王 東 ，高必波 ，孫會英 ，冷登輝 ，冉小平 ，林 文

（1）資陽市人民醫(yī)院神經(jīng)疾病科，四川 資陽 641300;2）昆明醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院神經(jīng)外科，云南 昆明 650032）

膠質(zhì)母細胞瘤（Glioblastoma）是成年人中樞神經(jīng)系統(tǒng)中惡性程度最高且最常見的腫瘤[1]，目前的標準治療方法為最大程度切除腫瘤后口服替莫唑胺聯(lián)合全腦放射[2]。但是因其增殖快，侵襲性強，血管生成迅速豐富的特點，腫瘤的復發(fā)率接近100%，5 a 總生存率為5%[3]。因此，深入研究膠質(zhì)瘤的發(fā)病機制以及潛在治療靶向迫在眉睫。鐵死亡（Ferroptosis）是一種非典型性程序性細胞死亡的方式，由脂質(zhì)過氧化損傷引起[3-4]。由于癌細胞獨特的代謝特征，鐵死亡對腫瘤細胞的惡性生物學特征以及腫瘤的發(fā)展的影響逐漸引起人們的重視[5-6]。微小核糖核酸（microRNAs，miRNA）是大小約為 22 個核苷酸的轉(zhuǎn)錄本，在細胞核和細胞質(zhì)中通過多步過程產(chǎn)生，且被證實參與多種癌癥的發(fā)生發(fā)展過程[7]。本文主要探討miR-216b-5p 通過靶向NCOA3 對膠質(zhì)瘤細胞鐵死亡的影響，以期為膠質(zhì)母細胞瘤的臨床治療提供新的靶點。

1 材料與方法

1.1 細胞培養(yǎng)

人腦正常膠質(zhì)細胞HEB，人腦膠質(zhì)母細胞瘤細胞株LN299 和U251 均購自ATCC（American type culture collection）公司。細胞均培養(yǎng)在加入10% 胎牛血清和100 U/mL 青霉素-鏈霉素的DMEM 培養(yǎng)基（購于武漢普諾賽）中，在37℃，5% CO2 的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。U251 使用DMSO 溶液充分溶解的Erastin 溶液（50 mg Erastin 粉末中加入 1.83 mL DMSO 溶液充分溶解成 50 mM 儲存液，工作濃度為5.47 μg/g）或等體積DMSO 溶液刺激，miR-216b-5p mimics，miR-216b-5p inhibitor，pcDNA-NCOA3 以及對應的陰性對照質(zhì)粒均設計并構(gòu)建自上海吉滿生物科技，通過Lipofectamine TM 2000 agent（Invitrogen，美國）進行。U251 細胞分為DMSO 處理組（等量DMSO 刺激24 h），Erastin 處理組（Erastin 刺 激24 h），Erastin +mimic NC 組（轉(zhuǎn)染mimic NC 后Erastin 刺激24 h），Erastin+miR-216b-5p mimic 組（轉(zhuǎn)染miR-216b-5p mimic 后Erastin 刺激24 h），Erastin+pcDNA 3.1 組（轉(zhuǎn)染pcDNA 3.1 后Erastin 刺激24 h），Erastin+pcDNA-NCOA3 組（轉(zhuǎn)染pcDNA-NCOA3后 Erastin 刺激 24 h），pcDNA+miR-216b-5p mimic+pcDNA-NCOA3 組（共同轉(zhuǎn)染miR-216b-5p mimic 和pcDNA-NCOA3 后Erastin 刺激24 h）。

1.2 RNA 以及蛋白表達檢測

各組細胞接種到6 孔板后，加入TRIZOL 裂解液提取總RNA 后通過分光光度計檢測RNA 的濃度和純度。使用Reverse Transcription Kits（TaKaRa，TRR820A）或Bulge-Loop miRNA qRTPCR Starter Kit（銳博，C10211-1）進行逆轉(zhuǎn)錄，SYBR? premix Ex TaqTM 實時定量PCR 試劑盒（大連寶生物公司）進行PCR 擴增并進行qPCR 分析。mRNA 水平檢測采用GAPDH 作為內(nèi)參基因，miRNAs 水平檢測采用U6 作為內(nèi)參基因。采用2-ΔΔCT方法分析mRNA 的相對表達水平，重復3次實驗。熒光定量PCR 擴增引物序列見表1。所有引物均由廣州銳博生物有限公司設計并合成。

表1 熒光定量PCR 擴增引物列表Tab.1 Nucleotide sequences of the primers used for real-time quantitative PCR

使用RIPA 法對細胞進行裂解，即將RIPA 裂解液（含0.01% PMSF、150 nmol/L Tris（pH=8）、0.1% SDS、0.2% EDTA、1% Triton X-100、1%脫氧膽酸鈉）置于冰上30 min 充分裂解細胞，通過BCA 蛋白質(zhì)測定法（購于江蘇凱基生物技術(shù)公司）對蛋白量進行測定，將等量蛋白（30～50 μg）和2×SDS 上樣混合液混合并煮沸5 min，10% SDSPAGE 分離蛋白并轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯（PVDF）膜（Millipore，美國）。將膜在室溫下用5% 脫脂奶粉封閉后，與按比例稀釋后的一抗（表2）4℃下孵育過夜，清洗后與二抗室溫下孵育2 h，通過增強化學發(fā)光法（Millipore，美國）使條帶顯色，GAPDH被用于內(nèi)參基因。

表2 Western blot 中所用一抗Tab.2 Primary antibodies used in western blot

1.3 細胞增殖凋亡檢測

將細胞以3 000 個細胞每孔的密度接種于96孔板，每組6 個復孔，每孔加入100 μL 含有CCK-8 工作液（Abcam，批號 ab228554，工作液：培養(yǎng)基=1∶10）的DMEM 培養(yǎng)基，37℃避光孵育，酶標儀檢測450 nm 處吸光度值。凋亡檢測試劑盒購于東仁化學，用預冷的70%酒精固定細胞，并用PBS 清洗。然后將細胞與5 mL Annexin VFITC 和10 μL PI 孵育15 min，使用激發(fā)波長為488 納米的流式細胞儀觀察和分析凋亡細胞的比例。

1.4 生化指標檢測

取各組細胞，使用丙二醛（MDA）測定試劑盒（TBA 法）（南京建成 A003-1-2），鐵檢測試劑盒（abcam，ab83366），谷氨酸（Glu）含量測試盒（酶聯(lián)生物，ml076520），谷氨酰胺檢測試劑盒（abcam，ab197011），α-酮戊二酸檢測試劑盒（abcam，ab83431）按說明書制備樣本，通過酶標儀分析MDA 水平，亞鐵（Fe2+）水平，谷氨酰胺水平，谷氨酸水平，α-酮戊二酸水平。

1.5 靶向預測及驗證

通過miRDB（https://mirdb.org/）預測miR-216b-5p 的下游靶向基因，通過FeffDb 數(shù)據(jù)庫（http://www.zhounan.org/ferrdb/current/）獲取鐵死亡相關(guān)基因，通過GeneCards（https://www.genecards.org/）獲取膠質(zhì)母細胞瘤相關(guān)基因，并使用Venn 圖（http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/）獲取共有基因，用clusterProfiler 包進行GO 富集。通過miRDB 預測miR-216b-5p 與NCOA3 的結(jié)合靶點，將含有miR-216b-5p 的野生或突變型NCOA 3 質(zhì)粒構(gòu)建到pRL-CMV 載體中，通過lipofectamine 2000 將WT-NCOA 3，Mut-NCOA 3，miR-216b-5p mimics，mimic NC 轉(zhuǎn)染入U251 細胞，并按照Dual-Luciferase Reprter Assay System 試劑盒說明書（Promega，美國）測量Renilla 和Firefly的熒光素酶活性并計算相對熒光強度。

1.6 統(tǒng)計學處理

通過Graph-Pad Prism 8.0 軟件（GraphPad Software，San Diego，CA）進行 Kolmogorov-Smirnov 檢驗數(shù)據(jù)的正態(tài)性。正態(tài)分布的連續(xù)性變量均以平均數(shù)±標準差（）表示，并通過Graph-Pad Prism 8.3 軟件進行統(tǒng)計分析。組間比較采用單因素方差分析，如有差異進一步用Tukey’s 檢測兩兩比較，P＜ 0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 miR-216-5p 的上調(diào)緩解膠質(zhì)母細胞瘤細胞在Erastin 介導的凋亡

首先驗證miR-216a-5p 在膠質(zhì)母細胞瘤中的表達。與人腦膠質(zhì)細胞HEB 相比，miR-216b-5p在人膠質(zhì)母細胞瘤細胞株LN229 和U251 中均高表達（圖1A）。為了驗證miR-216b-5p 對膠質(zhì)母細胞瘤細胞株中鐵死亡的影響，通過鐵死亡誘導劑Erastin 調(diào)控U251 中鐵死亡的發(fā)生，并轉(zhuǎn)染miR-216b-5p mimics 調(diào) 控miR-216b-5p 在U251中的表達。qPCR 的結(jié)果顯示，與加入等劑量的DMSO 的 U251 細胞相比，miR-216b-5p 在Erastin 的刺激下下調(diào)，而轉(zhuǎn)染miR-216b-5p mimics 會使U251 細胞中的miR-216b-5p 上調(diào)，說明質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染成功（圖1B）。通過CCK-8 和流式細胞術(shù)分別檢測細胞的增殖和凋亡，發(fā)現(xiàn)相較于DMSO 處理的細胞相比，Erastin 刺激下的U251 的細胞活力下降，且凋亡比率上升，而轉(zhuǎn)染miR-216b-5p mimics 后，細胞活力回升且細胞凋亡率下降（圖1C～1D）。說明miR-216b-5p 參與Erastin 介導的細胞凋亡。

圖1 miR-216b-5p 參與Erastin 介導的細胞凋亡Fig.1 miR-216b-5p was involved in Erastin-mediated apoptosis

2.2 miR-216-5p 的上調(diào)緩解膠質(zhì)母細胞瘤細胞在Erastin 介導的脂質(zhì)過氧化和鐵離子累積

為了進一步研究miR-216-5p 對U251 中鐵死亡的影響，分別檢測了U251 中MDA，亞鐵（Fe2+），谷氨酰胺，谷氨酸，α-酮戊二酸的含量。結(jié)果顯示，在Erastin 的刺激下，U251 中的MDA，亞鐵（Fe2+），谷氨酰胺，谷氨酸，α-酮戊二酸均有明顯的上調(diào)，而轉(zhuǎn)染miR-216b-5p mimics 后，U251 中的MDA，亞鐵（Fe2+），谷氨酰胺，谷氨酸，α-酮戊二酸均有明顯下降（圖2A～E）。同時，western blot 的結(jié)果顯示，鐵死亡相關(guān)蛋白PTGS2，NOX1，ACSL4 的蛋白表達量在Erastin 的刺激下明顯上升，而GPX4，F(xiàn)TH1 的蛋白量明顯下降；miR-216b-5p 的轉(zhuǎn)染可逆轉(zhuǎn)以上結(jié)果（圖2F～2K）。以上結(jié)果說明miR-216-5p 可通過調(diào)節(jié)脂質(zhì)過氧化和鐵離子累積抑制細胞的鐵死亡。

圖2 miR-216-5p 的上調(diào)緩解膠質(zhì)母細胞瘤細胞在Erastin 介導的脂質(zhì)過氧化和鐵離子累積Fig.2 Upregulation of miR-216-5p alleviates Erastin-mediated lipid peroxidation and iron accumulation in glioblastoma cells

2.3 miR-216b-5p 直接靶向并負向調(diào)控NCOA3

為了進一步研究miR-216b-5p 對U251 中鐵死亡的調(diào)節(jié)機制，通過miRDB 預測miR-216b-5p 的靶向基因共489 個，通過Gencards 獲取膠質(zhì)母細胞瘤相關(guān)基因8 289 個，通過FeffDb 數(shù)據(jù)庫（http://www.zhounan.org/ferrdb/current/）獲取鐵死亡相關(guān)基因 934 個。通過Venn 圖取交集，獲得9個在膠質(zhì)母細胞瘤中與鐵死亡相關(guān)，且與miR-261b-5p 有直接靶向關(guān)系的基因，即FOXO4，NCOA3，PARP8，PARP11，LIG3，MAPK9，TLR4，RB1，PTEN（圖3A）。對以上9 個基因進行GO/KEGG 富集分析，以上基因主要富集在調(diào)節(jié)DNA 結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子的活性，有絲分裂細胞周期相變的負向調(diào)節(jié)，有絲分裂細胞周期的負向調(diào)節(jié)，細胞周期相變的負向調(diào)控，細胞周期過程的負向調(diào)節(jié)等功能上（圖3B）。根據(jù)miRDB 的Target score 大小排序，選擇NCOA3 進行后續(xù)研究。通過雙熒光素酶對miR-216b-5p 和NCOA3的靶向關(guān)系進行驗證，結(jié)果顯示，當細胞共同轉(zhuǎn)染了MUT-NCOA3 質(zhì)粒和miR-NC 或miR-216b-5p mimics 后，相對熒光素酶活性沒有明顯區(qū)別，而與NC 模擬物相比，miR-216b-5p mimics 與WT-NCOA3 共同轉(zhuǎn)染后相對熒光素酶活性下降（P＜ 0.000 1，圖3C～D）。因此證明了NCOA3 與miR-216b-5p 之間的靶標關(guān)系。qPCR 以 及Western blot 實驗結(jié)果顯示，當miR-216b-5p 過表達，NCOA3 的mRNA 以及蛋白表達下降，而當miR-216b-5p 被敲降，NCOA3 的mRNA 以及蛋白表達上升（圖3E～G）。因此證明miR-216b-5p 可負向調(diào)節(jié)NCOA3 的表達。

圖3 miR-216b-5p 直接靶向并負向調(diào)控NCOA3Fig.3 miR-216b-5p directly targets and negatively regulates NCOA3

2.4 miR-216b-5p 通過NCOA3 調(diào)控膠質(zhì)母細胞瘤細胞的鐵死亡

為了明確NCOA3 在膠質(zhì)母細胞瘤細胞中對鐵死亡的調(diào)控作用，將U251 分別轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-NCOA3 和miR-216b-5p mimic，并使用DMSO或Erastin 進行處理。結(jié)果顯示，U251 細胞在Erastin 處理后，細胞活力明顯下降，MDA，亞鐵（Fe2+），谷氨酰胺，谷氨酸，a-酮戊二酸均有明顯的上調(diào)，鐵死亡相關(guān)蛋白PTGS2，NOX1，ACSL4 的蛋白表達量明顯上升，而GPX4，F(xiàn)TH1 的蛋白量明顯下降；而轉(zhuǎn)染NCOA3 使細胞活力進一步下降，MDA，亞鐵（Fe2+），谷氨酰胺，谷氨酸，a-酮戊二酸再次上升，鐵死亡相關(guān)蛋白PTGS2，NOX1，ACSL4 的蛋白表達量再次上升，而GPX4，F(xiàn)TH1 的蛋白量明顯下降；但miR-216b-5p mimic 的轉(zhuǎn)染可逆轉(zhuǎn)以上結(jié)果（圖4）。以上結(jié)果說明，miR-216b-5p 通過NCOA3 調(diào)控膠質(zhì)母細胞瘤細胞的鐵死亡。

圖4 miR-216b-5p 通過NCOA3 調(diào)控膠質(zhì)母細胞瘤細胞的鐵死亡Fig.4 miR-216b-5p regulates iron death in glioblastoma cells via NCOA3

3 結(jié)論

膠質(zhì)母細胞瘤屬于成人彌漫性膠質(zhì)瘤，IDH1/2 野生型，WHO4 級；在原發(fā)性惡性腦腫瘤中占約45.6%，且在膠質(zhì)瘤中惡性程度最高，五年生存率不足5%，平均生存時間僅14 個月[5，8-9]。目前針對膠質(zhì)母細胞瘤主要通過最大限度切除病灶，輔以放療和烷基化劑化療為主[10-11]，但由于膠質(zhì)母細胞瘤的高侵襲性以及對化療藥物的耐藥性使膠質(zhì)母細胞瘤治療效果差，且極易復發(fā)[12]。因此，對膠質(zhì)母細胞瘤發(fā)病機制研究以及對治療靶點的探索，以期發(fā)現(xiàn)新的治療方式對膠質(zhì)母細胞瘤的臨床診斷具有重要意義。

鐵死亡是一種鐵依賴性的細胞程序性死亡形式，主要表現(xiàn)為細胞內(nèi)線粒體收縮，雙層膜的密度增加，線粒體嵴減少或減少，線粒體外膜破裂等[13-14]。鐵死亡的誘導途徑主要分為脂質(zhì)代謝途徑以及鐵代謝途徑。在脂質(zhì)代謝途徑中，主要通過胱氨酸谷氨酸反轉(zhuǎn)運系統(tǒng)Xc-（cystine/glutamate antiporter，system Xc-）降低細胞中谷胱甘肽和半胱氨酸的水平，或通過降低谷胱甘肽過氧化物酶4（glutathione peroxidase 4，GPX4）的表達水平來誘導鐵死亡的產(chǎn)生；在鐵代謝途徑中，通過誘導細胞中亞鐵離子水平的增加來誘導鐵死亡的產(chǎn)生。鐵死亡在膠質(zhì)母細胞瘤中發(fā)揮的作用逐漸受到重視[15-16]。Li 等[8]發(fā)現(xiàn)NF-κB 通路在GPX4 抑制劑RAS 選擇性致死性小分子3（RAS-selective lethal 3，RSL3）對應膠質(zhì)母細胞瘤細胞的鐵死亡的激活中發(fā)揮重要的作用。Yee 等[17]發(fā)現(xiàn)在膠質(zhì)母細胞瘤早期中性粒細胞誘導的鐵死亡促進腫瘤的發(fā)展。Erastin 是一種小分子化合物，其激活細胞鐵死亡主要通過抑制抑制Xc-系統(tǒng)上SLC7A11的表達，減少胱氨酸的攝取，導致GPX4 合成減少和脂質(zhì)過氧化水平的升高[18]。Chen 等發(fā)現(xiàn)[19]Erastin 抑制了半胱氨酸轉(zhuǎn)運體的吸收，并降低膠質(zhì)母細胞瘤對特莫唑胺的耐藥性。類似地，本實驗發(fā)現(xiàn)Erastin 的刺激使細胞活力下降，細胞凋亡率上升，同時U251 中的MDA，亞鐵（Fe2+），谷氨酰胺，谷氨酸，a-酮戊二酸均有明顯的上調(diào)，鐵死亡相關(guān)蛋白PTGS2，NOX1，ACSL4 的蛋白表達量明顯上升，而GPX4，F(xiàn)TH1的蛋白量明顯下降，預示著Erastin 可以通過誘導膠質(zhì)瘤母細胞瘤細胞中的鐵死亡的產(chǎn)生抑制腫瘤細胞的生長。

miR-216b-5p 被發(fā)現(xiàn)在多種腫瘤中起到腫瘤抑制基因的作用。作為一種微小RNA，miR-216b-5p 參與調(diào)控乳腺癌[20]，結(jié)腸癌[21-22]，前列腺癌[23]，漿液性上皮性卵巢癌[24]等腫瘤細胞的增殖，侵襲，化療耐藥性等惡性生物學特征。本研究同樣發(fā)現(xiàn)，miR-216b-5p 在膠質(zhì)母細胞瘤中高表達，Erastin 的刺激使U251 細胞中的miR-216b-5p 表達下降，而miR-216b-5p 參與U251 細胞鐵死亡引起的細胞凋亡，脂質(zhì)過氧化和鐵離子累積。核受體輔助因子（nuclear receptor coactivator，NCOA3）是類固醇受體輔助因子（steroid receptor coactivator，SRC）家族的成員，通過與轉(zhuǎn)錄因子的相互作用調(diào)節(jié)基因的表達。NCOA3 在多種腫瘤中被報道具有促進腫瘤發(fā)生與發(fā)展的作用[25-27]。有研究發(fā)現(xiàn)，NCOA3 通過與NR5A2 的協(xié)作抑制BET 抑制劑在乳腺癌中對鐵死亡的誘導，從而減壓腫瘤細胞的藥物抵抗性[28]。本實驗發(fā)現(xiàn)，miR-216b-5p 直接靶向并負向調(diào)控NCOA3 的表達，且通過NCOA3 調(diào)控膠質(zhì)母細胞瘤細胞的鐵死亡。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)miR-216b-5p 直接靶向NCOA3，且通過NCOA3 調(diào)控膠質(zhì)母細胞瘤細胞的鐵死亡，以此促進腫瘤的凋亡。本研究對膠質(zhì)母細胞瘤的新的治療靶點以及后續(xù)研究提出了新的可能性，以期為膠質(zhì)母細胞瘤的治療提供新思路。