金光軍 喻雯 趙金凱 張建成

膿毒癥是臨床上最常見(jiàn)的危重病癥[1]，全球每年有高達(dá)700 萬(wàn)人患膿毒癥，且致死率高達(dá)40%，在特定的患者群體（如老年人或患有慢性基礎(chǔ)疾病的人群）中死亡率甚至高達(dá)70%[2]。膿毒癥發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，是由內(nèi)部或外部的感染引發(fā)的機(jī)體免疫功能障礙或凝血功能障礙綜合征，最終導(dǎo)致器官組織損傷[3]。在膿毒癥導(dǎo)致的多器官功能障礙中，心臟是最易受累的器官之一，約40%的嚴(yán)重膿毒癥患者發(fā)生心肌損傷[4]。心肌細(xì)胞凋亡在膿毒癥誘導(dǎo)的心肌損傷過(guò)程中起到重要作用。前人的研究表明心肌細(xì)胞線粒體損傷在膿毒癥誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡過(guò)程中起關(guān)鍵作用，線粒體自噬是細(xì)胞清除受損線粒體的重要機(jī)制，此過(guò)程受阻會(huì)導(dǎo)致受損線粒體在細(xì)胞內(nèi)積累進(jìn)而導(dǎo)致H2O2等活性氧積累，從而誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡[5]。因此，線粒體自噬是膿毒癥對(duì)心肌細(xì)胞自救的重要途徑，但在此過(guò)程中心肌細(xì)胞線粒體自噬的誘導(dǎo)機(jī)制尚不完全清楚。研究表明，組蛋白去甲基化酶3（jumonji domaincontaining protein 3，JMJD3）是介導(dǎo)免疫細(xì)胞激活和炎癥細(xì)胞因子表達(dá)的關(guān)鍵調(diào)控因子，SESTRIN 2 蛋白重組蛋白（sestrin 2 recombinant protein，SESN2）是一種新型的應(yīng)激誘導(dǎo)蛋白，可調(diào)節(jié)腺苷酸依賴的蛋白激酶（adenosine 5'-monophosphate-activated protein kinase，AMPK）哺乳動(dòng)物靶標(biāo)并抑制氧化損傷。研究發(fā)現(xiàn)，JMJD3 通過(guò)抑制SESN2 表達(dá)介導(dǎo)阿霉素誘導(dǎo)的心肌病[6]，但具體機(jī)制尚不清楚。因此，本實(shí)驗(yàn)旨在探究JMJD3 通過(guò)調(diào)控SESN2 對(duì)膿毒癥心肌損傷（sepsis-induced myocardial injury，SIMI）的作用，并分析其機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及細(xì)胞 2 月齡SD 雄性大鼠20 只，體重200～250 g，由杭州醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供[生產(chǎn)許可證：SCXK（浙）2019-0002]，飼養(yǎng)于杭州醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心SPF 級(jí)動(dòng)物房[使用許可證：SYXK（浙）2019-0011]。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)浙江省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利倫理委員會(huì)審查通過(guò)（批準(zhǔn)文號(hào)：ZJCLA-IACUC-20010220）。大鼠心肌細(xì)胞H9C2（批號(hào)：CL-0089）購(gòu)自普諾賽生命科技有限公司（武漢）。

1.2 試劑及儀器 心肌肌鈣蛋白T（cardiac troponin T，cTnT）（批號(hào)：ml003374）、TNF-α（批號(hào)：ml002859）、IL-6（批號(hào)：ml064292）ELISA 檢測(cè)試劑盒均購(gòu)自上海酶聯(lián)生物科技有限公司；脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）（批號(hào)：L8880）、細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒-8（cell counting kit-8，CCK-8）（批號(hào)：CA1210）均購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；微管相關(guān)蛋白輕鏈3（light chain 3，LC3）抗體（批號(hào)：4108S）、重組人自噬效應(yīng)蛋白（recombinant Beclin 1，Beclin1）抗體（批號(hào)：3495T）、選擇性自噬接頭蛋白（prostacyclin，p62）抗體（批號(hào)：23214S）、B 淋巴細(xì)胞 瘤-2（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）抗 體（批 號(hào)：3869S）、Bcl-2 關(guān)聯(lián)X 基因（Bcl-2-associated X，Bax）抗體（批號(hào)：14796S）均購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling Technology公司；JMJD3 抗體（批號(hào)：ab169197）、SESN2 抗體（批號(hào)：ab178518）均購(gòu)自英國(guó)Abcam 公司；JMJD3 表達(dá)的小干擾RNA（siRNA-JMJD3，si-JMJD3）和SESN2 表達(dá)的小干擾RNA（siRNA-SESN2，si-SESN2）由吉瑪基因股份有限公司（蘇州）合成，攜帶JMJD3、SESN2 質(zhì)粒的腺相關(guān)病毒由維真生物科技有限公司（山東）合成。Forma?直熱式CO2培養(yǎng)箱購(gòu)自美國(guó)Thermo 公司；微孔板吸光度儀購(gòu)自美國(guó)BIO-RAD 公司；化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)（型號(hào)：ChemiScope 6200）購(gòu)自上海勤翔科學(xué)儀器有限公司；熒光顯微鏡購(gòu)自美國(guó)Leica 公司。

1.3 動(dòng)物分組及模型建立 大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周，按隨機(jī)數(shù)字表法分為對(duì)照組和SIMI 組，每組10 只。LPS粉末溶于0.9%氯化鈉溶液，配置成5 mg/mL 溶液，SIMI組大鼠腹腔注射LPS 10 mg/kg（2 mL/kg），對(duì)照組大鼠腹腔注射0.9%氯化鈉注射液2 ml/kg。12 h 后，采集兩組大鼠靜脈血，分離血清。然后用正常3 倍劑量的舒泰（150 mg/kg）麻醉處死大鼠，取心臟備用。

1.4 細(xì)胞分組及模型制備 H9C2 細(xì)胞置于含10%FBS+1%雙抗（青/鏈霉素）的完全培養(yǎng)基中，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)包括3 個(gè)部分。（1）分為對(duì)照組和LPS 組兩組，LPS 粉末溶于0.9%氯化鈉溶液，配置成5 mg/mL 溶液，細(xì)胞培養(yǎng)至融合度達(dá)60%～70%時(shí)，LPS 組使用10 μg/mL（用培養(yǎng)基稀釋500 倍）LPS 處理H9C2 細(xì)胞48 h 建立膿毒癥細(xì)胞模型，對(duì)照組更換新鮮完全培養(yǎng)基；（2）分為L(zhǎng)PS 組、LPS+si-JMJD3 組、LPS+si-JMJD3+si-SESN2 組3 組。利用si-JMJD3、si-SESN2 對(duì) 細(xì) 胞 中JMJD3 和SESN2 進(jìn) 行 敲 低。H9C2 細(xì)胞按2.5×105個(gè)/mL 接種于6 孔板中，在細(xì)胞融合度達(dá)到60%～80%時(shí)，后兩組更換為含si-JMJD3 或si-SESN2的無(wú)血清培養(yǎng)基，LPS 組更換普通的無(wú)血清培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)染6 h 后更換完全培養(yǎng)基。（3）分為L(zhǎng)PS 組、LPS+SESN2過(guò)表達(dá)（oe-SESN2）組和LPS+oe-SESN2+JMJD3 過(guò)表達(dá)（oe-JMJD3）組3 組。利用攜帶JMJD3、SESN2 質(zhì)粒的腺相關(guān)病毒進(jìn)行JMJD3 和SESN2 的過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)染。H9C2細(xì)胞按2.5×105個(gè)/mL 接種于6 孔板中，在細(xì)胞融合度達(dá)到60%～80%時(shí)，后兩組更換為含JMJD3 或SESN2 質(zhì)粒的腺相關(guān)病毒的無(wú)血清培養(yǎng)基，LPS 組更換普通的無(wú)血清培養(yǎng)基，24 h 后更換為完全培養(yǎng)基。

1.5 大鼠觀測(cè)指標(biāo)

1.5.1 組織病理學(xué)檢測(cè) 切取大鼠心臟組織置于4%多聚甲醛中固定24 h，梯度脫水，石蠟包埋。進(jìn)行HE染色，染色后梯度脫水，二甲苯浸泡，最后將樣本切片干燥，封片后在顯微鏡下觀察大鼠心臟組織病理學(xué)變化并拍照。

1.5.2 大鼠血清中cTnT、TNF-α 和IL-6 水平檢測(cè) 采用ELISA 法。根據(jù)ELISA 試劑盒操作說(shuō)明書(shū)檢測(cè)大鼠血清中cTnT、TNF-α 和IL-6 水平。

1.5.3 大鼠心臟組織中JMJD3 和SESN2 蛋白表達(dá)水平檢測(cè) 采用Western blot 法。充分研磨大鼠心臟，使用蛋白裂解液提取心臟組織蛋白，并使用蛋白定量試劑盒完成蛋白定量。在聚丙烯酰氨凝膠電泳中分離等量蛋白質(zhì)，然后將電泳后的蛋白轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯膜上，在5%脫脂牛奶中室溫封閉2 h，洗凈后加入一抗（JMJD3 和SESN2），4 ℃孵育過(guò)夜。將一抗洗凈，加入山羊抗兔IgG 二抗，室溫下孵育90 min，將二抗洗凈，最后利用化學(xué)發(fā)光成像分析系統(tǒng)收集蛋白條帶圖像，使用Image J 軟件計(jì)算各組灰度值。蛋白相對(duì)表達(dá)水平=各組灰度值/第1 泳道對(duì)照組平均灰度值。

1.6 細(xì)胞觀測(cè)指標(biāo)

1.6.1 細(xì)胞活性檢測(cè) 采用CCK-8 法。H9C2 細(xì)胞以5×103個(gè)/孔的密度接種在96 孔板中，37 ℃5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。將CCK-8 試劑添加到孔中繼續(xù)孵育4 h。使用微孔板吸光度儀檢測(cè)各組細(xì)胞在450 nm波長(zhǎng)處吸光度值。結(jié)果以細(xì)胞活性表述，細(xì)胞活性（%）=（實(shí)驗(yàn)組-空白組）/（對(duì)照組-空白組）×100%。

1.6.2 細(xì)胞凋亡水平檢測(cè) 采用原位末端轉(zhuǎn)移酶標(biāo)記技術(shù)（terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP-biotin nick end labeling assay，TUNEL）染色法。各組H9C2 細(xì)胞使用PBS 洗兩遍，然后在4%多聚甲醛中室溫固定30 min，用70%冷乙醇固定15 min。將細(xì)胞置于含0.3% Triton X-100 的PBS 中，在室溫下孵育5 min，然后加入TUNEL 染色液，37 ℃黑暗環(huán)境中孵育60 min。PBS 洗凈，4',6-二脒基-2-苯基吲哚（4',6-diamidino-2- phenylindole，DAPI）染核5 min，PBS 洗凈3次，在熒光顯微鏡下觀察并拍照。TUNEL 熒光（紅色）強(qiáng)度越強(qiáng)，代表細(xì)胞凋亡水平越高。

1.6.3 細(xì)胞培養(yǎng)上清液中TNF-α 和IL-6 水平檢測(cè)采用ELISA 法。收集各組細(xì)胞培養(yǎng)上清液，根據(jù)ELISA 試劑盒操作說(shuō)明書(shū)檢測(cè)各組細(xì)胞培養(yǎng)上清液中TNF-α 和IL-6 水平。

1.6.4 H9C2 細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白（LC3、Beclin1、p62）、凋亡相關(guān)蛋白（Bax、Bcl-2）、JMJD3 和SESN2 蛋白表達(dá)水平檢測(cè) 采用Western blot 法。提取H9C2 細(xì)胞蛋白并定量。在聚丙烯酰氨凝膠電泳中分離等量蛋白質(zhì)，然后將電泳后的蛋白轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯膜上，然后在5%脫脂牛奶中室溫封閉2 h，洗凈后加入一抗（LC3、Beclin1、p62、Bax、Bcl-2、JMJD3 和SESN2），4 ℃孵育過(guò)夜。將一抗洗凈，加入山羊抗兔IgG 二抗，室溫下孵育90 min，將二抗洗凈，最后利用化學(xué)發(fā)光成像分析系統(tǒng)收集蛋白條帶圖像，使用Image J 軟件計(jì)算各組灰度值。蛋白相對(duì)表達(dá)水平=各組灰度值/第1 泳道對(duì)照組平均灰度值。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用GraphPad Prism 8.0 統(tǒng)計(jì)軟件。兩組比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用Tukey 檢驗(yàn)。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠觀測(cè)指標(biāo)結(jié)果

2.1.1 兩組大鼠心臟組織病理學(xué)改變比較 與對(duì)照組比較，SIMI 組大鼠心肌纖維束排列松散，部分心肌纖維斷裂溶解，伴有間質(zhì)水腫和炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，見(jiàn)圖1。

圖1 兩組大鼠心臟組織病理學(xué)切片所見(jiàn)（A：對(duì)照組；B：SIMI 組）

2.1.2 兩組大鼠血清中cTnT、TNF-α 和IL-6 水平比較 與對(duì)照組比較，SIMI 組大鼠血清中cTnT、TNF-α和IL-6 水平均升高（均P＜0.01），見(jiàn)圖2。

圖2 兩組大鼠血清中cTnT、TNF-α 和IL-6 水平比較

2.1.3 兩組大鼠心臟組織中JMJD3 和SESN2 蛋白表達(dá)水平比較 與對(duì)照組比較，SIMI 組大鼠心臟組織中JMJD3 蛋白表達(dá)水平升高，而SESN2 蛋白表達(dá)水平降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.01），見(jiàn)圖3。

圖3 兩組大鼠心臟組織中JMJD3 和SESN2 蛋白表達(dá)水平比較（A：蛋白表達(dá)的電泳圖；B：蛋白表達(dá)水平的柱狀圖）

2.2 細(xì)胞觀測(cè)指標(biāo)結(jié)果

2.2.1 膿毒癥細(xì)胞模型構(gòu)建指標(biāo)檢測(cè)

2.2.1.1 兩組細(xì)胞活性比較 與對(duì)照組比較，LPS 組細(xì)胞活性減弱（P＜0.05），見(jiàn)圖4。

圖4 兩組細(xì)胞活性比較

2.2.1.2 兩組細(xì)胞凋亡水平比較 與對(duì)照組比較，LPS組細(xì)胞凋亡水平增加，見(jiàn)圖5（插頁(yè)）。

圖5 兩組細(xì)胞凋亡水平比較

2.2.1.3 兩組細(xì)胞培養(yǎng)上清液TNF-α 和IL-6 水平比較 與對(duì)照組比較，LPS 組細(xì)胞培養(yǎng)上清液TNF-α 和IL-6 水平均升高（均P＜0.01），見(jiàn)圖6。較 與對(duì)照組比較，LPS 組細(xì)胞JMJD3 蛋白表達(dá)水平升高，而SESN2 蛋白表達(dá)水平降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.01），見(jiàn)圖7。

圖6 兩組細(xì)胞培養(yǎng)上清液TNF-α 和IL-6 水平比較

圖7 兩組細(xì)胞JMJD3 和SESN2 蛋白表達(dá)水平比較（A：蛋白表達(dá)的電泳圖；B：蛋白表達(dá)水平的柱狀圖）

2.2.1.4 兩組細(xì)胞JMJD3 和SESN2 蛋白表達(dá)水平比

2.2.2 JMJD3 調(diào)控SESN2 影響LPS 誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷

2.2.2.1 3 組細(xì)胞LC3、Beclin1、p62、JMJD3 和SESN2 蛋白表達(dá)水平比較 與LPS 組比較，LPS+si-JMJD3 組JMJD3 蛋白表達(dá)水平降低，而SESN2 蛋白表達(dá)水平升高，同時(shí)自噬水平增強(qiáng)（LC3 和Beclin1 蛋白表達(dá)水平升高，而p62 蛋白表達(dá)水平降低），差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.01）。與LPS+si-JMJD3 組比較，LPS+si-JMJD3+si-SESN2 組進(jìn)一步下調(diào)SESN2 表達(dá)，并且減弱了自噬水平，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.01），見(jiàn)圖8。

圖8 3 組細(xì)胞LC3、Beclin1、p62、JMJD3 和SESN2 蛋白表達(dá)水平比較（A：蛋白表達(dá)的電泳圖；B：蛋白表達(dá)水平的柱狀圖）

2.2.2.2 3 組細(xì)胞活性比較 與LPS 組比較，LPS+si-JMJD3 組細(xì)胞活性增強(qiáng)（P＜0.05）；而與LPS+si-JMJD3組比較，LPS+si-JMJD3+si-SESN2 組細(xì)胞活性減弱（P＜0.05），見(jiàn)圖9。

圖9 3 組細(xì)胞活性比較

2.2.2.3 3 組細(xì)胞凋亡水平比較 與LPS 組比較，LPS+si-JMJD3 組細(xì)胞凋亡水平減弱；而與LPS+si-JMJD3 組比較，LPS+si-JMJD3+si-SESN2 組細(xì)胞凋亡水平增強(qiáng)，見(jiàn)圖10（插頁(yè)）。

圖10 3 組細(xì)胞凋亡水平比較

2.2.2.4 3 組細(xì)胞Bax 和Bcl-2 蛋白表達(dá)水平比較 與LPS 組比較，LPS+si-JMJD3 組Bax 蛋白表達(dá)水平降低，Bcl-2 蛋白表達(dá)水平增加，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.01）；而與LPS+si-JMJD3 組比較，LPS+si-JMJD3+si-SESN2 組Bax 蛋白表達(dá)水平升高，Bcl-2 蛋白表達(dá)水平降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.01），見(jiàn)圖11。

圖11 3 組細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白Bax 和Bcl-2 表達(dá)水平比較（A：蛋白表達(dá)的電泳圖；B：蛋白表達(dá)水平柱狀圖）

2.2.3 JMJD3 調(diào)控SESN2 介導(dǎo)的線粒體自噬影響LPS誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷

2.2.3.1 3 組細(xì)胞LC3、Beclin1、p62、Bax、Bcl-2、JMJD3和SESN2 蛋白表達(dá)水平比較 與LPS 組比較，LPS+oe-SESN2 組SESN2 蛋白表達(dá)水平升高，自噬水平增強(qiáng)（LC3 和Beclin1 蛋白表達(dá)水平升高，而p62 蛋白表達(dá)水平降低），凋亡水平減弱（Bax 蛋白表達(dá)水平降低，Bcl-2 蛋白表達(dá)水平升高），差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.01）；而與LPS+oe-SESN2 組比較，LPS+oe-SESN2+oe-JMJD3 組JMJD3 蛋白表達(dá)水平升高，SESN2 蛋白表達(dá)水平降低，自噬水平減弱（LC3 和Beclin1 蛋白表達(dá)水平降低，而p62 蛋白表達(dá)水平升高），凋亡水平增強(qiáng)（Bax 蛋白表達(dá)水平升高，Bcl-2 蛋白表達(dá)水平降低），差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.01），見(jiàn)圖12。

圖12 3組細(xì)胞LC3、Beclin1、p62、Bax、Bcl2、JMJD3和SESN2蛋白表達(dá)水平比較（A：蛋白表達(dá)的電泳圖；B：蛋白表達(dá)水平的柱狀圖）

2.2.3.2 3 組細(xì)胞活性比較 與LPS 組比較，LPS+oe-SESN2 組細(xì)胞活性 增強(qiáng)（P＜0.01）；而與LPS+oe-SESN2 組相比，LPS+oe-SESN2+oe-JMJD3 組細(xì)胞活性減弱（均P＜0.01），見(jiàn)圖13。

圖13 3 組細(xì)胞活性比較

2.2.3.3 3 組細(xì)胞凋亡水平比較 與LPS 組比較，LPS+oe-SESN2 組凋亡水平減弱；與LPS+oe-SESN2 組比較，LPS+oe-SESN2+oe-JMJD3 組凋亡水平增加，見(jiàn)圖14（插頁(yè)）。

圖14 3 組細(xì)胞凋亡水平比較

3 討論

SIMI 是膿毒癥多臟器功能障礙的表現(xiàn)之一[7]。本研究發(fā)現(xiàn)，SIMI 大鼠的心臟組織發(fā)生明顯病變，伴有間質(zhì)水腫和炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，并且血清cTnT、TNF-α 和IL-6 水平升高。同時(shí)，在LPS 誘導(dǎo)的細(xì)胞模型中，同樣發(fā)現(xiàn)細(xì)胞活性降低，凋亡水平增強(qiáng)，炎癥因子水平升高。本研究成功構(gòu)建了膿毒癥動(dòng)物和細(xì)胞模型。

心臟作為機(jī)體最大的耗能器官，其活動(dòng)的能量需求主要來(lái)源于心肌細(xì)胞內(nèi)豐富的線粒體，因此，線粒體功能障礙是膿毒癥心肌病的重要原因[8]。心肌線粒體的損傷導(dǎo)致活性氧的過(guò)度產(chǎn)生，進(jìn)一步導(dǎo)致心肌線粒體的結(jié)構(gòu)損傷和功能改變[9]。此外，線粒體內(nèi)過(guò)量的H2O2也是重要的信號(hào)因子，不僅會(huì)給細(xì)胞帶來(lái)氧化脅迫，還通過(guò)激活細(xì)胞內(nèi)的炎癥信號(hào)通路引起大量的炎癥因子釋放，進(jìn)而加重心肌細(xì)胞的損傷[10]。線粒體自噬不僅是調(diào)節(jié)線粒體能量代謝、自我修復(fù)和更新的主要機(jī)制，也是細(xì)胞清除受損線粒體的主要機(jī)制[11]。近年研究發(fā)現(xiàn)，膿毒癥時(shí)線粒體自噬對(duì)心肌的保護(hù)及損傷修復(fù)過(guò)程具有重要作用[12]。有研究在膿毒癥模型鼠中發(fā)現(xiàn)施加線粒體自噬抑制劑Bafilomycin 可顯著增加細(xì)胞內(nèi)活性氧的積累并加重膿毒癥誘導(dǎo)的心肌損傷，而施加線粒體自噬激動(dòng)劑Urolithin A 可促進(jìn)線粒體自噬，明顯抑制細(xì)胞內(nèi)活性氧的積累并顯著減輕膿毒癥誘導(dǎo)的心肌損傷，加快心肌損傷后修復(fù)[13]。此外，也有研究證實(shí)激活A(yù)MPK 增加自噬可以減輕LPS 誘導(dǎo)的心肌損傷[9]。因此，有效清除膿毒癥時(shí)心肌細(xì)胞的受損線粒體對(duì)降低細(xì)胞內(nèi)活性氧的積累以及減輕心肌損傷具有重要意義。本研究發(fā)現(xiàn)，誘導(dǎo)線粒體自噬能夠改善LPS 誘導(dǎo)的心肌損傷。

JMJD3 蛋白是一種組蛋白去甲基化酶蛋白，特異性催化甲基化組蛋白H3 賴氨酸27（trimethylation of lysine 27 on histone H3，H3K27）的去甲基化并調(diào)節(jié)基因表達(dá)[14]。有報(bào)道表明膿毒癥心肌細(xì)胞中的H3K27 甲基化修飾水平降低[15]，提示JMJD3 可能通過(guò)影響心肌細(xì)胞中的H3K27 甲基化修飾參與心肌損傷過(guò)程。并且研究表明，敲除JMJD3 可以抑制LPS 誘導(dǎo)的炎性級(jí)聯(lián)反應(yīng)，下調(diào)促炎性細(xì)胞因子的產(chǎn)生[16]，預(yù)防腹主動(dòng)脈瘤[17]。由此可見(jiàn)，JMJD3 是介導(dǎo)免疫細(xì)胞激活和炎癥細(xì)胞因子表達(dá)的關(guān)鍵調(diào)控因子。同時(shí)，有研究發(fā)現(xiàn)JMJD3 通過(guò)抑制SESN2 表達(dá)介導(dǎo)阿霉素誘導(dǎo)的心肌病[6]。SESN2 是一種高度保守的應(yīng)激誘導(dǎo)蛋白，參與心血管疾病中的線粒體功能和自噬[18]。研究表明，SESN2 可以通過(guò)調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激、自噬等過(guò)程對(duì)機(jī)體生理和病理狀態(tài)發(fā)揮保護(hù)作用[19]。過(guò)表達(dá)SESN2 通過(guò)減少活性氧產(chǎn)生、減少ATP 消耗及增加線粒體膜電位等減輕葡萄糖剝奪誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，減輕膿毒癥引起的心臟功能障礙[20]。此外，SESN2 還可以通過(guò)改善線粒體功能和線粒體自噬來(lái)減輕阿霉素誘導(dǎo)的心肌病[21]。本研究進(jìn)一步探究了JMJD3 和SESN2 在膿毒癥心肌損傷中的調(diào)控機(jī)制。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在膿毒癥體內(nèi)外模型中JMJD3 都呈現(xiàn)高表達(dá)，SESN2 蛋白表達(dá)水平降低；且敲低JMJD3 后發(fā)現(xiàn)SESN2 蛋白表達(dá)水平增強(qiáng)，同時(shí)細(xì)胞活性增強(qiáng)，凋亡水平減弱，自噬水平增強(qiáng)。同時(shí)還發(fā)現(xiàn)，過(guò)表達(dá)SESN2 后，自噬水平增強(qiáng)，細(xì)胞活性增強(qiáng)，凋亡水平減弱，而進(jìn)一步過(guò)表達(dá)JMJD3 后，以上變化趨勢(shì)發(fā)生逆轉(zhuǎn)。進(jìn)一步證實(shí)了JMJD3 和SESN2 通過(guò)調(diào)控線粒體自噬影響SIMI。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)JMJD3 可能通過(guò)調(diào)控SESN2 介導(dǎo)線粒體自噬，促進(jìn)LPS 誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷。本研究結(jié)果為闡明膿毒癥下心肌細(xì)胞線粒體自噬的機(jī)制和尋找SIMI 新療法提供了理論依據(jù)。