王燕艷, 王 梅, 黃琰菁, 鄭佳璇, 鄭垂志

海南省人民醫(yī)院(海南醫(yī)學(xué)院附屬海南醫(yī)院)1.腫瘤內(nèi)科;2.乳腺外科;3.病理科,海南 ?？?570100

乳腺癌為女性高發(fā)惡性腫瘤,伴隨著多種基因及蛋白表達(dá)的改變。有研究發(fā)現(xiàn),乳腺癌早期患者已經(jīng)出現(xiàn)婆羅雙樹樣基因4(sal-like 4,SALL4)表達(dá)升高,SALL4會(huì)參與乳腺癌的腫瘤增殖、腫瘤細(xì)胞間粘附等多種生物學(xué)行為[1]。乳腺癌對(duì)化療較為敏感,化療是乳腺癌的重要治療手段之一,但耐藥問題會(huì)使化療效果大打折扣,提高乳腺癌患者的化療敏感性成為當(dāng)前研究熱點(diǎn)[2-3]。以阿霉素為主的蒽環(huán)類藥物是乳腺癌的常用化療方案,從分子水平分析乳腺癌對(duì)阿霉素耐藥的機(jī)制可為乳腺癌新的治療靶點(diǎn)提供參考。SALL4與乳腺癌細(xì)胞的阿霉素耐藥性有關(guān),而PTEN/AKT/mTOR通路被證實(shí)是與乳腺癌耐藥性有關(guān)的通路[4]。本研究旨在探討乳腺癌患者SALL4的表達(dá)情況,以及PTEN/AKT/mTOR通路對(duì)乳腺癌阿霉素耐藥性的作用。現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 選取海南省人民醫(yī)院自2010年6月至2022年6月收治的90例乳腺癌手術(shù)患者為研究對(duì)象。納入標(biāo)準(zhǔn):原發(fā)性乳腺癌;術(shù)前未接受放療、化療、內(nèi)分泌治療等抗腫瘤治療。排除標(biāo)準(zhǔn):伴其他惡性腫瘤;伴遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移?；颊呔鶠榕?年齡27～63歲,平均年齡(50.46±6.17)歲;腫瘤最大徑≤5 cm 52例,最大徑>5 cm 38例;病理類型為浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌72例,其他18例;組織學(xué)分級(jí)Ⅰ級(jí)12例,Ⅱ級(jí)61例,Ⅲ級(jí)17例;有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移42例,無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移48例;雌激素受體(estrogen receptor,ER)陽性50例,陰性40例;人表皮生長(zhǎng)因子受體(human epidermal growth factor receptor-2,HER-2)陽性36例,陰性54例;孕激素受體(progesterone receptor,PR)陽性44例,陰性46例;Ki67<14% 16例,Ki67≥14% 74例。提取50～100 mg癌組織及癌旁組織(距癌組織邊緣>5 cm)置于EP管中,立即放入液氮罐并置于-80℃下保存待測(cè)?；颊呒捌浼覍倬炇鹬橥鈺１狙芯拷?jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 SALL4表達(dá)檢測(cè) (1)免疫組織化學(xué)法。乳腺癌組織石蠟切片,厚度4 μm。60℃下烤1 h,依次放入二甲苯Ⅰ、Ⅱ等洗脫15 min,無水乙醇Ⅱ 5 min,95%、85%、75%乙醇、蒸餾水分別2 min。微波加熱抗原修復(fù)液,放入切片,加熱10 min。PBS浸泡5 min,3次。吸水,3%H2O2孵育15 min,PBS浸泡。滴加山羊血清并孵育15 min。一抗用PBS稀釋50倍,PBS浸泡。二抗用PBS稀釋200倍,孵育、浸泡。滴加HRP標(biāo)記親和素,孵育、浸泡。等量混合DAB顯色試劑A、B,加100 μl顯色試劑,待顏色變深時(shí)終止顯色。蘇木素復(fù)染3 min,流水沖洗返藍(lán)5 min。切片依次浸入75%、85%、95%乙醇等洗脫、封片。判定標(biāo)準(zhǔn):每張染色切片均在高倍視野下隨機(jī)選取5個(gè)視野,計(jì)數(shù)200個(gè)細(xì)胞;陽性細(xì)胞百分比占比0%、占比<25%、25%～49%、占比≥50%分別計(jì)0分、1分、2分、3分,染色強(qiáng)度無著色、淺黃色、黃色、棕黃色分別計(jì)0分、1分、2分、3分;兩項(xiàng)評(píng)分相乘,評(píng)分≥4分為SALL4陽性,評(píng)分<4分為SALL4陰性[5]。(2)Western Blot檢測(cè)。剪碎適量乳腺癌組織及癌旁組織,加相應(yīng)裂解液。離心后留取上清。用25.0 mg/ml蛋白標(biāo)準(zhǔn)品稀釋至0.5 mg/ml。蛋白標(biāo)準(zhǔn)品按0、1、2、4、8、12、16、20 μl加入96孔板中,不足20 μl的孔加蛋白裂解液補(bǔ)至20 μl。其他孔加2 μl待測(cè)樣品并補(bǔ)至20 μl。加BCA工作液200 μl,37℃下孵育0.5 h。用酶標(biāo)儀測(cè)562 nm處光密度值,繪制濃度曲線。按體積的1/4加5×loading buffer。凝膠電泳,用PVDF膜進(jìn)行蛋白轉(zhuǎn)膜,脫脂封閉1 h,1×TBST洗膜3次,孵育一抗,搖床30 min,4℃下過夜。用1×TBST洗膜3次,加相應(yīng)二抗,孵育2 h。洗膜,顯色,采用ImageJ軟件進(jìn)行灰度分析[6]。(3)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction,PCR)檢測(cè)。SALL4引物序列:上游5′-CCGCACTGAGATGGAAGGT-3′,下游5′-GCTGGGCTGCTAACAAAGG-3′。GAPDH引物序列:上游5′-GAAGGTCGGAGTCAACGGAT-3′,下游5′-CCTGGAAGATGGTGATGGGAT-3′。提取乳腺癌及癌旁組織的RNA,反轉(zhuǎn)錄得到cDNA。Oligo(dT)15 1.0 μl、random 1.0 μl加ddH2O至12.5 μl加樣,70℃反應(yīng)5 min,冷卻。離心收集反應(yīng)液,加入dNTP(2.5 mM each)2.0 μl、5×Buffer 4.0 μl、RNasin 0.5 μl、M-MLV 1.0 μl。25℃反應(yīng)10 min、42℃反應(yīng)50 min、80℃反應(yīng)10 min,終止反應(yīng)。實(shí)時(shí)熒光定量反應(yīng)體系包括SYBR GREEN mastermix 10.0 μl、上游與下游引物序列(10μM)各0.5 μl、cDNA 1.0 μl,ddH2O補(bǔ)足至20.0 μl。反應(yīng)過程包括預(yù)變性(94℃ 5 min)、PCR(94℃ 10 s、60℃ 20 s、72℃ 30 s,40個(gè)循環(huán))及溶解(72℃ 150 s、40℃ 90 s,60℃～94℃每秒1℃,25℃ 1 min)[7]。

1.2.2 SALL4對(duì)阿霉素耐藥性檢測(cè) MCF-7和MCF-7/ADR細(xì)胞用浴鍋溶解,含10%胎牛血清DMEM培養(yǎng)基重懸,離心,棄上清,重懸后接種,37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h,PBS清洗,加新鮮培養(yǎng)基2.5 ml。細(xì)胞傳代,顯微鏡下計(jì)數(shù)。培養(yǎng)細(xì)胞至密度為90%,清洗后加入完全培養(yǎng)基終止反應(yīng)。吹打細(xì)胞,收集混合液并離心,去上清后加入1 ml完全培養(yǎng)基。在MCF-7/ADR細(xì)胞中沉默SALL4構(gòu)建shSALL4-MCF-7/ADR細(xì)胞。將細(xì)胞接種于6孔板中,培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h。培養(yǎng)24 h后篩選細(xì)胞,傳代并獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞株,培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。將MCF-7、MCF-7/ADR、shSALL4-MCF-7/ADR細(xì)胞以3×103個(gè)/孔接種于96孔培養(yǎng)板,37℃、5%CO2下培養(yǎng)。細(xì)胞貼壁后用含不同濃度梯度(0、0.5、1.0、10.0 μM)的阿奇霉素處理3種細(xì)胞,MTT法檢測(cè)24、48 h后的細(xì)胞增殖活性。檢測(cè)時(shí)加5 mg/ml的MTT,孵育4 h。棄上清并加200 μl的二甲基亞砜,酶標(biāo)儀測(cè)定490 nm處光密度值,計(jì)算IC50。

1.2.3 SALL4表達(dá)影響阿霉素耐藥通路分析 采用Western Blot檢測(cè)SALL4對(duì)MCF-7、MCF-7/ADR、shSALL4-MCF-7/ADR細(xì)胞PTEN、p-AKT、AKT、p-mTOR、mTOR表達(dá)的影響,以GAPDH作為內(nèi)參,檢測(cè)蛋白相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 乳腺癌及癌旁組織中SALL4表達(dá)水平比較 SALL4主要定位于細(xì)胞質(zhì),少量定位于細(xì)胞核,陽性呈棕黃色顆粒。90例患者中,SALL4表達(dá)陽性34例,陽性表達(dá)率為37.78%(34/90)。乳腺癌組織中SALL4蛋白相對(duì)表達(dá)水平和SALL4 mRNA相對(duì)表達(dá)水平均高于癌旁組織[(1.12±0.17)比(0.93±0.08);(0.063±0.009)比(0.049±0.006)],差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.2 不同病理特征乳腺癌患者SALL4表達(dá)陽性率比較 不同年齡、病理類型、組織學(xué)分級(jí)、腫瘤大小及ER、PR、HER-2、Ki67表達(dá)患者的SALL4表達(dá)陽性率比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者的SALL4表達(dá)陽性率高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

表1 不同病理特征乳腺癌患者SALL4表達(dá)陽性率比較/例(百分率/%)

2.3 SALL4對(duì)乳腺癌細(xì)胞阿霉素耐藥性影響 阿霉素處理24、48 h后的MCF-7/ADR細(xì)胞的IC50均高于MCF-7細(xì)胞[(135.17±28.08)μM比(1.46±0.14)μM;(31.94±4.09)μM比(0.17±0.04)μM],差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),細(xì)胞增殖活性逐漸提高。在MCF-7/ADR細(xì)胞中沉默SALL4 24、48 h后的shSALL4-MCF-7/ADR細(xì)胞的IC50較MCF-7/ADR細(xì)胞降低[(45.86±5.59)μM比(135.17±28.08)μM;(5.77±0.36)μM比(31.94±4.09)μM],差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),即沉默SALL4后MCF-7/ADR細(xì)胞對(duì)阿霉素敏感性增強(qiáng)。

2.4 SALL4對(duì)PTEN/AKT/mTOR通路影響 MCF-7/ADR細(xì)胞的PTEN蛋白表達(dá)低于MCF-7細(xì)胞,p-AKT和p-mTOR蛋白表達(dá)高于MCF-7細(xì)胞,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。沉默SALL4后,shSALL4-MCF-7/ADR細(xì)胞的PTEN蛋白表達(dá)升高,高于MCF-7/ADR細(xì)胞,p-AKT和p-mTOR蛋白表達(dá)下降,低于MCF-7/ADR細(xì)胞,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

表2 SALL4對(duì)PTEN、p-AKT、AKT、p-mTOR、mTOR蛋白表達(dá)影響

3 討論

近年研究發(fā)現(xiàn),SALL4表達(dá)與腫瘤的遷移、侵襲等有關(guān)[8]。本研究結(jié)果顯示:90例患者中,SALL4表達(dá)陽性34例,陽性表達(dá)率為37.78%(34/90);不同年齡、病理類型、組織學(xué)分級(jí)、腫瘤大小及雌激素受體、孕激素受體、人表皮生長(zhǎng)因子受體、Ki67表達(dá)患者的SALL4表達(dá)陽性率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者的SALL4表達(dá)陽性率高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者(P<0.05)。淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是乳腺癌細(xì)胞侵襲、轉(zhuǎn)移能力及預(yù)后的影響因素,考慮與SALL4影響鈣粘素表達(dá)有關(guān)[9-10]。目前,SALL4表達(dá)與乳腺癌病理特征的關(guān)系仍然存在爭(zhēng)議。有研究發(fā)現(xiàn),SALL4在乳腺癌及癌旁組織中均有表達(dá),且在乳腺癌組織中的表達(dá)高低不等[11-12]。還有研究報(bào)道,SALL4在乳腺癌早期就已高表達(dá),且與病理特征無明顯關(guān)系[13]。乳腺癌SALL4表達(dá)與病理特征之間的關(guān)系有待大樣本量研究進(jìn)行驗(yàn)證。

有研究發(fā)現(xiàn),SALL4表達(dá)與腫瘤的耐藥性有關(guān),RNA干擾沉默SALL4后可促進(jìn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡,抑制細(xì)胞侵襲,增加細(xì)胞對(duì)替莫唑胺的化學(xué)敏感性[14-15]。也有研究表明,SALL4表達(dá)會(huì)影響乳腺癌細(xì)胞的耐藥性[16-17]。阿霉素是乳腺癌常用的蒽環(huán)類化療藥物,通過擴(kuò)散進(jìn)入腫瘤細(xì)胞胞質(zhì)并與蛋白酶體結(jié)合轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核中解離并釋放,直接作用于癌細(xì)胞DNA,從而阻礙其核酸合成,并干擾DNA復(fù)制、轉(zhuǎn)錄等過程,誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。單獨(dú)用阿霉素或阿霉素聯(lián)合其他抗腫瘤藥是有效控制乳腺癌進(jìn)展的關(guān)鍵,但部分患者對(duì)阿霉素的反應(yīng)性低或在阿霉素化療一段時(shí)間后效果變差[18-19]。積極尋找與耐藥性相關(guān)的分子或基因、揭示乳腺癌的耐藥機(jī)制是強(qiáng)化乳腺癌化療效果的重要前提。本研究使用人乳腺癌細(xì)胞系MCF-7及其阿霉素耐藥細(xì)胞系MCF-7/ADR,并構(gòu)建了沉默SALL4的shSALL4-MCF-7/ADR細(xì)胞系,在上述3種細(xì)胞系中進(jìn)行阿霉素處理,結(jié)果顯示:阿霉素處理24、48 h后的MCF-7/ADR細(xì)胞的IC50均高于MCF-7細(xì)胞,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);在MCF-7/ADR細(xì)胞中沉默SALL4 24、48 h后的shSALL4-MCF-7/ADR細(xì)胞的IC50均較MCF-7/ADR細(xì)胞降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。這提示,SALL4的表達(dá)會(huì)促進(jìn)阿霉素耐藥,沉默SALL4可提高M(jìn)CF-7/ADR細(xì)胞對(duì)阿霉素的敏感性,促進(jìn)細(xì)胞耐藥性下降,使細(xì)胞增殖受到抑制,即SALL4與MCF-7細(xì)胞的耐藥性相關(guān)[20-21]。

為了驗(yàn)證SALL4表達(dá)對(duì)阿霉素耐藥性的影響是否與PTEN/AKT/mTOR通路有關(guān),本研究采用Western Blot法對(duì)MCF-7、MCF-7/ADR、shSALL4-MCF-7/ADR細(xì)胞的PTEN、p-AKT、AKT、p-mTOR、mTOR蛋白表達(dá)進(jìn)行檢測(cè),結(jié)果顯示:MCF-7/ADR細(xì)胞的PTEN蛋白表達(dá)低于MCF-7細(xì)胞,p-AKT和p-mTOR蛋白表達(dá)高于MCF-7細(xì)胞,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);沉默SALL4后,shSALL4-MCF-7/ADR細(xì)胞的PTEN蛋白表達(dá)升高,高于MCF-7/ADR細(xì)胞,p-AKT和p-mTOR蛋白表達(dá)下降,低于MCF-7/ADR細(xì)胞,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。這提示,SALL4表達(dá)會(huì)影響PTEN/AKT/mTOR通路基因的表達(dá)。在PTEN/AKT/mTOR通路中,PTEN是起始基因,通過調(diào)節(jié)AKT/mTOR去磷酸化而影響該信號(hào)通路[16]。沉默SALL4會(huì)上調(diào)PTEN表達(dá),抑制AKT/mTOR去磷酸化,使p-AKT、p-mTOR表達(dá)下調(diào),抑制該信號(hào)通路,從而減弱乳腺癌細(xì)胞對(duì)阿霉素的耐藥性,增強(qiáng)對(duì)阿霉素的敏感性[22-23]。有研究報(bào)道,加入去甲基化藥物可上調(diào)PTEN表達(dá),增加成人急性淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞對(duì)伊馬替尼的敏感性,而使用AKT或mTOR抑制劑也可提高化療藥物的敏感性。上述研究均證實(shí),PTEN/AKT/mTOR通路與化療藥物的耐藥性有關(guān)[24-25]。

綜上所述,SALL4在乳腺癌組織中的表達(dá)高于癌旁組織,且與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移明顯相關(guān)。沉默SALL4可抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖活性,降低阿霉素的耐藥性,且SALL4對(duì)乳腺癌細(xì)胞阿霉素耐藥性的影響與PTEN/AKT/mTOR通路有關(guān)。