喬華雙 毛玉娣 陳琦琦 吳星辰 丁西平

幽門(mén)螺桿菌（Hp）是一種革蘭氏陰性、微需氧、螺旋形和有鞭毛的細(xì)菌，在全球范圍內(nèi)約一半人口被它感染[1]。Hp感染導(dǎo)致多種胃腸道并發(fā)癥，如慢性胃炎、消化性潰瘍，甚至胃癌及胃黏膜相關(guān)淋巴組織淋巴瘤等疾病，因此該類(lèi)細(xì)菌被納入Ⅰ類(lèi)致癌物[2]。腸道菌群在腸道內(nèi)形成了一個(gè)復(fù)雜、動(dòng)態(tài)變化且空間異質(zhì)的生態(tài)系統(tǒng)，通過(guò)能量代謝、物質(zhì)產(chǎn)生、免疫反應(yīng)等方面維持腸道內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)，并影響疾病的轉(zhuǎn)歸[3]。本研究通過(guò)16SrDNA高通量測(cè)序比較抗Hp治療過(guò)程中菌群變化和抗Hp治療成功組與失敗組之間的菌群差異，尋找導(dǎo)致根除失敗的菌群。找出可能影響療效的腸道菌群改變，為益生菌聯(lián)合療法提高Hp根除率提供臨床依據(jù)，同時(shí)也為抗幽門(mén)螺桿菌治療探索新的方案提供方向。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2021年12月-2022年4月在安徽省立醫(yī)院就診的幽門(mén)螺桿菌感染患者作為研究對(duì)象，本研究經(jīng)安徽省立醫(yī)院的倫理委員會(huì)審查同意且患者知情同意。①納入標(biāo)準(zhǔn)：年齡18～65歲；呼氣試驗(yàn)陽(yáng)性患者；有明顯消化道癥狀患者；既往無(wú)根除Hp治療史。②排除標(biāo)準(zhǔn)：近1個(gè)月有抗生素、鉍劑、PPI、益生元、益生菌及抗腹瀉藥物治療史；對(duì)PPI、抗生素及鉍劑過(guò)敏患者；患者患有嚴(yán)重肝腎疾病，以及其它影響腸道菌群構(gòu)成的疾??；治療及觀察期間服用其它影響腸道菌群藥物者；妊娠期、哺乳期婦女及患有嚴(yán)重精神疾病者。本研究共納入符合標(biāo)準(zhǔn)的患者22例，年齡21～65歲，男性13例，女性9例。臨床表現(xiàn)主要有腹痛9例，惡心8例，反酸9例，腹脹12例，噯氣6例，腹瀉3例，食欲不振4例，便秘1例，無(wú)無(wú)癥狀感染者。

1.2 方法

1.2.1 臨床資料收集 收集符合標(biāo)準(zhǔn)患者的年齡、性別及臨床表現(xiàn)，并記錄患者服藥過(guò)程中不良反應(yīng)及服藥后臨床癥狀改善情況?；颊叻盟幬锘拘畔⒓白⒁馐马?xiàng)見(jiàn)表1。

表1 患者服用藥物基本信息及注意事項(xiàng)

1.2.2 16SrDNA測(cè)序方法 收集患者治療前、治療2 周及停藥1 個(gè)月后的大便標(biāo)本1～3 g于糞便盒中，2 h內(nèi)送至-80°冰箱進(jìn)行儲(chǔ)存。對(duì)微生物組樣本，選用合適的總DNA提取方法，采用Nanodrop對(duì)DNA進(jìn)行定量，并通過(guò)1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA提取質(zhì)量。以微生物核糖體RNA或特定基因片段等目標(biāo)序列為靶點(diǎn)，對(duì)rRNA基因可變區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，采用Illumina公司的TruSeq Nano DNA LT Library Prep Kit制備測(cè)序文庫(kù)，使用MiSeq測(cè)序儀進(jìn)行雙端測(cè)序，測(cè)序長(zhǎng)度為200～450 bp。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS25.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，正態(tài)分布計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，計(jì)數(shù)資料用n（%）表示，兩組之間比較采用t檢驗(yàn)，多組之間采用F檢驗(yàn)；非正態(tài)分布計(jì)量資料以中位數(shù)和四分位數(shù)表示，兩組之間比較采用Mann-Whitney U檢驗(yàn)，多組之間采用Kruskal-Wallis檢驗(yàn)，P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 治療效果及治療過(guò)程中患者臨床癥狀改變情況分析 治療成功18 例，治療失敗4 例，幽門(mén)螺桿菌根除率81.82%。患者在治療過(guò)程中均規(guī)律服藥，無(wú)漏服、停藥及合并其它用藥情況?；颊咴谥委熀笈R床癥狀較前改善，主要表現(xiàn)為惡心、反酸、腹痛腹脹及食欲不振癥狀較前改善。

2.2 腸道菌群α多樣性變化 根據(jù)16SrDNA測(cè)序結(jié)果，使用Chao1 指數(shù)、Simpson指數(shù)、Shannon指數(shù)來(lái)分析幽門(mén)螺桿菌感染患者治療前后腸道菌群α多樣性變化，治療前、治療2 周、停藥1 個(gè)月后α多樣性指數(shù)差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），比較治療成功組與治療失敗組在停藥1 個(gè)月后的腸道菌群，發(fā)現(xiàn)治療成功組與失敗組α多樣性指數(shù)差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見(jiàn)表2。

表2 兩組不同治療時(shí)間α多樣性指數(shù)比較

2.3 腸道菌群顯著性差異分析 根據(jù)16SrDNA測(cè)序結(jié)果，幽門(mén)螺桿菌感染患者腸道菌群優(yōu)勢(shì)菌門(mén)主要為厚壁菌門(mén)、擬桿菌門(mén)、變形菌門(mén)、放線菌門(mén)。幽門(mén)螺桿菌根除治療過(guò)程中，厚壁菌門(mén)、變形菌門(mén)、放線菌門(mén)、糖細(xì)菌門(mén)、梭桿菌門(mén)序列數(shù)發(fā)生改變，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)表3。幽門(mén)螺桿菌感染患者優(yōu)勢(shì)菌屬主要有擬桿菌屬、布勞特氏菌屬、糞桿菌屬、瘤胃球菌屬。幽門(mén)螺桿菌根除治療過(guò)程中，布勞特氏菌屬、志賀菌屬、糞桿菌屬、普雷沃菌屬、顫螺菌屬、梭菌屬序列數(shù)發(fā)生改變，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)表4。

表3 治療過(guò)程中腸道菌群在門(mén)水平差異性比較

2.4 治療成功組與失敗組菌群差異分析 根據(jù)16SrDNA測(cè)序結(jié)果，比較治療成功組與治療失敗組在停藥1 個(gè)月后的腸道菌群，發(fā)現(xiàn)兩組門(mén)水平治療差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見(jiàn)表5，與治療成功組相比，治療失敗組多爾氏菌屬（Dorea）序列數(shù)升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Z=-2.457，P=0.014），治療失敗組雙歧桿菌屬序列數(shù)降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Z=-2.533，P=0.011），見(jiàn)表6。

表6 兩組在屬水平差異性比較

3 討 論

幽門(mén)螺桿菌是一種革蘭陰性細(xì)菌，Hp利用其運(yùn)動(dòng)性、趨化性、尿素酶產(chǎn)生和其他機(jī)制來(lái)適應(yīng)管腔的酸性條件，并在上皮細(xì)胞表面狹窄處定植。由于Hp感染會(huì)導(dǎo)致胃內(nèi)微環(huán)境改變，并且通過(guò)其產(chǎn)生的毒力因子等對(duì)胃黏膜上皮細(xì)胞造成損傷，繼而導(dǎo)致胃內(nèi)炎癥甚至癌癥，在Hp感染早期，根除治療是預(yù)防疾病發(fā)生的有效措施[4]。Hp定植在胃黏膜上皮細(xì)胞，可以引起胃內(nèi)pH改變及導(dǎo)致胃黏膜上皮損傷，Hp通過(guò)改變胃內(nèi)pH、內(nèi)分泌及免疫功能調(diào)節(jié)進(jìn)而影響下游腸道菌群改變。

本研究患者在治療2周及停藥1個(gè)月腸道菌群的α多樣性均降低，表明在抗幽門(mén)螺桿菌藥物治療過(guò)程中導(dǎo)致腸道內(nèi)物種多樣性下降，腸道內(nèi)物種多樣性下降會(huì)繼而導(dǎo)致腸道內(nèi)菌群紊亂。而治療成功組與治療失敗組在α多樣性無(wú)顯著性差異（P＞0.05），說(shuō)明不同治療效果對(duì)菌群多樣性的影響并不明顯。治療過(guò)程中志賀菌屬等菌屬序列數(shù)升高，而糞桿菌屬、普雷沃菌屬、顫螺菌屬等產(chǎn)生短鏈脂肪酸的優(yōu)勢(shì)菌屬序列數(shù)降低，這些菌群的豐度發(fā)生改變，會(huì)導(dǎo)致菌群紊亂。志賀菌屬是一種促炎細(xì)菌，可產(chǎn)生LPS，刺激炎癥因子的分泌[5]。在抗Hp治療過(guò)程中，產(chǎn)生短鏈脂肪酸的菌屬序列數(shù)在治療過(guò)程中較前減低，可能導(dǎo)致腸道黏膜屏障受損和腸道炎癥。SCFA，尤其是丁酸，是維持結(jié)腸上皮細(xì)胞的重要底物，丁酸是結(jié)腸細(xì)胞利用的首選燃料，體內(nèi)丁酸螯合的主要部位是腸上皮細(xì)胞。緊密連接蛋白本身調(diào)節(jié)管腔和肝門(mén)系統(tǒng)之間的細(xì)胞內(nèi)分子高速公路。在結(jié)腸中產(chǎn)生的SCFA中，丁酸鹽是緊密連接蛋白最重要的調(diào)節(jié)劑，蛋白質(zhì)是緊密連接組件的關(guān)鍵組成部分，并且已被證明可以通過(guò)增加claudin-1 和Zonula Occludens-1（ZO-1）的表達(dá)和occludin再分布來(lái)增強(qiáng)腸屏障功能。細(xì)菌脂多糖增加會(huì)觸發(fā)免疫細(xì)胞（單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和庫(kù)普弗細(xì)胞）中的Toll樣受體4（TLR4）介導(dǎo)的促炎級(jí)聯(lián)反應(yīng)，丁酸被證實(shí)可以抑制炎癥反應(yīng)[6]。丁酸可通過(guò)抑制幽門(mén)螺桿菌的生存能力和毒力來(lái)減少幽門(mén)螺桿菌誘導(dǎo)的炎癥，并可能減少與幽門(mén)螺桿菌感染小鼠腸道微生物群相關(guān)的炎癥[7]。本研究發(fā)現(xiàn)，抗幽門(mén)螺桿菌治療過(guò)程中，腸道內(nèi)優(yōu)勢(shì)菌屬和多樣性發(fā)生改變，導(dǎo)致致病菌生長(zhǎng)和產(chǎn)生短鏈脂肪酸菌屬減少，腸道屏障作用減弱及炎癥水平升高，因此在根除幽門(mén)螺桿菌治療過(guò)程中需要關(guān)注腸道菌群紊亂問(wèn)題，腸道菌群發(fā)生紊亂后，腸道內(nèi)的穩(wěn)態(tài)受到破壞，可能導(dǎo)致機(jī)會(huì)性感染，因此我們?cè)诳褂拈T(mén)螺桿菌治療過(guò)程中需要關(guān)注腸道菌群紊亂，并及時(shí)做出應(yīng)對(duì)之策。

本研究中根據(jù)16SrDNA測(cè)序結(jié)果，比較治療成功組與治療失敗組在停藥1 個(gè)月后的腸道菌群，與治療成功組相比，治療失敗組多爾氏菌（Dorea）屬序列數(shù)升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），治療失敗組雙歧桿菌屬序列數(shù)降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。多爾氏菌屬豐度高的患者腸道炎癥反應(yīng)更重，容易出現(xiàn)腸道黏膜的損傷，這類(lèi)腸道致病菌的過(guò)度生長(zhǎng)，可能會(huì)導(dǎo)致根除治療的失敗。雙歧桿菌是一種革蘭氏陽(yáng)性厭氧菌，容易通過(guò)附著在腸道上形成菌落，對(duì)胃腸道環(huán)境有抵抗力，它在腸道菌群中生存時(shí)會(huì)產(chǎn)生各種抗菌肽。雙歧桿菌主要作用是提高抗炎細(xì)胞因子水平，降低促炎細(xì)胞因子水平。使用雙歧桿菌后，測(cè)乙酸、丙酸、丁酸和總短鏈脂肪酸含量均顯著提高，改變了腸道菌群的組成，腸道菌群的豐度和多樣性較前升高[8]。本研究中治療失敗組雙歧桿菌序列數(shù)較成功組降低，說(shuō)明雙歧桿菌序列數(shù)降低，產(chǎn)生短鏈脂肪酸相對(duì)減少，導(dǎo)致腸道通透性升高和炎癥水平升高，可能最終導(dǎo)致抗幽門(mén)螺桿菌治療失敗。益生菌可以改善腸道微生物平衡，通過(guò)預(yù)防或減輕腸道感染、癌癥、過(guò)敏性疾病和心血管疾病對(duì)宿主發(fā)揮有益作用。并且可以促進(jìn)腸道成熟和完整性，抵御病原體并調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)[9]。本研究中治療失敗組雙歧桿菌菌屬序列數(shù)較治療成功組低，雙歧桿菌的豐度減低導(dǎo)致短鏈脂肪酸的減少，腸道屏障作用減少，促炎因子增多，炎癥水平升高，最終可能導(dǎo)致治療失敗。為益生菌聯(lián)合療法提高治療根除率提供臨床依據(jù)，同時(shí)也為抗幽門(mén)螺桿菌治療探索新的方案提供方向。

綜上所述，本研究中發(fā)現(xiàn)在抗幽門(mén)螺桿菌治療過(guò)程患者的腸道菌群優(yōu)勢(shì)菌群發(fā)生改變，導(dǎo)致腸道菌群紊亂。治療成功組與失敗組之間的菌群差異，表現(xiàn)為致病菌的序列數(shù)增加和產(chǎn)生短鏈脂肪酸菌群的序列數(shù)降低，導(dǎo)致腸道屏障作用減弱，促炎因子增多，炎癥水平升高，最終可能影響根除效果，導(dǎo)致根除治療失敗。因此在治療過(guò)程中需要關(guān)注腸道菌群紊亂，為益生菌聯(lián)合療法提高Hp根除率提供臨床依據(jù)。