屈耀寧，李曉梅

1.西安兵器工業(yè)五二一醫(yī)院消化內科，陜西 西安 710065；

2.西安航天總醫(yī)院消化內科，陜西 西安 710100

據(jù)報道，肝癌的發(fā)病率逐年上升，其5年總體生存率(overall survival，OS)僅為18%[1]。肝癌患者中以肝細胞癌(liver hepatocellular carcinoma，LIHC)最為常見，發(fā)病早期難以察覺，多數(shù)患者確診時已處于中晚期，手術切除治療難以徹底根治，術后復發(fā)率高，預后較差[2]。因此，尋找新型有效的分子靶標，對改善LIHC 的預后具有重要意義[3]。早診斷、早發(fā)現(xiàn)、早治療是治療LIHC的關鍵，目前LIHC的治療仍處于臨床探索階段。細胞分裂周期蛋白6(cell division cycleprotein 6，CDC6)是真核細胞DNA復制起始的關鍵調控蛋白[4]，參與了DNA 復制前復合體的組裝。CDC6 的表達對于保持基因組穩(wěn)定、維持細胞周期的正常運轉具有重要意義[5]。CDC6在LIHC中表達的臨床意義及其功能仍然不是很清楚。為此，本研究旨在研究CDC6在LIHC 中的表達水平及對患者臨床預后的影響，現(xiàn)將結果報道如下：

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2017 年1 月至2018 年2 月西安兵器工業(yè)五二一醫(yī)院確診的78例LIHC患者作為LIHC 組，另選擇同期在本院治療的50 例肝臟良性病變患者作為對照組。納入標準：(1)LIHC 組患者均經(jīng)病理學明確診斷為LIHC，對照組患者均排除LIHC；(2)經(jīng)病理學或活檢采集LIHC組患者的肝細胞癌組織和對照組患者的正常肝臟組織樣本完整，均經(jīng)石蠟包埋；(3)兩組患者的病歷資料和隨訪資料完整。排除標準：(1)既往有放療、化療等治療史者；(2)合并有其他惡性腫瘤者。LIHC 組患者中男性41 例，女性37 例；年齡42～78歲，平均(62.23±7.13)歲。對照組患者中男性27 例，女性23 例；年齡39～81 歲，平均(62.49±7.42)歲。兩組患者的性別、年齡比較差異均無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)，具有可比性。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會批準，所有患者或家屬知情并簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 主要試劑及儀器 CDC6 mRNA引物由上海生工生物工程股份有限公司提供；兔抗人CDC6 單克隆抗體購自美國Abcam公司；DAB顯色試劑盒、SP免疫組織化學檢測試劑盒購自福州邁新公司；LC96qPCR儀器購自瑞士Roche公司。

1.2.2 免疫組化染色 將石蠟包埋的肝細胞癌組織和正常肝臟組織以5 μm的間距進行連續(xù)切片，二甲苯脫蠟、蘇木素-伊紅染色后采用不同濃度的酒精完成梯度脫水；加熱抗原修復后消除內源性過氧化物酶，完成上述操作后采用山羊血清進行封閉；將兔抗人CDC6 單克隆抗體稀釋后滴加至組織切片中，放置在4℃的環(huán)境中孵育過夜；將組織切片放置在室溫環(huán)境下恢復溫度，之后采用PBS 緩沖液清洗組織切片，清洗次數(shù)為3次；之后滴加二抗，依次進行DAB、蘇木素染色；染色操作完成后進行酒精梯度脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，固定后在顯微鏡下觀察并拍照。

1.2.3 結果判定 每個組織樣本隨機選取4 個高倍鏡視野進行觀察，根據(jù)組織細胞染色強度和染色細胞比例進行評分：(1)染色強度；無染色記0 分，淡黃色記1 分，黃色記2 分，棕褐色記3 分；(2)染色細胞比例：每個視野下隨機取200 個細胞進行計算，＜5%記0 分，5%～25%記1 分，26%～50%記2 分，51%～75%記3 分，＞75%記4 分。染色強度與染色細胞比例的分值相乘獲得最終評分，＞4分者即為陽性表達。

1.2.4 qRT-PCR檢測組織樣本中CDC6 mRNA的表達 (1)提取總RNA：將研缽用液氮預冷處理后，把組織樣本置于研缽中進行研磨至粉末狀，再置于1.5 mL 的離心管中加入1 mL預冷的Trizol裂解液，室溫下放置5 min。加入200μL的預冷氯仿試劑，旋渦震蕩離心管10 s，室溫中靜置5 min。設置離心機的參數(shù)為4℃，13 000 r/min，將標本放置離心機中離心10 min。將上層無色水相轉移至新的1.5 mL 離心管中，加入等體積的預冷異丙醇試劑，室溫中靜置5 min。4℃、13 000 r/min 的條件下離心10 min，可見RNA 呈膠狀物在管底及側壁沉淀。移除上清液，加入1 mL 預冷的70%乙醇溶液混勻，同樣條件下離心10 min。移除上清液，同樣條件下再次離心10 s 后，吸凈剩余的洗液，室溫置于1～2 min。加入30 μL DEPC 水溶解總RNA。取1 μL 溶解后的RNA，DEPC 水調零，使用Nano微量分光光度計測量260 nm波長下的RNA濃度及測量RNA的純度(OD260/280)，OD260/280的納入范圍若在1.8～2.0，說明最終得到的RNA 質量合格。將合格的RNA樣本保存在-20℃?zhèn)溆谩?2)RNA逆轉錄：選用中國天津中實基因生產(chǎn)的反轉錄試劑盒，將RNA產(chǎn)物逆轉錄合成cDNA。設置好PCR 儀的逆轉錄反應條件，依次為30℃(15 min)→50℃(40 min)→85℃(10 min)→4℃，逆轉錄完成后將所得到的cDNA 產(chǎn)物放入-20℃冰箱中保存。(3)實時熒光測量PCR：取CDC6 mRNA引物，使用實時熒光測量PCR試劑盒進行qRT-PCR反應。每個PCR 反應管內熒光信號到達設定的閾值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)為CT值。將目的基因與內參同時進行qRT-PCR反應，每個標準品設置3個相同的復孔，取3個CT值的平均值，目的基因的CT值越小，代表該目的基因表達越顯著。

1.3 隨訪 LIHC 組患者于術后通過電話、復查等形式進行隨訪，隨訪截止2023 年2 月，無一例失訪。統(tǒng)計無進展生存時間(DFS)、總生存時間(OS)，DFS定義為術后腫瘤復發(fā)或死亡時間。

1.4 統(tǒng)計學方法 應用SPSS21.0 統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析。計量資料以均數(shù)±標準差(±s)表示，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，計數(shù)資料比較采用χ2檢驗，生存曲線分析采用Kaplan-Meier法并進行Log-rank檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 LIHC 組和對照組患者的CDC6 蛋白陽性表達及mRNA 表達量比較 LIHC組患者的CDC6蛋白陽性表達率為73.08%(57/78)，明顯高于對照組的6.00%(3/50)，差異有統(tǒng)計學意義(χ2=55.050，P=0.000)；LIHC組患者的CDC6mRNA 表達量為1.68±0.25，明顯高于對照組的1.42±0.22，差異有統(tǒng)計學意義(t=6.010，P=0.000)。兩組患者的CDC6蛋白表達情況見圖1。

圖1 CDC6蛋白在正常肝組織與LIHC中的表達Figure 1 Expression of CDC6 protein in normal liver tissue and LIHC

2.2 LIHC組不同臨床病理特征患者的CDC6 mRNA表達量比較 LIHC組患者中，淋巴結轉移、TNMⅠ～Ⅱ期、中低分化和脈管浸潤患者的CDC6 mRNA表達量水平明顯高于未發(fā)現(xiàn)淋巴結轉移、TNMⅢ～Ⅳ期、高分化和未發(fā)現(xiàn)脈管浸潤的患者，差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，見表1。

表1 LIHC組不同臨床病理特征患者的CDC6 mRNA表達量比較(±s)Table 1 Comparison on CDC6 mRNA expression level among patients with different clinic opathological characteristics in LIHC group(±s)

表1 LIHC組不同臨床病理特征患者的CDC6 mRNA表達量比較(±s)Table 1 Comparison on CDC6 mRNA expression level among patients with different clinic opathological characteristics in LIHC group(±s)

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2.3 CDC6 蛋白表達與LIHC 組患者不同臨床病理特征的關系 LIHC 組患者中，淋巴結轉移、TNMⅠ～Ⅱ期、中低分化和脈管浸潤患者的CDC6 蛋白陽性表達率明顯高于未發(fā)現(xiàn)淋巴結轉移、TNMⅢ～Ⅳ期、高分化和未發(fā)現(xiàn)脈管浸潤的患者，差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，見表2。

表2 CDC6蛋白表達與LIHC組患者不同臨床病理特征的關系[例(%)]Table 2 Relationship between CDC6 protein expression and different clinic opathological features of patients in LIHC group[n(%)]

2.4 不同CDC6 蛋白表達和CDC6 mRNA 表達LIHC 患者的預后情況 LIHC 組中CDC6 陽性表達患者的無進展生存期(DFS)和總生存期(OS)分別為(40.56±4.26)個月、(54.12±8.23)個月，明顯低于CDC6陰性表達患者的(46.57±6.16)個月、(65.73±9.44)個月，差異均有統(tǒng)計學意義(t=4.872、5.310，P=0.000、0.000)。LIHC組患者的無進展生存曲線和總生存曲線見圖2。Kaplan-Meier 曲線結果表明，高CDC6 mRNA 表達患者的OS 為(56.36±7.23)個月，明顯低于低表達患者的(63.47±8.16)個月，差異具有統(tǒng)計學意義(t=3.937，P=0.000)，見圖3。

圖2 LIHC組中不同CDC6蛋白表達患者的DFS曲線(A)和OS曲線(B)Figure 2 DFS curve (A) and OS curve (B) of patients with different CDC6 protein expression in LIHC group

圖3 LIHC組中不同CDC6 mRNA表達患者的OS曲線Figure 3OS curve of patients with different CDC6 mRNA expression in LIHC group

3 討論

手術切除是治療早期LIHC的主要手段，雖然5年生存率有所改善，但是對于晚期患者LIHC 來說總體預后仍不理想[6]。多項研究表明，LIHC的發(fā)病和進展是一個極其復雜的過程，期間有相當數(shù)量的基因存在異常表達[7]。CDC6的表達與DNA復制以及細胞增殖密切相關，目前已有研究證實，CDC6 在宮頸癌、乳腺癌以及胃癌等多種腫瘤組織中存在異常表達[8]，但關于CDC6在LIHC組織中的異常表達目前報道較少。

正常細胞的DNA 復制往往受到嚴格調控，DNA的異常復制是導致惡性腫瘤發(fā)生、發(fā)展的基礎和關鍵[9]。目前已證實，CDC6 是DNA 復制前復合體的主要組成成分，其異常表達能夠直接影響DNA的復制以及細胞周期的調控，促進惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展[10-11]。本研究結果顯示，肝細胞癌組織和正常肝臟組織的CDC6 蛋白表達和mRNA 表達量，發(fā)現(xiàn)與正常肝臟組織相比，肝細胞癌組織中CDC6 蛋白表達和mRNA表達量明顯升高。這一結果初步證實了LIHC患者的肝細胞癌組織中存在CDC6 的過度表達，CDC6 的異常表達與LIHC 的發(fā)生、發(fā)展存在一定關聯(lián)。同時還發(fā)現(xiàn)，LIHC 組患者中TNM Ⅰ～Ⅱ期、中低分化者的CDC6 mRNA 表達量水平、CDC6 蛋白陽性表達率均明顯高于TNMⅢ～Ⅳ期、高分化的患者。以上結果表明，CDC6 的異常表達與LIHC 的病理分期、分化程度明顯相關。

淋巴結轉移是LIHC 患者常見的腫瘤轉移類型，也是影響LIHC患者預后的關鍵因素[12]。通常來說，惡性腫瘤的轉移需要通過局部組織浸潤、脈管浸潤后，經(jīng)血液循環(huán)進入新的組織器官進行增殖[13]。本研究中，LIHC 患者中發(fā)生淋巴結轉移、脈管浸潤患者的CDC6 mRNA 表達量水平、CDC6 蛋白陽性表達率分別高于未發(fā)現(xiàn)淋巴結轉移、未發(fā)現(xiàn)脈管浸潤的患者。提示CDC6 的陽性表達可能預示LIHC 患者腫瘤的具有高侵襲性或者已經(jīng)發(fā)生轉移，患者的預后較差。因此，CDC6的表達對于LIHC患者的臨床療效評價以及預后評估都具有一定意義[14-15]。另外，本研究對LIHC患者的生存期與CDC6蛋白陽性表達和mRNA表達進行分析，結果發(fā)現(xiàn)，CDC6 陽性表達患者的DFS、OS明顯低于CDC6 陰性表達患者。Kaplan-Meier曲線結果表明，高CDC6 mRNA 表達的患者的OS 明顯低于低表達患者，本研究認為CDC6 在臨床中可作為判斷患者預后的分子標志物。

綜上所述，CDC6表達與LIHC患者的臨床病理特征及預后存在一定關聯(lián)，CDC6 表達高的患者預后較差，因此CDC6有可能成為LIHC的預后標志物及潛在治療靶點。這些研究為研究LIHC的作用機制與靶向藥物的研制及腫瘤的治療提供理論依據(jù)。