唐瑋 李建棣 陳易 黃素寧

乳腺癌是全球女性發(fā)病率最高的癌癥，且其發(fā)病率和死亡率逐年升高[1]。近年來，我國乳腺癌的發(fā)病率和死亡率雖然低于全球平均水平，但自身對(duì)比，也呈逐年攀升的趨勢(shì)，2022 年乳腺癌新發(fā)病例將近43萬[2]。雖然我國乳腺癌患者總體的5 年生存率已達(dá)80%，但三陰性乳腺癌（triple-negative breast cancer，TNBC）是具有強(qiáng)侵襲性的乳腺癌亞型，不能從內(nèi)分泌治療和靶向治療中獲益，故這類患者預(yù)后較差。TNBC是指乳腺癌中雌激素受體（estrogen receptor，ER）、孕激素受體（progesterone receptor，PR）和人表皮生長因子受體2（human epidermal growth factor receptor 2，Her-2）均為陰性的亞群。TNBC 占乳腺癌群體的15%～20%。目前發(fā)現(xiàn)TNBC 乳腺癌易感基因1/2（breast cancer susceptibility gene 1/2，BRCA1/2）基因的胚系突變高頻率為TNBC 最具代表性的分子病理事件[3]。但TNBC 在分子病理機(jī)制上的研究仍有諸多未明之處，故積極探究TNBC 的分子機(jī)制，尋找判斷和治療TNBC 的新靶點(diǎn)是當(dāng)前急需突破的工作重點(diǎn)。己糖激酶3（hexokinase-3，HK3），也稱HXK3 或者HKⅢ，其基因編號(hào)為3101，具有21 個(gè)外顯子，位于5q35.2。HK3 可促進(jìn)結(jié)腸癌和乳頭狀腎細(xì)胞癌等惡性腫瘤的生長[4-5]。目前HK3 與乳腺癌關(guān)系的研究僅見一篇報(bào)道，其發(fā)現(xiàn)在乳腺癌中HK3 與單羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)體4（monocarboxylate transporter 4，MCT4）的表達(dá)有關(guān)，可能共同調(diào)節(jié)乳腺癌的腫瘤免疫微環(huán)境[6]。但HK3 在乳腺癌，特別是TNBC 中的臨床意義及潛在機(jī)制未見報(bào)道。故本研究基于循證理念收集了符合納入標(biāo)準(zhǔn)的TNBC 患者，進(jìn)行HK3 臨床價(jià)值及其分子機(jī)制的初步探討，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料和方法

1.1 HK3 在乳腺癌及TNBC 組織中的表達(dá) 乳腺癌基因芯片、RNA-seq 數(shù)據(jù)集下載自基因表達(dá)綜合（gene expression omnibus，GEO）、癌癥基因組圖譜（the cancer genome atlas，TCGA）、序列讀長檔案（sequence read archive，SRA）、陣列表達(dá)（ArrayExpress）及國際乳腺癌協(xié)會(huì)的分子分類（molecular taxonomy of Breast Cancer International Consortium, METABRIC）數(shù)據(jù)庫。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）人原發(fā)性乳腺癌組織；（2）同一平臺(tái)矩陣內(nèi)乳腺癌、正常乳腺組織樣本數(shù)各≥3（或TNBC、非TNBC組織樣本數(shù)各≥3）。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）轉(zhuǎn)移性乳腺癌；（2）復(fù)發(fā)性乳腺癌；（3）乳腺癌細(xì)胞系；（4）乳腺癌動(dòng)物模型；（5）治療后乳腺癌患者；（6）重復(fù)樣本及數(shù)據(jù)集；（7）缺乏HK3 表達(dá)值。下載基因型組織表達(dá)的正常乳腺組織測(cè)序數(shù)據(jù)并將其與TCGA-BRCA 數(shù)據(jù)集合并，擴(kuò)大對(duì)照組樣本量。合并平臺(tái)相同的表達(dá)矩陣，利用limma-voom、sva 移除批次效應(yīng)。計(jì)算正常乳腺組織及乳腺癌組織HK3 表達(dá)例數(shù)、均值、標(biāo)準(zhǔn)差，在隨機(jī)效應(yīng)模型下繪制SMD森林圖。計(jì)算真陽性率、假陽性率、假陰性率、真陰性率，繪制匯總受試者操作特征（summary receiver operating characteristic，SROC）曲線及靈敏度、特異度森林圖。

1.2 HK3 在乳腺癌中的預(yù)后意義 在GEO、TCGA、SRA、ArrayExpress 及METABRIC 數(shù)據(jù)庫搜集乳腺癌預(yù)后數(shù)據(jù)集，涵蓋總生存期（overall survival，OS）、無復(fù)發(fā)生存期（relapse free survival，RFS）和無進(jìn)展生存期（post progression-free survival，PPS）等預(yù)后數(shù)據(jù)。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）乳腺癌轉(zhuǎn)錄組表達(dá)數(shù)據(jù)包含HK3 表達(dá)值；（2）預(yù)后隨訪數(shù)據(jù)完整（隨訪時(shí)間、生存狀態(tài)）。以HK3 的中位表達(dá)值為界將TNBC 患者劃分為HK3 低表達(dá)組和HK3 高表達(dá)組，繪制Kaplan-Meier 曲線，并執(zhí)行Cox 回歸分析，計(jì)算HR值。最后，對(duì)各預(yù)后數(shù)據(jù)集HR值進(jìn)行合并，展示HK3 在全體乳腺癌及TNBC 中的預(yù)后價(jià)值。

1.3 乳腺癌及TNBC 組織中的差異基因表達(dá)分析 在去除批次效應(yīng)后的矩陣中批量鑒定乳腺癌高表達(dá)基因（乳腺癌組織比正常乳腺組織、TNBC 組織比正常乳腺組織、TNBC 組織比非TNBC 組織），標(biāo)準(zhǔn)如下：SMD＞0，P＜0.05。

1.4 TBNC 中HK3 共表達(dá)基因分析 在批次后的矩陣中提取807 例TNBC 患者的表達(dá)矩陣，批量鑒定HK3共表達(dá)基因，標(biāo)準(zhǔn)如下：Pearson 相關(guān)r≥0.30，P＜0.05。

1.5 HK3 相關(guān)通路富集分析 篩選至少在4 個(gè)數(shù)據(jù)集中與HK3 正相關(guān)的共表達(dá)基因，將其與乳腺癌高表達(dá)基因（乳腺癌組織比正常乳腺組織、TNBC 組織比正常乳腺組織、TNBC 組織比非TNBC 組織）交集，進(jìn)行基因本體論（gene ontology，GO）、京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）及Reactome 富集分析。

1.6 乳腺癌組織中HK3 表達(dá)與免疫浸潤分析 通過腫瘤免疫浸潤網(wǎng)站工具（tumor immune estimation resource，TIMER）（https://cistrome.shinyapps.io/timer/），分析乳腺癌組織中HK3 的表達(dá)水平與免疫浸潤程度之間的關(guān)系。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用R 4.2 統(tǒng)計(jì)軟件。全球范圍內(nèi)乳腺組織間（正常乳腺組織比TNBC 組織、TNBC 組織比非TNBC 組織）的HK3 表達(dá)差異采用Wilcoxon 符號(hào)秩和檢驗(yàn)。若這兩個(gè)結(jié)果I2＞50%和P＜0.05，則選用隨機(jī)效應(yīng)模型計(jì)算SMD。反之，選用固定效應(yīng)模型。繪制SROC 曲線評(píng)估利用HK3 的表達(dá)差異鑒別TNBC組織的能力。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HK3 在TNBC 組織中顯著高表達(dá) 在全球范圍內(nèi)收集的乳腺組織數(shù)據(jù)中，無論是611 例TNBC 組織與711 例正常乳腺組織的HK3 表達(dá)水平相比（圖1A），還是807 例TNBC 組織與4 010 例非TNBC 組織的HK3 表達(dá)水平相比（圖1B），TNBC 組織中的HK3 均顯著高表達(dá)。SROC 曲線提示HK3 的表達(dá)水平在正常乳腺組織比TNBC 組織（AUC=0.77，95%CI：0.73～0.81）和TNBC組織比非TNBC 組織（AUC=0.75，95%CI：0.71～0.79）中有較強(qiáng)的鑒別能力，見圖2A 和圖3A。而在靈敏度分析中，靈敏度分別達(dá)0.81（95%CI：0.54～0.94）和0.79（95%CI：0.62～0.89），見圖2B和圖3B。在特異度分析中，特異度分別達(dá)0.61（95%CI：0.34～0.82）和0.58（95%CI：0.39～0.75），見圖2C 和圖3C。這進(jìn)一步證實(shí)HK3 表達(dá)水平具有較強(qiáng)鑒別TNBC 組織的能力。

圖1 HK3 在全球TNBC 組織的SMD 森林圖（A：HK3 在全球TNBC 組織的SMD 森林圖，以正常乳腺組織作對(duì)照；B：HK3 在全球TNBC 組織的SMD 森林圖，以非TNBC 組織作對(duì)照）

圖2 HK3在全球TNBC 組織的SROC 曲線圖、靈敏度及特異度的森林圖（A：SROC 曲線圖；B：靈敏度的森林圖；C：特異度的森林圖）

圖3 HK3 在全球TNBC 組織的SROC 曲線圖、靈敏度及特異度森林圖（A：SROC 曲線圖；B：靈敏度的森林圖；C：特異度的森林圖）

2.2 HK3 表達(dá)水平與乳腺癌患者預(yù)后的關(guān)系 HK3表達(dá)水平對(duì)乳腺癌患者的RFS 有顯著影響（HR=1.76，95%CI：1.22～2.54，P＜0.01），見圖4。進(jìn)一步評(píng)估HK3的表達(dá)水平發(fā)現(xiàn)，TNBC 組織中HK3 高表達(dá)組較HK3低表達(dá)組有更長的OS（HR=0.634，95%CI：0.43～0.94，P＜0.05）和PPS（HR=0.55，95%CI：0.31～0.97，P＜0.05），見圖5。這提示HK3高表達(dá)的TNBC患者預(yù)后相對(duì)較好。

圖4 全球乳腺癌患者的預(yù)后隊(duì)列的RFS 的HR 整合分析森林圖

圖5 全球TNBC 患者預(yù)后隊(duì)列Kaplan-Meier 整合分析的生存曲線圖（A：HK3 高表達(dá)組和低表達(dá)組OS 比較的Kaplan-Meier曲線；B：HK3 高表達(dá)組和低表達(dá)組PPS 比較的Kaplan-Meier曲線）

2.3 HK3 差異、共表達(dá)分析及相關(guān)分子機(jī)制探索 通過篩選獲得了與HK3 通路密切相關(guān)的165 個(gè)交集基因，見圖6（插頁）。GO 分析顯示，交集基因顯著富集于生物學(xué)過程的免疫系統(tǒng)過程的負(fù)調(diào)控等、細(xì)胞組分的分泌顆粒膜等和分子功能的免疫受體活性等與免疫系統(tǒng)調(diào)控相關(guān)的通路，見圖7A（插頁）。KEGG 分析顯示，交集基因顯著富集于NOD 樣受體信號(hào)通路、趨化因子信號(hào)通路、Epstein-Barr 病毒（Epstein-Barr virus，EBV）感染和新型冠狀病毒感染等與病毒感染和抗病毒免疫有關(guān)的通路，見圖7B（插頁）。交集基因的Reactome 富集主要集中在Toll 樣受體4 級(jí)聯(lián)、干擾素信號(hào)通路和淋巴細(xì)胞與非淋巴樣細(xì)胞之間的免疫調(diào)節(jié)相互作用等與免疫機(jī)制相關(guān)的通路，見圖7C（插頁）。

圖6 交集基因的韋恩圖

圖7 HK3 與TNBC 分子機(jī)制圖譜（A：GO 分析；B：KEGG 分析；C 交集基因Reactome，展示top 25 通路）

2.4 乳腺癌組織中HK3 表達(dá)與免疫細(xì)胞浸潤程度的關(guān)系 HK3 的表達(dá)水平與多種類型的乳腺癌組織的腫瘤純度均呈負(fù)相關(guān)（均P＜0.05），而與多種免疫細(xì)胞浸潤程度均呈正相關(guān)（均P＜0.05），見圖8。

圖8 4 種類型的乳腺癌組織中HK3 表達(dá)與腫瘤純度和免疫細(xì)胞浸潤程度的關(guān)系

3 討論

TNBC 的診療仍存在較大的困難，且預(yù)后不良，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量。由于TNBC 相關(guān)分子機(jī)制尚未研究透徹[7-9]，這致使目前尚未有針對(duì)TNBC 有效的治療方案。癌癥的發(fā)生涉及基因水平的改變[10]。HK3 已經(jīng)被證實(shí)在多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤、急性髓系白血病、肺癌和結(jié)直腸癌等多種腫瘤中起到重要作用[11-14]。但HK3 在TNBC 中的作用研究鮮有報(bào)道，因此，本研究探討了HK3在TNBC組織中的表達(dá)及臨床意義。

本研究發(fā)現(xiàn)利用HK3 表達(dá)水平可以有效地鑒別TNBC 組織與正常乳腺組織、TNBC 組織與其他類型乳腺癌組織。因此，筆者推測(cè)或許可以利用HK3 表達(dá)水平對(duì)TNBC 患者進(jìn)行診斷和乳腺癌患者進(jìn)行病理分型等。盡管TNBC 組織中HK3 相對(duì)于正常乳腺組織和其他類型乳腺癌組織是高表達(dá)的，但是在TNBC 中HK3高表達(dá)組患者預(yù)后較好。這可能與異常表達(dá)的HK3通過異常的糖酵解途徑參與腫瘤免疫逃逸有關(guān)[14]。這與先前報(bào)道的HK3 影響乳腺癌組織的糖酵解途徑和腫瘤免疫微環(huán)境有相似之處[6]。這還可能與HK3 高表達(dá)乳腺癌組織中的腫瘤純度較低，而免疫細(xì)胞浸潤程度較高，進(jìn)而增強(qiáng)局部抗腫瘤免疫有關(guān)。

先前的研究表明，HK3 在多種腫瘤的代謝重編程和抑制抗腫瘤免疫中起到重要作用[14-17]。這些研究結(jié)果與本研究富集分析中的免疫系統(tǒng)過程的負(fù)調(diào)控、免疫受體激活和Toll 樣受體4 級(jí)聯(lián)等類似。這表明HK3很有可能通過這些通路促進(jìn)TNBC 的發(fā)生與進(jìn)展。

有研究發(fā)現(xiàn)，HK3 的表達(dá)與免疫檢查點(diǎn)（immune checkpoint，IC）分子的表達(dá)呈正相關(guān)[14]。另有研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)HK3 在腫瘤細(xì)胞中高表達(dá)時(shí)，免疫細(xì)胞表面的IC 分子顯著增多[18]。這些研究均證實(shí)了HK3 可以通過IC 對(duì)抗腫瘤免疫進(jìn)行負(fù)調(diào)控。因此，目前針對(duì)TNBC 患者的免疫細(xì)胞IC 上調(diào)的現(xiàn)象，可以使用IC 抑制劑對(duì)TNBC 患者治療[19-20]。然而，由于耐藥性等原因，只有少數(shù)TNBC 患者可以從免疫治療中獲益[20]。還有研究發(fā)現(xiàn)，HK3 高表達(dá)時(shí)，腫瘤細(xì)胞的糖酵解活性增強(qiáng)，腫瘤細(xì)胞增加對(duì)葡萄糖等營養(yǎng)物質(zhì)的攝取和乳酸等有害物質(zhì)的排除，從而導(dǎo)致惡劣的代謝環(huán)境[18]。該環(huán)境可以通過抑制淋巴細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞毒性物質(zhì)和誘導(dǎo)調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞的分化并增強(qiáng)其功能等途徑進(jìn)而產(chǎn)生免疫排斥和免疫抑制腫瘤微環(huán)境[21-24]。這也是IC 抑制劑治療腫瘤失敗的主要原因之一[21，23-24]。然而，這些類型腫瘤細(xì)胞大量產(chǎn)生的乳酸的代謝檢查點(diǎn)也有望作為新的治療靶點(diǎn)，基于此，很有可能會(huì)改善一些TNBC患者對(duì)IC 抑制劑等免疫療法耐藥的情況[21，23]。此外，HK3 還可以通過刺激單核/巨噬細(xì)胞在腫瘤組織的浸潤進(jìn)而調(diào)節(jié)T 細(xì)胞表面的IC 相關(guān)分子的表達(dá)和促進(jìn)巨噬細(xì)胞的替代途徑激活等方式介導(dǎo)免疫抑制腫瘤微環(huán)境的形成[15，25]。然而，HK3 也可以不依賴于糖酵解功能，而是可能通過在全反式維甲酸誘導(dǎo)的中性粒細(xì)胞分化過程中，與BH3-only 蛋白直接作用，進(jìn)而促進(jìn)白血病細(xì)胞的存活和分化[12]。

富集分析顯示了許多病毒感染和抗病毒免疫相關(guān)的通路。有研究報(bào)道，HK3 在呼吸道病毒感染的機(jī)體中異常表達(dá)[26]。還有研究指出新型冠狀病毒感染可以感染TNBC 細(xì)胞，但是對(duì)TNBC 患者的具體臨床影響還尚未可知[27]。而EB 病毒已經(jīng)被明確在TNBC 的發(fā)生中起到重要的作用[28]。然而，目前尚未見有病毒、HK3和TNBC 之間關(guān)系的成熟研究，未來有必要進(jìn)一步探索病毒是如何影響HK3 進(jìn)而影響TNBC 的相關(guān)機(jī)制。

綜上所述，HK3 在TNBC 組織中顯著高表達(dá)。然而，HK3 高表達(dá)的TNBC 患者有較好的預(yù)后。未來有望利用乳腺組織中HK3 的表達(dá)水平鑒別TNBC 患者、對(duì)乳腺癌患者分型和預(yù)測(cè)TNBC 患者的預(yù)后。HK3 可能主要通過調(diào)節(jié)TNBC 細(xì)胞的糖酵解途徑，進(jìn)而影響腫瘤免疫微環(huán)境等過程促進(jìn)TNBC 的發(fā)生和進(jìn)展。因此，IC 和乳酸代謝檢查點(diǎn)等有望作為治療TNBC 的新靶點(diǎn)。