雷新環(huán) 朱忠 楊海蘭 袁赤亭 郭宇華 章禮煒

正常機(jī)體的骨重建依賴于破骨細(xì)胞介導(dǎo)的骨吸收與成骨細(xì)胞介導(dǎo)的骨形成之間的動(dòng)態(tài)平衡，兩者失衡將引起骨過度形成、硬化相關(guān)疾病或骨形成不全、過度吸收相關(guān)疾病[1]。在正常生理狀態(tài)下，為了維持骨量穩(wěn)定，骨組織始終處于不斷的代謝狀態(tài)，包括成骨細(xì)胞形成新的骨組織及破骨細(xì)胞重吸收陳舊或受損骨組織，從而保持動(dòng)態(tài)平衡維持骨量穩(wěn)定。骨髓來源間充質(zhì)干細(xì)胞（bone marrow-derived mesenchymal stem cells，BMSCs）的減少及成骨細(xì)胞和脂肪細(xì)胞的分化失衡最終導(dǎo)致骨形成減少，是老年骨質(zhì)疏松的病因基礎(chǔ)之一[2]。BMSCs 的成骨分化是影響骨形成乃至骨量的主要因素之一，這一過程受到多個(gè)信號(hào)通路及細(xì)胞因子的調(diào)控，諸如β-連環(huán)蛋白、Notch、骨形成蛋白家族等相關(guān)通路，其中Hedgehog（Hh）信號(hào)通路作為一條保守且重要的信號(hào)通路，參與多種類型細(xì)胞的分化、增殖，在骨發(fā)育及骨代謝中同樣起著重要作用[3-4]。小分子藥物嘌嗎啡胺（purmorphamine，PM）可直接結(jié)合Hh 信號(hào)通路中的Smoothened 蛋白，激活Hh信號(hào)通路[5-6]。目前國(guó)內(nèi)外研究表明PM 可顯著增強(qiáng)成骨細(xì)胞相關(guān)特征基因表達(dá)，但其在調(diào)控BMSCs 成骨-成脂分化中的作用尚缺乏較為系統(tǒng)的報(bào)道[7-8]。本研究探討PM 靶向激活Hh 信號(hào)通路后對(duì)BMSCs 成骨-成脂分化平衡的影響及其機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 6～8 周齡SPF 級(jí)C57BL/6 小鼠15 只，購(gòu)于上海杰思捷實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司[生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（滬）2018-0004]，飼養(yǎng)于浙江省臺(tái)州醫(yī)院公共科研平臺(tái)SPF 動(dòng)物房[使用許可證號(hào)：SYXK（浙）2019-0030]。小鼠在室溫20～25 ℃，濕度40%～60%，24 h 自然光暗循環(huán)條件下飼養(yǎng)，不限制飲水及進(jìn)食。本研究相關(guān)動(dòng)物飼養(yǎng)及操作經(jīng)浙江省臺(tái)州醫(yī)院動(dòng)物倫理委員會(huì)審查通過（批準(zhǔn)文號(hào)：tzyy-2019033）。

1.2 試劑和儀器 PM（貨號(hào)：S3042）購(gòu)于美國(guó)Selleck Chemicals 公司，高速離心后使用二甲基亞砜（貨號(hào)：ST038，上海碧云天生物技術(shù)有限公司）溶解制成100 mmol/L 母液，分裝后置于-80 ℃冰箱保存。維生素C（貨號(hào)：S13001）、β-甘油磷酸鈉（貨號(hào)：S30003）、地塞米松（貨號(hào)：S17003）、胰島素（貨號(hào)：S24703）、羅格列酮（貨號(hào)：S70212）均購(gòu)于上海源葉生物科技有限公司；α-MEM 培養(yǎng)基（貨號(hào)：SH30265.01）購(gòu)于美國(guó)Hyclone 公司；異丙醇（貨號(hào)：A507048）購(gòu)于上海生物工程有限公司；特級(jí)FBS（貨號(hào)：FB25015）購(gòu)于美國(guó)Clark Bioscience 公司；細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒-8（cell count kit 8，CCK-8）試劑盒（貨號(hào)：K1018）購(gòu)于美國(guó)APExBIO 公司；cDNA 第一鏈合成試劑盒（貨號(hào)：R123-01）、SYBR Green 熒光實(shí)時(shí)定量PCR 試劑盒（貨號(hào)：Q121-02）均購(gòu)于南京諾唯贊生物科技股份有限公司；總RNA 提取試劑（貨號(hào)：R1100）、Von Kossa 礦化結(jié)節(jié)染色液（貨號(hào)：G3282）均購(gòu)于北京索萊寶科技有限公司；油紅O 染色試劑盒（貨號(hào)：C0157）、5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸（5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate，BCIP）/硝基氯化四氮唑藍(lán)（nitro blue tetrazolium chloride，NBT）ALP 顯色試劑盒（貨號(hào)：C3206）、PBS（貨號(hào)：C0221）、紅細(xì)胞裂解液（貨號(hào)：C3702）、胰酶細(xì)胞消化液（貨號(hào)：C0201）、青霉素-鏈霉素雙抗溶液（貨號(hào)：C0222）均購(gòu)于上海碧云天生物技術(shù)有限公司；4%多聚甲醛固定液（貨號(hào)：G1101）購(gòu)于武漢賽維爾生物科技有限公司；FITC Anti-CD44（貨號(hào)：FITC-65117）、FITC Anti-CD45（貨號(hào)：FITC-65109）抗體均購(gòu)于武漢三鷹生物技術(shù)有限公司；FITC Anti-CD105（貨號(hào)：ab184667）、PE Anti-CD34（貨號(hào)：ab23830）抗體均購(gòu)于美國(guó)Abcam 公司。Multiskan Sky-High 全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀購(gòu)于美國(guó)Thermo Fisher 公司；ABI 7500 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀購(gòu)自于美國(guó)Applied Biosystems 公司；DM IL LED 倒置實(shí)驗(yàn)室顯微鏡購(gòu)于德國(guó)Leica公司；FACSCalibur流式細(xì)胞儀購(gòu)于美國(guó)BD公司。

1.3 方法

1.3.1 BMSCs 的分離培養(yǎng)與鑒定 將小鼠麻醉后脫頸處死，分離小鼠雙下肢踝關(guān)節(jié)、膝關(guān)節(jié)、髖關(guān)節(jié)，取出脛骨、股骨放置于裝有PBS 的細(xì)菌皿中，剃凈肌肉、生長(zhǎng)板及黏附其上的韌帶等結(jié)締組織，3 次無菌PBS 漂洗后，于股骨近端、脛骨遠(yuǎn)端暴露骨髓腔，使用1 mL 針筒抽取PBS 反復(fù)沖洗骨髓腔直至骨髓腔無明顯血色。將分離的骨髓使用α-MEM 完全培養(yǎng)基（含有10%FBS）重懸后1 500 r/min 離心4 min，倒掉上清液后使用紅細(xì)胞裂解液重懸細(xì)胞沉淀，5 min 后再次離心，棄上清液并重懸于含10%特級(jí)FBS、1%青霉素-鏈霉素雙抗溶液的完全培養(yǎng)基，接種于10 cm 細(xì)胞培養(yǎng)皿中，每2 天換液1 次，待細(xì)胞長(zhǎng)至80%時(shí)胰酶消化，計(jì)數(shù)后備用。為明確所收集的細(xì)胞是否為BMSCs，將部分細(xì)胞1 500 r/min 離心10 min，吸棄上清液，加入10 mL PBS吹勻后1 500 r/min 離心10 min，洗滌2 次。吸棄上清液，加入PBS 制成單細(xì)胞懸液。隨后將細(xì)胞調(diào)整密度為1×106個(gè)/mL，分管后1 500 r/min 離心10 min，吸棄上清液，加入90 μL PBS 后吹打?yàn)榧?xì)胞懸液，分別加入流式抗體（FITC Anti-CD44、FITC Anti-CD45、FITC Anti-CD105、PE Anti-CD34）及其同型對(duì)照各10 μL，37 ℃避光孵育30 min后加入400 μL PBS，上流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.3.2 BMSCs 增殖活性檢測(cè) 采用CCK-8 法。將BMSCs 按0.6×104細(xì)胞/孔的密度種于96 孔板內(nèi)，設(shè)置1 個(gè)對(duì)照組和9 個(gè)濃度（0.5、1、2、5、10、25、50、100、200 μmol/L）PM 處理組，共10 組，每組3 個(gè)重復(fù)孔。待細(xì)胞過夜貼壁后，將孔內(nèi)液體更換為對(duì)應(yīng)組別包含不同濃度PM 的完全培養(yǎng)基進(jìn)一步培養(yǎng)，隔天換液1 次。分別培養(yǎng)48、72、96 h 后，向每孔中加入10 μL CCK-8試劑，于細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)2 h 后，使用酶標(biāo)儀測(cè)定各孔450 nm 波長(zhǎng)處吸光度（optical density，OD）值。

1.3.3 BMSCs 成骨、成脂分化誘導(dǎo) 首先，為進(jìn)行成骨誘導(dǎo)，將BMSCs 按20×104細(xì)胞/孔的密度種于12 孔板（ALP 染色）或40×104細(xì)胞/孔的密度種于6 孔板（抽提RNA 或Von Kossa 礦化結(jié)節(jié)染色）。過夜貼壁后，使用成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基（完全培養(yǎng)基+50 μg/mL 維生素C+10 mmol/L β-甘油磷酸鈉+100 nmol/L 地塞米松）進(jìn)行成骨分化誘導(dǎo)，隔天換液，中期（7 d 左右）可見細(xì)胞收縮、聚集，后期（14 d 左右）可見磨砂樣鈣結(jié)節(jié)生成。與此同時(shí)，為進(jìn)行成脂誘導(dǎo)，將BMSCs 按30×104細(xì)胞/孔的密度種于12 孔板（油紅O 染色）或60×104細(xì)胞/孔的密度種于6 孔板（抽提RNA）。過夜貼壁后，使用成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)基（完全培養(yǎng)基+1 μg/mL 胰島素+10 μmol/L 羅格列酮+250 nmol/L 地塞米松）進(jìn)行成脂分化誘導(dǎo)，隔天換液，中期（4 d 左右）可見細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)少量透亮的小脂滴，后期（8 d 左右）可見細(xì)胞內(nèi)堆積大量肥大透亮的成熟脂滴。

1.3.4 ALP 表達(dá)檢測(cè) 采用ALP 染色法。首先，吸除12 孔板中培養(yǎng)基后使用PBS 洗滌2 次，以去除細(xì)胞碎片、漂浮物等。隨后向每孔加入500 μL 4%多聚甲醛固定液固定細(xì)胞5 min，后吸除固定液并用雙蒸水漂洗2 次。根據(jù)ALP 顯色試劑盒說明書步驟，將BCIP 溶液（300X）、NBT 溶液（150X）加入ALP 顯色緩沖液，配制成ALP 染色工作液，每孔加入500 μL 進(jìn)行染色，置于37 ℃烘箱中避光孵育30 min。最后，吸除染色液并用雙蒸水漂洗2 次，置于倒置顯微鏡下拍照。

1.3.5 鈣結(jié)節(jié)檢測(cè) 采用Von Kossa 礦化結(jié)節(jié)染色法。Von Kossa 礦化結(jié)節(jié)染色法利用硝酸銀與鈣鹽的復(fù)分解反應(yīng)形成可被還原的銀鹽，在強(qiáng)光或紫外光下或強(qiáng)還原劑作用下使其還原為黑色的金屬銀的特性，可以將礦化結(jié)節(jié)染成黑色。首先，吸除6 孔板中培養(yǎng)基后使用PBS 洗滌2 次，向每孔加入1 mL 4%多聚甲醛固定液固定細(xì)胞5 min，后吸除固定液并用雙蒸水漂洗2 次。每孔加入1 mL Von Kossa 硝酸銀溶液，置于陽(yáng)光下照射20 min。最后，吸除染色液并用雙蒸水漂洗2次，置于倒置顯微鏡下拍照。

1.3.6 脂滴形成檢測(cè) 采用油紅O 染色法。首先，吸除6 孔板中培養(yǎng)基后使用PBS 洗滌2 次，向每孔加入500 μL 4%多聚甲醛固定液固定細(xì)胞5 min，后吸除固定液并用雙蒸水漂洗2 次。隨后每孔加入1 mL 60%異丙醇溶液清洗細(xì)胞，吸棄后每孔加入1 mL 現(xiàn)配的油紅O 染色工作液。染色15 min 后吸棄，60%異丙醇溶液清洗殘留油紅O 2 次。最后使用雙蒸水漂洗2 次，并向每孔加入1 mL 雙蒸水保持孔板底面濕潤(rùn)，置于倒置顯微鏡下拍照。

1.3.7 PM 對(duì)Hh 信號(hào)通路活性Gli1 及成骨-成脂過程中核心轉(zhuǎn)錄因子Sp7、過氧化物酶體增殖物激活受體γ（peroxisome proliferator-activated receptors γ，Pparg）、CCAAT 增強(qiáng)子結(jié)合蛋白α（CCAAT enhancer-binding protein α，Cebpa）及特征基因ALP、整合素結(jié)合唾液酸蛋白（bone sialoprotein，Ibsp）、圍脂滴蛋白1（perilipin 1，Plin1）、脂聯(lián)素（adiponectin，Adipoq）、脂肪酸轉(zhuǎn)位酶（fatty acid translocase，Cd36）表達(dá)的影響 采用qRTPCR 法。吸去各個(gè)培養(yǎng)孔中的培養(yǎng)基，預(yù)冷的PBS 沖洗1 次后每孔加入500 μL 總RNA 提取試劑，置于冰上按說明書提取細(xì)胞總RNA。RNA 樣品測(cè)定濃度后使用，cDNA 第一鏈合成試劑盒反轉(zhuǎn)錄合成cDNA（1 μg RNA，使用20 μL 反轉(zhuǎn)錄體系，反應(yīng)結(jié)束后使用雙蒸水稀釋至100 μL備用）。后續(xù)qPCR 所用引物序列見表1。所使用的qPCR 反應(yīng)體系為20 μL（SYBR Green 10 μL，cDNA 2 μL，前后鏈引物mix 0.5 μL，ddH2O 7.5 μL），反應(yīng)條件為95 ℃5 min 預(yù)變性，隨后95 ℃10 s 變性，65 ℃30 s 擴(kuò)增共循環(huán)40 次。分析結(jié)果時(shí)，以18S 核糖體RNA（18S ribosomal RNA，Rn18s）為內(nèi)參，使用2-ΔΔCt法計(jì)算各個(gè)基因轉(zhuǎn)錄水平的相對(duì)表達(dá)水平。

表1 qRT-PCR 所用引物序列

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 18.0 統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用Dunnett-t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 BMSCs 鑒定 BMSCs 表面抗原CD44、CD105、CD45、CD34 陽(yáng)性率分別為98.26%、99.07%、0.08%、0.12%，本實(shí)驗(yàn)所用小鼠原代細(xì)胞符合BMSCs 表面抗原特征，鑒定為BMSCs，見圖1。

圖1 流式細(xì)胞儀鑒定本實(shí)驗(yàn)所用原代細(xì)胞是否為BMSCs（A：細(xì)胞表面抗原CD44 表達(dá)陽(yáng)性率流式圖；B：細(xì)胞表面抗原CD105 表達(dá)陽(yáng)性率流式圖；C：細(xì)胞表面抗原CD45 表達(dá)陽(yáng)性率流式圖；D：細(xì)胞表面抗原CD34 表達(dá)陽(yáng)性率流式圖）

2.2 PM 對(duì)BMSCs 增殖及Hh 信號(hào)通路活性的影響在PM 處理BMSCs 48 h 后，50 μmol/L PM 處理組OD450值由對(duì)照組0.88±0.02 降低至0.71±0.04（P＜0.01）；72 h 后，25 μmol/L PM 處理組OD450值由對(duì)照組1.38±0.02 降低至1.23±0.05（P＜0.01）；96 h 后，25 μmol/L PM 處理組OD450值由對(duì)照組1.81±0.03 降低至1.49±0.05（P＜0.01）。CCK-8 實(shí)驗(yàn)提示，10 μmol/L 及以下濃度的PM 對(duì)BMSCs 增殖無明顯毒性反應(yīng)，見圖2。隨后，通過檢測(cè)Hh 下游靶基因Gli1 mRNA 水平的變化，以進(jìn)一步明確PM 對(duì)BMSCs 細(xì)胞內(nèi)Hh 信號(hào)通路活性的影響。與對(duì)照組的1.00±0.34 相比，2 μmol/L PM 處理組Gli1 mRNA 水平增加至117.20±27.74（P＜0.01），并且5 μmol/L PM 處理組、10 μmol/L PM 處理組與2 μmol/L PM 處理組Gli1 mRNA 水平比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05），因此選擇2 μmol/L 濃度的PM進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)，見圖3。

圖2 不同濃度PM 對(duì)BMSCs 增殖活性的影響（A：不同濃度PM 處理下共培養(yǎng)48 h 對(duì)BMSCs 增殖活性的影響；B：不同濃度PM 處理下共培養(yǎng)72 h 對(duì)BMSCs 增殖活性的影響；C：不同濃度PM 處理下共培養(yǎng)96 h 對(duì)BMSCs 增殖活性的影響）

圖3 不同濃度PM 對(duì)BMSCs 細(xì)胞內(nèi)Hh 信號(hào)通路活性Gli1 的影響

2.3 PM 對(duì)BMSCs 成骨-成脂分化的影響 首先，對(duì)照組和2 μmol/L PM 處理組BMSCs 分別經(jīng)過7 d 的成骨誘導(dǎo)進(jìn)行ALP 染色、14 d 的成骨誘導(dǎo)進(jìn)行Von Kossa 礦化結(jié)節(jié)染色，結(jié)果提示在2 μmol/L PM 的作用下，可明顯促進(jìn)BMSCs 成骨分化過程中ALP 的表達(dá)和鈣結(jié)節(jié)的形成。與此同時(shí)，對(duì)照組和2 μmol/L PM 處理組BMSCs 經(jīng)過8 d 的成脂誘導(dǎo)后進(jìn)行油紅O 染色，結(jié)果提示在2 μmol/L PM 的作用下，可顯著抑制BMSCs 成脂分化過程中細(xì)胞內(nèi)脂滴的形成與堆積（圖4，見插頁(yè)）。

圖4 2 μmol/L PM 處理下對(duì)BMSCs 成骨分化過程中ALP 表達(dá)、鈣結(jié)節(jié)形成及成脂分化過程中脂滴形成的影響

2.4 PM 對(duì)BMSCs成骨-成脂分化過程中相關(guān)核心轉(zhuǎn)錄因子、特征基因轉(zhuǎn)錄的影響 與對(duì)照組比較，2 μmol/L PM 處理組BMSCs 成骨分化7 d 時(shí)細(xì)胞內(nèi)ALP、Sp7、Ibsp 基因轉(zhuǎn)錄水平均升高（均P＜0.01）。與此同時(shí)，與對(duì)照組比較，2 μmol/L PM 處理組BMSCs 成脂分化8 d時(shí)細(xì)胞內(nèi)Pparg、Cebpa、Plin1、Adipoq、Cd36 基因轉(zhuǎn)錄水平均降低（均P＜0.05），見圖5。

圖5 2 μmol/L PM 對(duì)BMSCs 成骨-成脂分化過程中相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄的影響（A：2 μmol/L PM 對(duì)BMSCs 成骨誘導(dǎo)7 d 后核心轉(zhuǎn)錄因子Sp7 及特征基因ALP、Ibsp 轉(zhuǎn)錄的影響；B：2 μmol/L PM 對(duì)BMSCs 成脂誘導(dǎo)8 d 后核心轉(zhuǎn)錄因子Pparg、Cebpa 及特征基因Plin1、Adipoq、Cd36 轉(zhuǎn)錄的影響）

3 討論

骨作為運(yùn)動(dòng)系統(tǒng)的重要組成部分，為機(jī)體提供結(jié)構(gòu)依托及保護(hù)作用，參與體內(nèi)造血、鈣代謝、內(nèi)分泌調(diào)節(jié)等生理過程。骨重建貫穿人的一生，并且大部分骨代謝相關(guān)疾病均影響骨重建過程[9]。骨質(zhì)疏松癥是多種原因?qū)е碌墓敲芏群凸琴|(zhì)量下降，骨微結(jié)構(gòu)破壞，造成骨脆性增加，從而容易發(fā)生骨折的全身性骨病，與機(jī)體衰老密切相關(guān)[10]。更年期婦女絕經(jīng)后體內(nèi)破骨細(xì)胞數(shù)目增多、活性增強(qiáng)，引起松質(zhì)骨的大量丟失，目前臨床中使用的雙膦酸鹽類藥物（唑來膦酸等）、降鈣素、雌激素受體調(diào)節(jié)劑等均以破骨細(xì)胞作為靶點(diǎn)[11]。此外，成骨細(xì)胞所介導(dǎo)的骨形成能力降低也是骨質(zhì)疏松癥發(fā)生的重要因素，特別是在老年骨質(zhì)疏松癥中尤為重要。隨著機(jī)體的衰老和體內(nèi)慢性炎癥狀態(tài)，BMSCs 的成骨分化能力減弱，成脂分化能力增強(qiáng)，導(dǎo)致人體骨形成速度顯著下降[10]。針對(duì)機(jī)體成骨-成脂失衡這一靶點(diǎn)，開展相關(guān)機(jī)制研究、藥物研發(fā)，進(jìn)而增強(qiáng)骨形成能力，不僅可以延緩骨質(zhì)疏松癥的發(fā)生，而且可以逆轉(zhuǎn)骨量的丟失，是目前骨代謝領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)之一。Hh 信號(hào)通路高度保守，脊椎動(dòng)物體內(nèi)存在3 種Hh 配體蛋白，即Sonic hedgehog（Shh）、Indian hedgehog（Ihh）和Desert hedgehog（Dhh），3 者表達(dá)位置存在差異但以相同的方式激活Hh 信號(hào)通路[12]。其中Shh 是成骨細(xì)胞分化早期的關(guān)鍵信號(hào)之一，是早期胚胎形成和顱面部形態(tài)發(fā)生的主要調(diào)節(jié)因子；而Ihh 主要在后期參與分化的調(diào)控，是軟骨成骨生長(zhǎng)和骨化的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子[13]。目前，大量針對(duì)Hh 信號(hào)通路的研究主要集中在MC3T3-E1、C3H10 T1/2 等細(xì)胞系，尚未有研究報(bào)道直接在BMSCs 中靶向激活Hh 信號(hào)通路對(duì)其成骨-成脂分化的影響。

本研究首先通過流式細(xì)胞儀鑒定了所提取培養(yǎng)的BMSCs 細(xì)胞表面特征蛋白情況，發(fā)現(xiàn)其可高表達(dá)CD44、CD105（均＞95%），低表達(dá)CD45、CD34（均＜2%）。結(jié)合所提取的BMSCs 貼壁生長(zhǎng)的同時(shí)，可在特定誘導(dǎo)條件下分化為成骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞，符合目前公認(rèn)的間充質(zhì)干細(xì)胞認(rèn)定標(biāo)準(zhǔn)。隨后通過使用PM靶向激活Smoothened 蛋白，Smoothened 移動(dòng)到初級(jí)纖毛的頂端并向Sufu 發(fā)出信號(hào)以釋放Gli 激活劑，Gli 激活劑遷移到細(xì)胞核并激活靶基因如Gli1 的表達(dá)。在2 μmol/L PM 處理下，Hh 信號(hào)通路得到了有效激活，下游轉(zhuǎn)錄因子Gli1 的表達(dá)顯著升高。與此同時(shí)，PM 可顯著促進(jìn)BMSCs 成骨分化過程中ALP 的表達(dá)和鈣結(jié)節(jié)的形成，同時(shí)抑制BMSCs 成脂分化過程中脂滴的形成。在此基礎(chǔ)之上，qRT-PCR 結(jié)果進(jìn)一步揭示了在BMSCs 成骨-成脂分化過程中，PM 刺激Hh 信號(hào)通路后可導(dǎo)致成骨相關(guān)基因Sp7、ALP、Ibsp 在轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)顯著增強(qiáng)，而成脂相關(guān)基因Pparg、Cebpa、Plin1、Adipoq、Cd36 在轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)明顯下降。在既往研究中，Hh 信號(hào)通路能通過轉(zhuǎn)錄因子Gli2 增強(qiáng)骨形成蛋白（bone morphogenetic protein，BMP）的啟動(dòng)子活性，促進(jìn)BMP2、BMP4 表達(dá)從而部分調(diào)控BMP 誘導(dǎo)成骨分化的過程[14-17]。同時(shí)Hh 通路既能增強(qiáng)Smad1/5/8 轉(zhuǎn)錄活性，也能促進(jìn)BMP9 誘導(dǎo)RUNX2 和DLX5 等基因表達(dá)的作用，從而促進(jìn)BMP9 的早期和晚期成骨分化誘導(dǎo)作用[18]。本研究首次利用小鼠來源的BMSCs 作為研究對(duì)象，發(fā)現(xiàn)通過使用PM 激活Hh 信號(hào)通路后可直接調(diào)控成骨分化、成脂分化的3 種核心轉(zhuǎn)錄因子Sp7、Pparg、Cebpa 表達(dá)，影響B(tài)MSCs 分化命運(yùn)。

綜上所述，本研究揭示了PM 可直接靶向激活Hh信號(hào)通路活性，進(jìn)而調(diào)節(jié)BMSCs 成骨-成脂分化平衡，可促進(jìn)成骨分化的同時(shí)抑制成脂分化，為防治骨質(zhì)疏松癥等骨量丟失疾病提供新的靶點(diǎn)與思路。