì)表達(dá)量用2-△△Ct法計(jì)算，引物序列見(jiàn)表1。

表1 RT-qPCR 引物序列Tab.1 Rt-qPCR primer sequence

1.4.2 WesternBlot 檢測(cè)Nrf2 表達(dá)加入裂解液提取總蛋白，蛋白濃度用BCA 法測(cè)定。隨后進(jìn)行電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉1.5 h，4 ℃加封閉液稀釋的一抗過(guò)夜后，TBST 洗膜，加封閉液稀釋的二抗37 ℃孵育90 min，加入顯影液顯影，利用蛋白條帶的吸光度計(jì)算蛋白表達(dá)量。

1.5 檢測(cè)指標(biāo)

實(shí)驗(yàn)分兩部分進(jìn)行：（1）采用CCK8 檢測(cè)對(duì)照組及H2O2組細(xì)胞活力，流式檢測(cè)兩組細(xì)胞活性氧及線粒體膜電位，另外采用qPCR 檢測(cè)上述兩組的基質(zhì)金屬蛋白酶3（MMP3）、Nrf2、miR-153-3p、Ⅱ型膠原（COL-Ⅱ）表達(dá)含量。（2）采用qPCR 檢測(cè)對(duì)照組、miR-153-3p inhibitor-NC 組及miR-153-3p inhibitor 組的Nrf2、miR-153-3p表達(dá)含量；采用Westernblot 檢測(cè)對(duì)照組、miR-153-3p inhibitor-NC 組及miR-153-3p inhibitor 組的Nrf2 表達(dá)含量。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 H2O2 對(duì)髓核細(xì)胞活性影響

用CCK8 檢測(cè)對(duì)照組、H2O2組的細(xì)胞活力進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果提示經(jīng)H2O2處理的腰椎髓核細(xì)胞活力較對(duì)照組明顯下降，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜ 0.05），見(jiàn)表2。

表2 C CK8 檢測(cè)對(duì)照組、H2O2 組細(xì)胞活力比較[（）%]Tab.2 Comparison of cell viability between CCK8 control group and H2O2 group [（）%]

表2 C CK8 檢測(cè)對(duì)照組、H2O2 組細(xì)胞活力比較[（）%]Tab.2 Comparison of cell viability between CCK8 control group and H2O2 group [（）%]

2.2 用流式細(xì)胞檢測(cè)對(duì)照組、H2O2 組的細(xì)胞活性氧、線粒體膜電位

結(jié)果提示經(jīng)200 μmol/L H2O2處理的腰椎髓核細(xì)胞活性氧含量明顯增加（P＜ 0.05，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義）；H2O2組細(xì)胞線粒體膜電位較對(duì)照組明顯降低（P＜ 0.05，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義），提示H2O2處理的腰椎髓核細(xì)胞線粒體膜電位降低，見(jiàn)表3，表4。

表3 流式檢測(cè)對(duì)照組、H2O2 組細(xì)胞活性氧（）Tab.3 Flow detection of reactive oxygen species in control group and H2O2 group（）

表3 流式檢測(cè)對(duì)照組、H2O2 組細(xì)胞活性氧（）Tab.3 Flow detection of reactive oxygen species in control group and H2O2 group（）

表4 流式檢測(cè)對(duì)照組、H2O2 組細(xì)胞線粒體膜電位（）Tab.4 Flow cytometry detection of mitochondrial membrane potential in control group and H2O2 group（）

表4 流式檢測(cè)對(duì)照組、H2O2 組細(xì)胞線粒體膜電位（）Tab.4 Flow cytometry detection of mitochondrial membrane potential in control group and H2O2 group（）

注：經(jīng)正態(tài)性檢驗(yàn)，兩樣本符合正態(tài)分布，采用兩獨(dú)立樣本的t檢驗(yàn)。*P ＜ 0.05。

2.3 采用qPCR 檢測(cè)對(duì)照組、H2O2 組的miR-153-3p、COL-Ⅱ、MMP3、Nrf2 表達(dá)含量

結(jié)果提示對(duì)照組、H2O2組Nrf2 表達(dá)量無(wú)明顯差異（P＞ 0.05），H2O2組的miR-153-3p、MMP3表達(dá)量較對(duì)照組明顯減少，而其COL-Ⅱ表達(dá)量較對(duì)照組明顯減少（P＜ 0.05，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義），見(jiàn)表5。

表5 qPCR 檢測(cè)對(duì)照組、H2O2 組相關(guān)miRNA 或mRNA 相對(duì)表達(dá)量（）Tab.5 Relative expression levels of miRNA or mRNA in control group and H2O2 group detected by qPCR（）

表5 qPCR 檢測(cè)對(duì)照組、H2O2 組相關(guān)miRNA 或mRNA 相對(duì)表達(dá)量（）Tab.5 Relative expression levels of miRNA or mRNA in control group and H2O2 group detected by qPCR（）

與對(duì)照組相比，*P ＜ 0.05。

2.4 采用qPCR 檢測(cè)對(duì)照組、miR-153-3p inhibitor-NC 組 及miR-153-3p inhibitor 組的Nrf2、miR-153-3p 相對(duì)表達(dá)量

結(jié)果提示：與對(duì)照組、inhibitor-NC 組相比，inhibitor 組 的miR-153-3p 表達(dá)量降低、Nrf2 表達(dá)量增高（P＜ 0.05，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義）；而inhibitor-NC 組與對(duì)照組的Nrf2、miR-153-3p 表達(dá)量無(wú)明顯差異（P＞ 0.05），見(jiàn)表6，圖1。

圖1 qPCR 檢測(cè)3 組miR-153-3p 相對(duì)表達(dá)量圖Fig.1 Relative expression of miR-153-3p in the three groups detected by qPCR

表6 qPCR 檢測(cè)3 組的Nrf2、miR-153-3p 相對(duì)表達(dá)量（）Tab.6 Relative expression levels of Nrf2 and miR-153-3p in the three groups detected by QPCR（）

表6 qPCR 檢測(cè)3 組的Nrf2、miR-153-3p 相對(duì)表達(dá)量（）Tab.6 Relative expression levels of Nrf2 and miR-153-3p in the three groups detected by QPCR（）

*P ＜ 0.05。

2.5 采用Westernblot 檢測(cè)對(duì)照組、inhibitor-NC 組及nhibitor 組的Nrf2 表達(dá)含量

結(jié)果提示，與對(duì)照組、inhibitor-NC 組相比，inhibitor 組胞質(zhì)及胞核中Nrf2 表達(dá)量增高（P＜0.05，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義），而inhibitor-NC 組胞質(zhì)及胞核中Nrf2 表達(dá)量與對(duì)照組無(wú)明顯差異（P＞ 0.05），見(jiàn)表7。

表7 Westernblot 檢測(cè)3 組的Nrf2 相對(duì)表達(dá)量（）Tab.7 Relative expression of Nrf2 in the three groups detected by Westernblot（）

表7 Westernblot 檢測(cè)3 組的Nrf2 相對(duì)表達(dá)量（）Tab.7 Relative expression of Nrf2 in the three groups detected by Westernblot（）

與對(duì)照組，inhibitor-NC組相比，*P ＜ 0.05。

inhibitor-NC 組胞質(zhì)及胞核中的Nrf2 表達(dá)量與對(duì)照組比較，P＞ 0.05，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見(jiàn)圖2。

圖2 Westernblot 檢測(cè)3 組的Nrf2 相對(duì)表達(dá)量Fig.2 Relative expression levels of Nrf2 detected by Western blot in the three groups.

3 討論

3.1 NPCs 退變和ECM 代謝失衡是LDD 的主要病理特征

椎間盤(pán)主要由外周的纖維環(huán)、中央的髓核和上下終板組成。髓核和纖維環(huán)的細(xì)胞數(shù)量較少，但細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）豐富，約占整體的99%，后者主要由膠原（Ⅰ、Ⅱ型）和蛋白聚糖組成。髓核細(xì)胞（NPCs）可產(chǎn)生蛋白聚糖、Ⅱ型膠原和其他ECM 因子，有利于維持椎間盤(pán)完整性。LDD 是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程，典型特征是ECM 成分的丟失。LDD 的早期退變出現(xiàn)在NPCs 中，表現(xiàn)為水和蛋白聚糖的丟失，NPCs 功能退化，合成分泌Ⅱ型膠原及蛋白聚糖的能力減弱，ECM 合成與分解代謝失衡，使椎間盤(pán)結(jié)構(gòu)與成分發(fā)生變化，導(dǎo)致椎間盤(pán)功能減弱或喪失[3]，引起神經(jīng)痛甚至功能障礙。

在正常椎間盤(pán)中，ECM 合成和降解處于動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)，其代謝依賴(lài)于基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）、蛋白聚糖酶與基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制劑（TIMPs）之間的平衡調(diào)節(jié)[4]。MMPs 是一類(lèi)蛋白水解酶，可降解除多糖外的幾乎所有ECM 成分。蛋白聚糖酶是解聚素樣金屬蛋白酶家族的重要成員（ADAMTSs），主要降解蛋白聚糖。MMPs 和ADAMTSs 的活性可被內(nèi)源性特異性的TIMPs 所抑制。研究發(fā)現(xiàn)，在不同退變程度的人髓核組織樣本中，MMPs 和ADAMTSs 表達(dá)明顯升高，TIMPs 表達(dá)與椎間盤(pán)退變程度呈負(fù)相關(guān)[5]，因而會(huì)導(dǎo)致ECM 成分降解增強(qiáng)，引起椎間盤(pán)結(jié)構(gòu)和成分的改變，最終導(dǎo)致LDD。故MMPs、ADAMTSs與TIMPs 之間的失衡在LDD 的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮重要作用。

3.2 氧化應(yīng)激通過(guò)激活多種通路影響NPCs 功能以及ECM 代謝，進(jìn)而介導(dǎo)LDD

LDD 病因復(fù)雜，越來(lái)越多的證據(jù)表明年齡、性別、環(huán)境、行為影響、氧化應(yīng)激、炎癥和遺傳與LDD 風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)[6]。其中，氧化應(yīng)激能夠通過(guò)加速椎間盤(pán)細(xì)胞的衰老、凋亡，調(diào)節(jié)細(xì)胞自噬以及ECM 的合成與降解等多種途徑介導(dǎo)椎間盤(pán)的退變，被認(rèn)為是引起LDD 的主要因素之一?；钚匝醮兀≧OS）是細(xì)胞氧化代謝過(guò)程中的必然產(chǎn)物，廣泛參與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，代謝調(diào)節(jié)、程序性細(xì)胞死亡，衰老和椎間盤(pán)的表型轉(zhuǎn)換等[7]。當(dāng)各種原因造成機(jī)體內(nèi)ROS 產(chǎn)生增多或機(jī)體對(duì)抗ROS 能力下降時(shí)，機(jī)體處于氧化應(yīng)激狀態(tài)，此時(shí)ROS 可通過(guò)細(xì)胞膜直接造成DNA、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)的氧化損傷，從而引起NPCs 功能損傷。在本實(shí)驗(yàn)中，H2O2組中腰椎髓核細(xì)胞活性氧含量增加、MMP3 表達(dá)增加、Col Ⅱ含量下降，可以說(shuō)明氧化應(yīng)激可以影響NPCs 功能以及ECM 代謝，進(jìn)而介導(dǎo)LDD。而這一進(jìn)程可能與ROS 可激活p38MAPK、Wnt/βcatenin 等多種可引起炎癥反應(yīng)的信號(hào)通路有關(guān)[8-9]。

3.3 線粒體自噬清除受損線粒體，減少ROS 積聚，miR153/Nrf2/PINK1 通路在其中發(fā)揮重要作用

在本實(shí)驗(yàn)中，H2O2處理的腰椎髓核細(xì)胞線粒體膜電位下降，說(shuō)明H2O2誘導(dǎo)的NPCs 衰老和凋亡與線粒體功能障礙有關(guān)。線粒體是產(chǎn)生ROS 的能量工廠，線粒體自噬是神經(jīng)退行性疾病中重要的細(xì)胞抗氧化途徑，通過(guò)自噬途徑對(duì)受損線粒體的選擇性降解，在氧化應(yīng)激過(guò)程中改善線粒體功能障礙，維持線粒體質(zhì)量控制。大量研究表明，線粒體自噬可以保護(hù)NPCs 免受線粒體途徑誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激、衰老、細(xì)胞凋亡[10-12]。

Nrf2 作為一種可以調(diào)節(jié)含有細(xì)胞保護(hù)基因的抗氧化反應(yīng)元件（ARE）的表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子，可進(jìn)入細(xì)胞核并與包含靶基因的ARE 序列結(jié)合，可激活靶基因的轉(zhuǎn)錄，參與氧化應(yīng)激和ROS 代謝過(guò)程。最近研究證實(shí)，在神經(jīng)元中，Nrf2 通過(guò)激活PINK1 啟動(dòng)子的ARE 序列，進(jìn)而上調(diào)PINK1，PINK1 通過(guò)清除受損的線粒體和減少ROS 等多種機(jī)制參與線粒體穩(wěn)態(tài)的維持，使細(xì)胞在細(xì)胞存活方面具有優(yōu)勢(shì)[13-14]。此外，通過(guò)Nrf2/PINK1 途徑可調(diào)節(jié)和減弱管狀細(xì)胞的氧化應(yīng)激損傷和凋亡以維持線粒體質(zhì)量，由此激活PINK1/Parkin 誘導(dǎo)的線粒體自噬，影響下游Drp1 和Mfn2 表達(dá)量，最終可改善ROS 的生成。

microRNA（miRNAs）是一類(lèi)非編碼小RNA，參與細(xì)胞增殖、ECM 代謝、自噬、炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激、凋亡、線粒體功能調(diào)節(jié)等多種細(xì)胞活動(dòng)，介導(dǎo)多種生理和病理反應(yīng)。其中，miR-153 被認(rèn)為是一種神經(jīng)富集miRNAs，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育和功能以及神經(jīng)退行性疾病的發(fā)病機(jī)制中均發(fā)揮重要作用。研究發(fā)現(xiàn)，miR-153 靶向Nrf2 3’UTR，上調(diào)miR-153 表達(dá)可影響Nrf2 及其活化功能，進(jìn)而削弱了神經(jīng)元的抗氧化防御，使神經(jīng)元死亡增多[15]，還可升高ROS 水平，通過(guò)ROS 激活p38MAPK 通路[16]。大量證據(jù)已表明，miRNAs在退行性和正常NPCs 之間存在差異表達(dá)，可通過(guò)調(diào)節(jié)MMPs 的表達(dá)，進(jìn)而影響ECM 代謝，參與LDD 進(jìn)程[17]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果已顯示miR-153-3p可調(diào)控Nrf2 表達(dá)，而調(diào)節(jié)miR-153-3p 對(duì)于LDD進(jìn)程的影響及相關(guān)機(jī)制，需要進(jìn)一步地深入研究。

H2O2可引起腰椎髓核細(xì)胞活性氧含量增加、細(xì)胞活力下降、線粒體膜電位下降、MMP3 增加、Col Ⅱ含量下降、miR-153-3p 表達(dá)增加，說(shuō)明了H2O2可引起腰椎髓核細(xì)胞線粒體功能障礙，導(dǎo)致ROS 增加，引起腰椎髓核細(xì)胞外基質(zhì)成分改變，從而加速腰椎間盤(pán)細(xì)胞的衰老、凋亡，促進(jìn)LDD進(jìn)程。Nrf2 是PINK1 基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，PINK1通過(guò)清除受損的線粒體和減少ROS 等多種機(jī)制參與維持線粒體穩(wěn)態(tài)，抑制miR-153-3p 表達(dá)，可上調(diào)腰椎髓核細(xì)胞Nrf2 表達(dá)水平，提示miR-153-3p 參與存進(jìn)LDD 進(jìn)程的過(guò)程可能與其調(diào)控Nrf2表達(dá)、調(diào)節(jié)線粒體自噬過(guò)程有關(guān)，但是相關(guān)機(jī)制有待進(jìn)一步深入研究。