王 坤, 趙瑞杰, 張 茜, 李利峰, 趙 楊, 李喜朋

1.邢臺(tái)市第三醫(yī)院 神經(jīng)內(nèi)一科,河北 邢臺(tái) 054000;2.邢臺(tái)市人民醫(yī)院 神經(jīng)內(nèi)二科,河北 邢臺(tái) 054000

急性腦缺血在一定時(shí)間恢復(fù)血液供應(yīng)后,其功能不但未能恢復(fù),反而出現(xiàn)更加嚴(yán)重的腦機(jī)能障礙,這一現(xiàn)象稱(chēng)為急性腦缺血/再灌注損傷(cerebral ischemia/reperfusion injury,CI/RI)[1]。近年來(lái),有研究報(bào)道,在急性CI/RI的發(fā)展過(guò)程中,腦組織中的炎性細(xì)胞因子釋放明顯增加,這些炎性因子能夠觸發(fā)一系列病理性級(jí)聯(lián)反應(yīng),這些級(jí)聯(lián)反應(yīng)將直接或間接地導(dǎo)致細(xì)胞凋亡、血腦屏障破壞、腦水腫和出血性轉(zhuǎn)化[2-5]。因此,抑制急性CI/RI發(fā)展過(guò)程中的炎癥反應(yīng)可能是一種有效的預(yù)防和治療策略。菊科植物紅花是一種傳統(tǒng)中藥材,該植物的干燥花朵被認(rèn)為是一種良好的活血化瘀藥。Xue等[6]研究發(fā)現(xiàn),羥基紅花黃色素A(hydroxysaffloryellow A,HSYA)是紅花的主要成分,對(duì)心腦血管病具有顯著療效。然而,HSYA對(duì)于急性CI/RI作用機(jī)制的相關(guān)報(bào)道較少見(jiàn)。本研究通過(guò)建立大腦中動(dòng)脈閉塞/再灌注(middle cerebral artery occlusion and reperfusion,MCAO/R)損傷大鼠模型,探討HSYA對(duì)于急性CI/RI的作用機(jī)制,以期為CI/RI的預(yù)防提供新思路?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)材料 SPF級(jí)雄性SD大鼠50只,體質(zhì)量240～280 g,由江蘇邳州市東方養(yǎng)殖有限公司提供(SCXK 蘇2022-0016)。

1.1.2 試劑 HSYA購(gòu)于美國(guó)sigma公司(純度>99.8%);戊巴比妥鈉購(gòu)于武漢漢恒生物公司;4%多聚甲醛購(gòu)于北京索萊寶生物科技有限公司;NeuN抗體購(gòu)于美國(guó)Santa cruz公司;蘇木精-伊紅染色試劑盒購(gòu)于上海碧云天生物科技有限公司;酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)試劑盒購(gòu)于北京索萊寶生物科技有限公司;脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的缺口末端標(biāo)記法(terminal-deoxynucleotidyl transferase mediated nick end labeling,TUNEL)試劑盒購(gòu)于杭州酶聯(lián)生物科技有限公司;NF-κB p65和GAPDH抗體購(gòu)于美國(guó)賽默飛公司。

1.2.3 主要儀器 多功能酶標(biāo)儀購(gòu)于南京貝登電子商務(wù)有限公司;熒光顯微鏡購(gòu)于德國(guó)Lavision Biotec公司;超低溫冰箱購(gòu)于美國(guó)賽默飛公司;低溫離心機(jī)購(gòu)于德國(guó)Eppendorf公司;電子天平購(gòu)于上海拓西電子科技有限公司。

1.2 研究方法

1.2.1 動(dòng)物分組及模型建立 所有大鼠的飼養(yǎng)條件如下:溫度控制在21℃～23℃,55%適度恒定,12 h光照和12 h黑暗周期,自由獲取食物和水。將大鼠隨機(jī)分為5組:假手術(shù)組、模型組,以及HSYA低、中、高劑量組,每組各10只。參照參考文獻(xiàn)[7]建立大鼠MCAO/R模型。首先使用0.3%戊巴比妥鈉麻醉大鼠后,用鉗分離左側(cè)頸總動(dòng)脈,將6-0尼龍絲從左側(cè)頸總動(dòng)脈切口插入大腦中動(dòng)脈以阻斷血液。阻斷2 h后,拔除纖絲進(jìn)行再灌注。當(dāng)大鼠出現(xiàn)提尾時(shí)左前肢不能伸直、行走時(shí)向左側(cè)旋轉(zhuǎn)或傾倒時(shí),可判斷MCAO/R模型構(gòu)建成功。

手術(shù)前30 min內(nèi),HSYA低、中、高劑量組的大鼠通過(guò)尾靜脈分別注射10、20、30 mg/kg的HSYA,假手術(shù)組和模型組的大鼠均注射等量生理鹽水。模型組和HSYA低、中、高劑量組均按上述方法建立MCAO/R模型,假手術(shù)組的大鼠僅在頸部剪口并縫合,但未發(fā)生MCAO/R。術(shù)后24 h,使用戊巴比妥鈉將所有大鼠麻醉致死,取腦組織進(jìn)行后續(xù)研究。所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均經(jīng)本院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)通過(guò)。

1.2.2 氯化三苯基四氮唑染色 造模成功24 h后,深麻醉下斷頭,提取除小腦、嗅球和下腦干外的腦組織,轉(zhuǎn)入PBS溶液中清洗,然后在-20℃冷凍20 min,切取組織塊,獲得2 mm冠狀腦片。將切片顯露于2%氯化三苯基四氮唑(triphenyltetrazolium chloride,TTC)溶液中,37℃避光水浴30 min。每隔5 min搖晃1次,以確保染色均勻。隨后,將染色的組織樣本用4%多聚甲醛固定過(guò)夜,第22天干燥用于攝影。運(yùn)行Image-ProPlus 6.0軟件獲得尾部梗死面積(白色),根據(jù)層厚計(jì)算梗死體積。

1.2.3 蘇木精-伊紅染色 將完整腦組織分離、固定、洗滌、脫水后進(jìn)行透明處理并通過(guò)石蠟包埋。獲得后視交叉的冠狀切面(5 μm)。然后,切片經(jīng)二甲苯和乙醇脫蠟至水,再用蘇木精-伊紅染色。制備組織切片,顯微鏡下觀察皮質(zhì)神經(jīng)元形態(tài)。

1.2.4 神經(jīng)元凋亡率檢測(cè) 通過(guò)TUNEL和NeuN免疫熒光雙染檢測(cè)大鼠腦海馬區(qū)的神經(jīng)元凋亡情況。采用細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒和抗NeuN單克隆抗體進(jìn)行免疫熒光雙標(biāo)記。在TUNEL標(biāo)記前,將4 μm厚的腦切片與抗NeuN一級(jí)抗體(1:200稀釋度)在4℃孵育過(guò)夜,隨后在室溫下與免疫熒光標(biāo)記的二級(jí)抗體孵育1 h。對(duì)于TUNEL標(biāo)記,切片與含有末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶和熒光素標(biāo)記的脫氧尿苷三磷酸的反應(yīng)混合物在37℃孵育2 h。室溫下Hoechst染色5 min。采用全自動(dòng)熒光顯微鏡拍攝染色結(jié)果。

1.2.5 酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn) 用包被緩沖液將大鼠腦組織勻漿液稀釋至1～10 μg/ml,每孔加0.1 ml,4℃過(guò)夜。次日洗滌3次。加一定稀釋的待檢樣品0.1 ml于上述已包被的反應(yīng)孔中,置37℃孵育1 h,洗滌。于反應(yīng)孔中,加入新鮮稀釋的酶標(biāo)第二抗體0.1 ml,37℃孵育30～60 min,洗滌,最后一遍用磷酸鹽緩沖液洗滌。應(yīng)用多功能酶標(biāo)儀檢測(cè)吸光度。

1.2.6 蛋白免疫印跡實(shí)驗(yàn) 收集1.2.5實(shí)驗(yàn)中勻漿后的腦組織樣本,使用蛋白裂解液獲取總蛋白后,通過(guò)考馬斯亮藍(lán)法對(duì)各組蛋白樣本定量。使用SDS-PAGE凝膠電泳法分離目的蛋白,電泳結(jié)束后將目的蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上,然后在5%脫脂牛奶封閉,分別與一級(jí)抗體和二級(jí)抗體孵育、洗膜、顯影,將獲得的蛋白條帶進(jìn)行標(biāo)記,應(yīng)用Image Lab軟件測(cè)定蛋白條件灰度值,并計(jì)算NF-κB p65蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

1.2.7 實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng) 收集1.2.5實(shí)驗(yàn)中勻漿后的腦組織樣本,按照說(shuō)明書(shū)在勻漿液中添加500 μl RNA提取裂解液,用于提取總RNA。利用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將每個(gè)樣本的RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。以GAPDH為內(nèi)參,使用SYBR Green對(duì)目的基因的表達(dá)量進(jìn)行定量,所使用的引物序列見(jiàn)表1。

表1 引物序列

2 結(jié)果

2.1 HSYA對(duì)MCAO/R大鼠腦梗死體積的影響 TTC染色結(jié)果顯示,與假手術(shù)組大鼠比較,模型組大鼠腦梗死面積顯著增加,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);與模型組大鼠比較,HSYA低、中、高劑量組大鼠腦梗死面積顯著減少,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)圖1。

圖1 HSYA對(duì)MCAO/R大鼠腦梗死體積的影響

2.2 HSYA對(duì)MCAO/R大鼠腦組織結(jié)構(gòu)的影響 蘇木精-伊紅染色結(jié)果顯示,假手術(shù)組大鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞排列整齊緊密,細(xì)胞核大而圓,細(xì)胞結(jié)構(gòu)清晰。與假手術(shù)比較,模型組大鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞排列紊亂,體積減小,細(xì)胞核形狀不規(guī)則,部分細(xì)胞核皺縮,呈三角形;與模型組比較,隨著劑量遞增,HSYA低、中、高劑量組大鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞的損傷程度逐漸恢復(fù)正常,細(xì)胞排列較為整齊,細(xì)胞核逐步增大變圓。見(jiàn)圖2。

圖2 HSYA對(duì)MCAO/R大鼠腦組織結(jié)構(gòu)的影響

2.3 HSYA對(duì)MCAO/R大鼠腦組織神經(jīng)元凋亡的影響 TUNEL和NeuN熒光染色結(jié)果顯示,與假手術(shù)比較,模型組大鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞凋亡率明顯增加,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);與模型組比較,HSYA低、中、高劑量組的大鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞凋亡率明顯降低,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)圖3。

圖3 HSYA對(duì)MCAO/R大鼠腦組織神經(jīng)元凋亡的影響

2.4 HSYA對(duì)MCAO/R大鼠腦組織炎性因子水平的影響 ELISA與實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction,PCR)檢測(cè)結(jié)果顯示,與假手術(shù)組比較,模型組大鼠腦組織中炎性因子水平顯著增加,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);與模型組比較,HSYA組大鼠腦組織中炎性因子水平顯著降低(P<0.05)。見(jiàn)圖4。

圖4 HSYA對(duì)MCAO/R大鼠腦組織炎性因子水平的影響

2.5 HSYA對(duì)MCAO/R大鼠腦組織中NF-κB p65表達(dá)水平的影響 蛋白免疫印跡結(jié)果顯示,與假手術(shù)組比較,模型組大鼠腦組織中NF-κB p65表達(dá)水平顯著增加,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);與模型組比較,HSYA低、中、高劑量組大鼠腦組織中NF-κB p65表達(dá)水平顯著降低,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)圖5。

圖5 HSYA對(duì)MCAO/R大鼠腦組織中NF-κB p65表達(dá)水平的影響

3 討論

近年來(lái),MCAO/R動(dòng)物模型通常用于模擬大腦中動(dòng)脈閉塞發(fā)病后的病理狀況,已被廣泛用于各類(lèi)新藥的開(kāi)發(fā)研究中[8-10]。本研究建立了大鼠MCAO/R模型,以探討HSYA對(duì)CI/RI的影響。有研究報(bào)道,局灶性CI/RI通常會(huì)引起缺血皮質(zhì)神經(jīng)元的形態(tài)學(xué)改變和功能障礙,24 h后導(dǎo)致最嚴(yán)重的腦梗死,大腦中動(dòng)脈的供血區(qū)域有明顯的梗死灶[11-12]。本研究建立MCAO/R大鼠模型后,與假手術(shù)組大鼠比較,模型組腦梗死面積顯著增加,海馬區(qū)域神經(jīng)細(xì)胞排列紊亂、核仁消失、部分核質(zhì)皺縮,炎性因子水平顯著增加,這提示本研究的MCAO/R大鼠模型建立成功。

有研究報(bào)道,HSYA具有較好的抗炎、抗氧化作用,對(duì)于心腦血管病具有顯著療效[13]。如Zhang等[14]研究報(bào)道,HSYA是一種潛在的神經(jīng)系統(tǒng)保護(hù)劑,可抑制大鼠脊髓損傷過(guò)程中的氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)和細(xì)胞凋亡的發(fā)展。此外,HSYA還是一種治療動(dòng)脈粥樣硬化的天然產(chǎn)物,其可抑制泡沫細(xì)胞形成,改善血管內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙,抑制血管平滑肌細(xì)胞增殖和遷移[15-16]。在本研究中,通過(guò)向MCAO/R大鼠注射HSYA后,MCAO/R大鼠腦梗死面積顯著減少,神經(jīng)細(xì)胞的損傷程度和凋亡率降低,腦組織中炎性因子水平顯著降低。這提示,HSYA能夠降低MCAO/R大鼠腦組織中炎性因子水平,緩解大鼠CI/RI。NF-κB p65是NF-κB家族成員之一,NF-κB是一種多效性轉(zhuǎn)錄因子,且炎癥反應(yīng)與NF-κB p65的異常激活密切相關(guān)[16]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),在MCAO/R大鼠腦組織中,NF-κB p65顯著增加,然而,HSYA低、中、高劑量組中,隨著劑量增加,NF-κB p65表達(dá)逐漸降低。因此,HSYA的抗炎作用可能與抑制NF-κB p65表達(dá)相關(guān)。

綜上所述,HSYA能夠降低MCAO/R大鼠腦組織中炎性因子水平,緩解大鼠腦缺血/再灌注導(dǎo)致的神經(jīng)細(xì)胞損傷,且這一作用可能與抑制NF-κB p65表達(dá)相關(guān)。HSYA可能是預(yù)防CI/RI的有效藥物。