屈耀寧，李曉梅

1.西安兵器工業(yè)五二一醫(yī)院消化內(nèi)科，陜西 西安 710065；

2.西安航天總醫(yī)院消化內(nèi)科，陜西 西安 710100

據(jù)報(bào)道，肝癌的發(fā)病率逐年上升，其5年總體生存率(overall survival，OS)僅為18%[1]。肝癌患者中以肝細(xì)胞癌(liver hepatocellular carcinoma，LIHC)最為常見，發(fā)病早期難以察覺，多數(shù)患者確診時(shí)已處于中晚期，手術(shù)切除治療難以徹底根治，術(shù)后復(fù)發(fā)率高，預(yù)后較差[2]。因此，尋找新型有效的分子靶標(biāo)，對(duì)改善LIHC 的預(yù)后具有重要意義[3]。早診斷、早發(fā)現(xiàn)、早治療是治療LIHC的關(guān)鍵，目前LIHC的治療仍處于臨床探索階段。細(xì)胞分裂周期蛋白6(cell division cycleprotein 6，CDC6)是真核細(xì)胞DNA復(fù)制起始的關(guān)鍵調(diào)控蛋白[4]，參與了DNA 復(fù)制前復(fù)合體的組裝。CDC6 的表達(dá)對(duì)于保持基因組穩(wěn)定、維持細(xì)胞周期的正常運(yùn)轉(zhuǎn)具有重要意義[5]。CDC6在LIHC中表達(dá)的臨床意義及其功能仍然不是很清楚。為此，本研究旨在研究CDC6在LIHC 中的表達(dá)水平及對(duì)患者臨床預(yù)后的影響，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下：

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2017 年1 月至2018 年2 月西安兵器工業(yè)五二一醫(yī)院確診的78例LIHC患者作為LIHC 組，另選擇同期在本院治療的50 例肝臟良性病變患者作為對(duì)照組。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)LIHC 組患者均經(jīng)病理學(xué)明確診斷為LIHC，對(duì)照組患者均排除LIHC；(2)經(jīng)病理學(xué)或活檢采集LIHC組患者的肝細(xì)胞癌組織和對(duì)照組患者的正常肝臟組織樣本完整，均經(jīng)石蠟包埋；(3)兩組患者的病歷資料和隨訪資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)既往有放療、化療等治療史者；(2)合并有其他惡性腫瘤者。LIHC 組患者中男性41 例，女性37 例；年齡42～78歲，平均(62.23±7.13)歲。對(duì)照組患者中男性27 例，女性23 例；年齡39～81 歲，平均(62.49±7.42)歲。兩組患者的性別、年齡比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，具有可比性。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有患者或家屬知情并簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 主要試劑及儀器 CDC6 mRNA引物由上海生工生物工程股份有限公司提供；兔抗人CDC6 單克隆抗體購自美國Abcam公司；DAB顯色試劑盒、SP免疫組織化學(xué)檢測試劑盒購自福州邁新公司；LC96qPCR儀器購自瑞士Roche公司。

1.2.2 免疫組化染色 將石蠟包埋的肝細(xì)胞癌組織和正常肝臟組織以5 μm的間距進(jìn)行連續(xù)切片，二甲苯脫蠟、蘇木素-伊紅染色后采用不同濃度的酒精完成梯度脫水；加熱抗原修復(fù)后消除內(nèi)源性過氧化物酶，完成上述操作后采用山羊血清進(jìn)行封閉；將兔抗人CDC6 單克隆抗體稀釋后滴加至組織切片中，放置在4℃的環(huán)境中孵育過夜；將組織切片放置在室溫環(huán)境下恢復(fù)溫度，之后采用PBS 緩沖液清洗組織切片，清洗次數(shù)為3次；之后滴加二抗，依次進(jìn)行DAB、蘇木素染色；染色操作完成后進(jìn)行酒精梯度脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，固定后在顯微鏡下觀察并拍照。

1.2.3 結(jié)果判定 每個(gè)組織樣本隨機(jī)選取4 個(gè)高倍鏡視野進(jìn)行觀察，根據(jù)組織細(xì)胞染色強(qiáng)度和染色細(xì)胞比例進(jìn)行評(píng)分：(1)染色強(qiáng)度；無染色記0 分，淡黃色記1 分，黃色記2 分，棕褐色記3 分；(2)染色細(xì)胞比例：每個(gè)視野下隨機(jī)取200 個(gè)細(xì)胞進(jìn)行計(jì)算，＜5%記0 分，5%～25%記1 分，26%～50%記2 分，51%～75%記3 分，＞75%記4 分。染色強(qiáng)度與染色細(xì)胞比例的分值相乘獲得最終評(píng)分，＞4分者即為陽性表達(dá)。

1.2.4 qRT-PCR檢測組織樣本中CDC6 mRNA的表達(dá) (1)提取總RNA：將研缽用液氮預(yù)冷處理后，把組織樣本置于研缽中進(jìn)行研磨至粉末狀，再置于1.5 mL 的離心管中加入1 mL預(yù)冷的Trizol裂解液，室溫下放置5 min。加入200μL的預(yù)冷氯仿試劑，旋渦震蕩離心管10 s，室溫中靜置5 min。設(shè)置離心機(jī)的參數(shù)為4℃，13 000 r/min，將標(biāo)本放置離心機(jī)中離心10 min。將上層無色水相轉(zhuǎn)移至新的1.5 mL 離心管中，加入等體積的預(yù)冷異丙醇試劑，室溫中靜置5 min。4℃、13 000 r/min 的條件下離心10 min，可見RNA 呈膠狀物在管底及側(cè)壁沉淀。移除上清液，加入1 mL 預(yù)冷的70%乙醇溶液混勻，同樣條件下離心10 min。移除上清液，同樣條件下再次離心10 s 后，吸凈剩余的洗液，室溫置于1～2 min。加入30 μL DEPC 水溶解總RNA。取1 μL 溶解后的RNA，DEPC 水調(diào)零，使用Nano微量分光光度計(jì)測量260 nm波長下的RNA濃度及測量RNA的純度(OD260/280)，OD260/280的納入范圍若在1.8～2.0，說明最終得到的RNA 質(zhì)量合格。將合格的RNA樣本保存在-20℃?zhèn)溆谩?2)RNA逆轉(zhuǎn)錄：選用中國天津中實(shí)基因生產(chǎn)的反轉(zhuǎn)錄試劑盒，將RNA產(chǎn)物逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。設(shè)置好PCR 儀的逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件，依次為30℃(15 min)→50℃(40 min)→85℃(10 min)→4℃，逆轉(zhuǎn)錄完成后將所得到的cDNA 產(chǎn)物放入-20℃冰箱中保存。(3)實(shí)時(shí)熒光測量PCR：取CDC6 mRNA引物，使用實(shí)時(shí)熒光測量PCR試劑盒進(jìn)行qRT-PCR反應(yīng)。每個(gè)PCR 反應(yīng)管內(nèi)熒光信號(hào)到達(dá)設(shè)定的閾值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)為CT值。將目的基因與內(nèi)參同時(shí)進(jìn)行qRT-PCR反應(yīng)，每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品設(shè)置3個(gè)相同的復(fù)孔，取3個(gè)CT值的平均值，目的基因的CT值越小，代表該目的基因表達(dá)越顯著。

1.3 隨訪 LIHC 組患者于術(shù)后通過電話、復(fù)查等形式進(jìn)行隨訪，隨訪截止2023 年2 月，無一例失訪。統(tǒng)計(jì)無進(jìn)展生存時(shí)間(DFS)、總生存時(shí)間(OS)，DFS定義為術(shù)后腫瘤復(fù)發(fā)或死亡時(shí)間。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS21.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料比較采用χ2檢驗(yàn)，生存曲線分析采用Kaplan-Meier法并進(jìn)行Log-rank檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 LIHC 組和對(duì)照組患者的CDC6 蛋白陽性表達(dá)及mRNA 表達(dá)量比較 LIHC組患者的CDC6蛋白陽性表達(dá)率為73.08%(57/78)，明顯高于對(duì)照組的6.00%(3/50)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=55.050，P=0.000)；LIHC組患者的CDC6mRNA 表達(dá)量為1.68±0.25，明顯高于對(duì)照組的1.42±0.22，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=6.010，P=0.000)。兩組患者的CDC6蛋白表達(dá)情況見圖1。

圖1 CDC6蛋白在正常肝組織與LIHC中的表達(dá)Figure 1 Expression of CDC6 protein in normal liver tissue and LIHC

2.2 LIHC組不同臨床病理特征患者的CDC6 mRNA表達(dá)量比較 LIHC組患者中，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNMⅠ～Ⅱ期、中低分化和脈管浸潤患者的CDC6 mRNA表達(dá)量水平明顯高于未發(fā)現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNMⅢ～Ⅳ期、高分化和未發(fā)現(xiàn)脈管浸潤的患者，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，見表1。

表1 LIHC組不同臨床病理特征患者的CDC6 mRNA表達(dá)量比較(±s)Table 1 Comparison on CDC6 mRNA expression level among patients with different clinic opathological characteristics in LIHC group(±s)

表1 LIHC組不同臨床病理特征患者的CDC6 mRNA表達(dá)量比較(±s)Table 1 Comparison on CDC6 mRNA expression level among patients with different clinic opathological characteristics in LIHC group(±s)

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2.3 CDC6 蛋白表達(dá)與LIHC 組患者不同臨床病理特征的關(guān)系 LIHC 組患者中，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNMⅠ～Ⅱ期、中低分化和脈管浸潤患者的CDC6 蛋白陽性表達(dá)率明顯高于未發(fā)現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNMⅢ～Ⅳ期、高分化和未發(fā)現(xiàn)脈管浸潤的患者，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，見表2。

表2 CDC6蛋白表達(dá)與LIHC組患者不同臨床病理特征的關(guān)系[例(%)]Table 2 Relationship between CDC6 protein expression and different clinic opathological features of patients in LIHC group[n(%)]

2.4 不同CDC6 蛋白表達(dá)和CDC6 mRNA 表達(dá)LIHC 患者的預(yù)后情況 LIHC 組中CDC6 陽性表達(dá)患者的無進(jìn)展生存期(DFS)和總生存期(OS)分別為(40.56±4.26)個(gè)月、(54.12±8.23)個(gè)月，明顯低于CDC6陰性表達(dá)患者的(46.57±6.16)個(gè)月、(65.73±9.44)個(gè)月，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=4.872、5.310，P=0.000、0.000)。LIHC組患者的無進(jìn)展生存曲線和總生存曲線見圖2。Kaplan-Meier 曲線結(jié)果表明，高CDC6 mRNA 表達(dá)患者的OS 為(56.36±7.23)個(gè)月，明顯低于低表達(dá)患者的(63.47±8.16)個(gè)月，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=3.937，P=0.000)，見圖3。

圖2 LIHC組中不同CDC6蛋白表達(dá)患者的DFS曲線(A)和OS曲線(B)Figure 2 DFS curve (A) and OS curve (B) of patients with different CDC6 protein expression in LIHC group

圖3 LIHC組中不同CDC6 mRNA表達(dá)患者的OS曲線Figure 3OS curve of patients with different CDC6 mRNA expression in LIHC group

3 討論

手術(shù)切除是治療早期LIHC的主要手段，雖然5年生存率有所改善，但是對(duì)于晚期患者LIHC 來說總體預(yù)后仍不理想[6]。多項(xiàng)研究表明，LIHC的發(fā)病和進(jìn)展是一個(gè)極其復(fù)雜的過程，期間有相當(dāng)數(shù)量的基因存在異常表達(dá)[7]。CDC6的表達(dá)與DNA復(fù)制以及細(xì)胞增殖密切相關(guān)，目前已有研究證實(shí)，CDC6 在宮頸癌、乳腺癌以及胃癌等多種腫瘤組織中存在異常表達(dá)[8]，但關(guān)于CDC6在LIHC組織中的異常表達(dá)目前報(bào)道較少。

正常細(xì)胞的DNA 復(fù)制往往受到嚴(yán)格調(diào)控，DNA的異常復(fù)制是導(dǎo)致惡性腫瘤發(fā)生、發(fā)展的基礎(chǔ)和關(guān)鍵[9]。目前已證實(shí)，CDC6 是DNA 復(fù)制前復(fù)合體的主要組成成分，其異常表達(dá)能夠直接影響DNA的復(fù)制以及細(xì)胞周期的調(diào)控，促進(jìn)惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展[10-11]。本研究結(jié)果顯示，肝細(xì)胞癌組織和正常肝臟組織的CDC6 蛋白表達(dá)和mRNA 表達(dá)量，發(fā)現(xiàn)與正常肝臟組織相比，肝細(xì)胞癌組織中CDC6 蛋白表達(dá)和mRNA表達(dá)量明顯升高。這一結(jié)果初步證實(shí)了LIHC患者的肝細(xì)胞癌組織中存在CDC6 的過度表達(dá)，CDC6 的異常表達(dá)與LIHC 的發(fā)生、發(fā)展存在一定關(guān)聯(lián)。同時(shí)還發(fā)現(xiàn)，LIHC 組患者中TNM Ⅰ～Ⅱ期、中低分化者的CDC6 mRNA 表達(dá)量水平、CDC6 蛋白陽性表達(dá)率均明顯高于TNMⅢ～Ⅳ期、高分化的患者。以上結(jié)果表明，CDC6 的異常表達(dá)與LIHC 的病理分期、分化程度明顯相關(guān)。

淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是LIHC 患者常見的腫瘤轉(zhuǎn)移類型，也是影響LIHC患者預(yù)后的關(guān)鍵因素[12]。通常來說，惡性腫瘤的轉(zhuǎn)移需要通過局部組織浸潤、脈管浸潤后，經(jīng)血液循環(huán)進(jìn)入新的組織器官進(jìn)行增殖[13]。本研究中，LIHC 患者中發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、脈管浸潤患者的CDC6 mRNA 表達(dá)量水平、CDC6 蛋白陽性表達(dá)率分別高于未發(fā)現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、未發(fā)現(xiàn)脈管浸潤的患者。提示CDC6 的陽性表達(dá)可能預(yù)示LIHC 患者腫瘤的具有高侵襲性或者已經(jīng)發(fā)生轉(zhuǎn)移，患者的預(yù)后較差。因此，CDC6的表達(dá)對(duì)于LIHC患者的臨床療效評(píng)價(jià)以及預(yù)后評(píng)估都具有一定意義[14-15]。另外，本研究對(duì)LIHC患者的生存期與CDC6蛋白陽性表達(dá)和mRNA表達(dá)進(jìn)行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，CDC6 陽性表達(dá)患者的DFS、OS明顯低于CDC6 陰性表達(dá)患者。Kaplan-Meier曲線結(jié)果表明，高CDC6 mRNA 表達(dá)的患者的OS 明顯低于低表達(dá)患者，本研究認(rèn)為CDC6 在臨床中可作為判斷患者預(yù)后的分子標(biāo)志物。

綜上所述，CDC6表達(dá)與LIHC患者的臨床病理特征及預(yù)后存在一定關(guān)聯(lián)，CDC6 表達(dá)高的患者預(yù)后較差，因此CDC6有可能成為LIHC的預(yù)后標(biāo)志物及潛在治療靶點(diǎn)。這些研究為研究LIHC的作用機(jī)制與靶向藥物的研制及腫瘤的治療提供理論依據(jù)。