莊茂林 潘旻升 孫明潔 于 洋 姜祖波 趙政政 張本旺 江 峰 陳付強(qiáng) △

（1 濰坊醫(yī)學(xué)院麻醉學(xué)院，濰坊261000；青島市市立醫(yī)院東院區(qū)2 疼痛科；3 檢驗(yàn)科，青島266011）

帶狀皰疹 (herpes zoster, HZ) 皮疹愈合后持續(xù)1個(gè)月及以上的疼痛定義為帶狀皰疹后神經(jīng)痛 (postherpetic neuralgia, PHN)[1]。PHN 是HZ 最常見最嚴(yán)重的并發(fā)癥，老年HZ 病人罹患PHN 的比例高達(dá)75%[2]。PHN 帶來的慢性疼痛給病人帶來極大地痛苦，嚴(yán)重影響病人生活質(zhì)量，臨床上一些病人忍受病痛折磨長達(dá)數(shù)年。而PHN 的發(fā)病機(jī)制至今仍未闡明，臨床上缺乏預(yù)測PHN 病程長短的方法。

最近的一項(xiàng)研究證實(shí)，外周血中的水痘-帶狀皰疹病毒(varicella zoster virus, VZV)特異性T 細(xì)胞隨著年齡的增長而減少，而調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞 (regulatory T cells, Treg) 會(huì)增加[3]。病毒感染中的Treg 細(xì)胞可以控制抗病毒炎癥但它們抑制抗病毒免疫力，間接促進(jìn)了病毒復(fù)制，并導(dǎo)致持續(xù)的病毒感染。輔助性T 細(xì)胞 (helper T cell, Th17) 在宿主抵御一些病毒感染方面發(fā)揮著重要作用，但它們可能會(huì)導(dǎo)致有害的免疫病理反應(yīng)[4]。最近的研究已經(jīng)證實(shí)，Treg/Th17的平衡在HZ 的疾病發(fā)展中起到重要作用[5]。 且有研究證實(shí)，Treg/Th17 與PHN 疼痛程度呈負(fù)相關(guān)，但是Treg/Th17 的高低與發(fā)病時(shí)間的關(guān)系沒有得到闡明。為解決臨床中無法預(yù)估PHN 病人發(fā)病時(shí)長、預(yù)后情況的問題，本研究立足于免疫相關(guān)的Treg 細(xì)胞與Th17 細(xì)胞，闡明了PHN 病人Treg/Th17 失衡與發(fā)病時(shí)間的關(guān)系，以求可以幫助了解PHN 這一疾病在轉(zhuǎn)歸過程中免疫功能的變化。甚至基于維護(hù)兩細(xì)胞平衡對病人免疫功能水平進(jìn)行預(yù)防性治療，改善病人預(yù)后。

方 法

1.一般資料

本研究通過青島市市立醫(yī)院倫理委員會(huì)審核（倫理批號2023061），已與病人家屬溝通后簽署知情同意書。選取2021 年2 月至2022 年9 月青島市市立醫(yī)院疼痛科收治的PHN 病人48 例，其中皰疹部位為頭面部9，上肢1 例，季肋區(qū)6 例，胸背部12例，腰腹部18 例，下肢2 例。年齡50～93 歲，平均年齡69.7 歲，男22 例，女26 例。選取健康對照組22 例，均為同期門診健康體檢者，年齡54～81 歲，平均年齡70.7 歲，男10 例，女12 例。兩組在年齡、性別等方面比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＞ 0.05)。

納入標(biāo)準(zhǔn)：符合PHN 診斷標(biāo)準(zhǔn)，疼痛數(shù)字分級評分法(numerical rating scale, NRS)評分在4 分及以上，且具有典型的HZ 臨床癥狀和體征，溝通無障礙，能夠配合NRS 評分的評估，在過去的1 個(gè)月內(nèi)，沒有使用免疫抑制劑（如糖皮質(zhì)激素）等可影響T 淋巴細(xì)胞亞群的藥物。

排除標(biāo)準(zhǔn)：伴有嚴(yán)重心、肺、腎等系統(tǒng)性疾病、惡性腫瘤、自身免疫性疾病和應(yīng)用免疫抑制劑，以及精神病或不合作者。

2.主要試劑及儀器

小鼠抗人單克隆抗體 (CD4-FITC/CD25-APC)、Foxp3 固定破膜工作液、紅細(xì)胞裂解液 (Optilyse C)法國 Immunotech 公司；小鼠單克隆抗體(Foxp3-APC)英國abcam 公司；流式細(xì)胞儀(Epics XL·MCL)：美國 BECKMANCOULTER 公司；低溫高速離心機(jī)：德國 Heraeus 公司；37℃恒溫箱：北京福意電器有限公司；Varioskan Flash 全波長掃描式多功能讀數(shù)儀。

3.方法

資料收集：收集病人的淋巴細(xì)胞亞群檢測結(jié)果，內(nèi)容包括總淋巴細(xì)胞、T 淋巴細(xì)胞、誘導(dǎo)性T細(xì)胞(CD4+T)、殺傷性T 細(xì)胞(CD8+T)、NK 細(xì)胞。病人的臨床資料包括性別、年齡、發(fā)病至就診時(shí)間、皰疹位置等。

標(biāo)本收集：在病人初診時(shí)抽取靜脈血10 ml 于肝素輸液管中，用等體積的磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffer saline, PBS)稀釋后，采用密度梯度離心法分離外周血單個(gè)核淋巴細(xì)胞。用于后期Th17 和Treg 細(xì)胞檢測。

Treg 細(xì)胞檢測：Treg 細(xì)胞被定義為CD4+CD25+-Foxp3+T 細(xì)胞。為了確定Treg 細(xì)胞比例，將單個(gè)核淋巴細(xì)胞PBS 重懸，調(diào)節(jié)PBMC 濃度為1×106個(gè)/ml左右。使用CD4-FITC 和CD25-APC 單克隆抗體對Treg 細(xì)胞表面進(jìn)行染色，以檢測PBMC 的細(xì)胞表面抗原。然后，使用流式染色緩沖液洗滌，加入1 ml Fixation 破膜緩沖液，4℃避光孵育45 min；用破膜緩沖液洗滌2 次，加入20 μl Foxp3-APC，4℃避光孵育30 min；經(jīng)破膜緩沖液洗滌2 次，用500 μl 流式染色緩沖液重懸，上機(jī)檢測，熒光數(shù)據(jù)的獲得以熒光強(qiáng)度 ＞ 3000 個(gè)個(gè)體細(xì)胞為陽性，經(jīng)分析后將CD4+CD25+Foxp3+T 細(xì)胞相對于CD4+總細(xì)胞的比例轉(zhuǎn)換為百分比，以獲得Treg 細(xì)胞的數(shù)量。

Th17 細(xì)胞檢測：Th17 細(xì)胞被定義為產(chǎn)生白介素17 (interleukin-17, IL-17)的輔助T 細(xì)胞。將單個(gè)核淋巴細(xì)胞PBS 重懸后，調(diào)節(jié) PBMC 濃度保持在1×106個(gè)/ml 左右。之后按照流式檢測試劑盒說明書操作，分別加入固定液、破膜劑，抗體混合液，每種試劑加入后均按說明進(jìn)行避光、孵育、離心、洗滌。用500 μl 流式染色緩沖液重懸，上機(jī)檢測，熒光數(shù)據(jù)的獲得以熒光強(qiáng)度 ＞ 3000 個(gè)個(gè)體細(xì)胞為陽性，結(jié)果最終以每個(gè)細(xì)胞的平均熒光強(qiáng)度表示。

4.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 26.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，采用均數(shù) ± 標(biāo)準(zhǔn)差(±SD)表示，獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)用于評估HZ 和對照組之間各淋巴細(xì)胞亞群、Treg 細(xì)胞、Th17 細(xì)胞和Treg/Th17 細(xì)胞比率的差異。使用Pearson 相關(guān)測試分析Treg/Th17 與發(fā)病時(shí)間的關(guān)系。P＜ 0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1.PHN 組和對照組外周血中各淋巴細(xì)胞亞群比較

將對照組和PHN 組外周血中各淋巴細(xì)胞亞群數(shù)量進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)PHN 組的CD4+細(xì)胞(23.11±7.38)少 于 對 照 組(29.55±10.54)，而PHN 組CD8+細(xì)胞(46.98±7.9)多于對照組(42.39±8.34)，PHN 組CD8+/CD4+細(xì)胞比率(2.32±1.1)高于對照組(2.32±1.1)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜ 0.05，見圖1、圖3）。

圖1 PHN 組和對照組各淋巴細(xì)胞亞群百分比(±SD)Fig.1 Percentages of each lymphocyte subset in the PHN group and control group (±SD)

2.PHN 組和對照組外周血中的Treg 和Th17 細(xì)胞計(jì)數(shù)比較

對照組和PHN 組外周血中的Treg 細(xì)胞和Th17 細(xì)胞數(shù)量進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)PHN 組的Treg 細(xì)胞(4.23%±2.27%)多于對照組(3.09%±1.61%)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜ 0.05)。且與對照組(0.94%±0.98%)相比，PHN 組的Th17 細(xì)胞(1.58%±1.08%)增多（見圖2）。為了進(jìn)一步研究兩個(gè)T 細(xì)胞亞群之間的平衡，計(jì)算了Treg 細(xì)胞與Th17 細(xì)胞的比率。PHN 組Th17/Treg 細(xì)胞比率(0.92±1.07)顯著高于對照組(0.38±0.36)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜ 0.05，見圖3）。PHN 組與對照組外周血Treg 細(xì)胞的流式細(xì)胞結(jié)果圖見圖4。PHN 組與對照組外周血Th17 細(xì)胞的流式細(xì)胞結(jié)果圖見圖5。

圖2 PHN 組和對照組Treg 細(xì)胞與Th17 細(xì)胞百分比(±SD)Fig.2 Percentages of Treg cells and Th17 cells in the PHN group and control group (±SD)

圖3 PHN 組和對照組Treg/Th17 與CD8+/CD4+比率(±SD)Fig.3 Treg/Th17 and CD8+/CD4+ ratios in PHN group and control group (±SD)

圖4 PHN 組和對照組外周血Treg 水平的流式細(xì)胞圖像對比Fig.4 Flow cytometric comparison of peripheral blood Treg levels between PHN group and control group

圖5 PHN 組和對照組外周血Th17 水平的流式細(xì)胞圖像對比Fig.5 Flow cytometric comparison of Th17 levels in peripheral blood between PHN group and control group

3.PHN 病人Th17/Treg 與PHN 發(fā)病時(shí)間的相關(guān)性分析

48 例PHN 病人中，平均發(fā)病時(shí)間為(37.8±3.5)天，經(jīng)Pearson 相關(guān)性分析顯示，PHN 病人外周血中Th17/Treg 與發(fā)病時(shí)間呈正相關(guān)（r= 0.738，P＜0.01，見圖6）。

圖6 PHN 病人Treg/Th17 與發(fā)病時(shí)間的相關(guān)性分析Fig.6 Correlation analysis between Treg/Th17 and time of onset in patients with postherpetic neuralgia

討 論

PHN 是VZV 病毒感染神經(jīng)系統(tǒng)的一種長期并發(fā)癥，5%～30%的HZ 病人在皮疹后的神經(jīng)損傷中會(huì)遭受PHN 帶來的劇痛[6]。研究表明PHN 的發(fā)生與機(jī)體細(xì)胞免疫紊亂、被異常抑制相關(guān)[7]。免疫功能與HZ 及其后遺神經(jīng)痛的發(fā)生有關(guān)，免疫系統(tǒng)的功能低下可能會(huì)導(dǎo)致VZV的再次激活和HZ的發(fā)生。老年人、免疫系統(tǒng)功能減弱的人、器官移植病人、艾滋病病毒感染者等人群更容易患HZ。有研究顯示HZ 病人IgG、IgM 和IgA 水平均較同年齡段健康體檢人群明顯下降，這提示HZ 病人存在體液免疫功能下降[8]。最近一項(xiàng)研究顯示，在新型冠狀病毒大流行期間，HZ 病人病例大幅增加，這更提示我們免疫功能的減弱可能是誘發(fā)HZ 的原因[9]。

原始CD4+T 細(xì)胞可以在某些條件下分化為Th1、Th2、Treg 和Th17 細(xì)胞并產(chǎn)生各種介導(dǎo)免疫反應(yīng)的細(xì)胞因子。轉(zhuǎn)化生長因子TGF-β 誘導(dǎo)原始CD4+T細(xì)胞分化為Treg 細(xì)胞，以產(chǎn)生TGF-β 和IL-10，減少炎癥反應(yīng)。IL-6 誘導(dǎo)原始CD4+T 細(xì)胞分化為Th17，使其產(chǎn)生IL-17、IL-23 并增加炎癥反應(yīng)，同時(shí)抑制原始CD4+T 細(xì)胞分化為Treg 細(xì)胞?？梢哉fIL-6 是Treg 細(xì)胞與Th17 細(xì)胞之間平衡的調(diào)節(jié)器[10]。一項(xiàng)單中心回顧性研究結(jié)果顯示，與對照組相比，PHN 病人的IL-6 水平更高，且血清中IL-6 水平可以用作PHN嚴(yán)重程度的生化指標(biāo)[11]。這可能意味著，隨著IL-6 的升高，Th17 細(xì)胞的數(shù)量增加，導(dǎo)致了更嚴(yán)重的炎癥反應(yīng)。

Treg 分化和Th17 分化是相關(guān)的過程，兩個(gè)T 細(xì)胞亞群在維持免疫系統(tǒng)穩(wěn)態(tài)方面發(fā)揮著重要作用。Xue-Song 等[12]研究也證實(shí)了Treg 細(xì)胞和Th17 細(xì)胞在病毒感染性疾?。ㄈ缏愿窝祝┲械淖饔?，并表明Treg 細(xì)胞和Th17 細(xì)胞之間的平衡失調(diào)可能在疾病進(jìn)展和病毒持續(xù)性中發(fā)揮重要作用。

已有研究結(jié)果顯示，PHN 病人外周血中Treg細(xì)胞的數(shù)量顯著高于正常對照組，并隨著疼痛嚴(yán)重程度的增加而增加[13]。本研究表明，HZ 病人的免疫力受損，Treg 細(xì)胞的數(shù)量增加可能會(huì)抑制CD4+T細(xì)胞的抗病毒免疫反應(yīng)。由此可以推斷Treg 細(xì)胞可能在HZ 的發(fā)病機(jī)制和PHN 進(jìn)展中發(fā)揮重要作用[13]。本研究檢測了病人外周血中Treg、Th17 細(xì)胞數(shù)量并計(jì)算了Treg/Th17，探討了與健康對照人群相比，Th17 和Treg 兩種細(xì)胞的數(shù)量變化及是否存在平衡失調(diào)的情況。結(jié)果顯示，與對照組相比PHN病人外周血中Treg 細(xì)胞的數(shù)量顯著增加，Th17 細(xì)胞數(shù)量顯著增加。且PHN 病人Treg/Th17 明顯高于對照組。本研究還統(tǒng)計(jì)了PHN 病人與健康對照者外周血中各淋巴細(xì)胞亞群水平，結(jié)果顯示與對照組相比，PHN 病人外周血中CD4+細(xì)胞顯著減少，CD8+細(xì)胞顯著增多，PHN 組CD8+/CD4+細(xì)胞比率顯著升高。本研究結(jié)果表明抗病毒的免疫反應(yīng)隨著Treg 細(xì)胞的增加而減少，且導(dǎo)致疾病爆發(fā)后CD4+細(xì)胞的相對減少。此外，隨著Th17 細(xì)胞的增加，免疫炎癥反應(yīng)也隨之增加，這可能是導(dǎo)致神經(jīng)損傷并進(jìn)一步導(dǎo)致PHN 的原因。此外，我們認(rèn)為Treg細(xì)胞與Th17 細(xì)胞在HZ 疾病發(fā)展的不同時(shí)間段發(fā)揮不同的作用，Treg 細(xì)胞的增加可能與HZ 急性期VZV 的持續(xù)復(fù)制且進(jìn)一步造成PHN 有關(guān)，而Th17細(xì)胞的數(shù)量可能與PHN 的疼痛程度及累計(jì)范圍呈正相關(guān)。

已有研究顯示，HZ 病人Treg/Th17 與PHN 的疼痛程度呈負(fù)相關(guān)[14]。本研究結(jié)果顯示，Treg/Th17與PHN 病人的發(fā)病時(shí)間呈正相關(guān)。這可能意味著在疾病的進(jìn)程中，隨著Treg 細(xì)胞的相對增加，其帶來的免疫抑制效應(yīng)也增加，抗病毒的免疫反應(yīng)相對減少，使得VZV 病毒更長時(shí)間地在外周血中復(fù)制，延長病程。另外，據(jù)既往研究表明，在炎癥因子的誘導(dǎo)下，Th17 細(xì)胞與Treg 細(xì)胞間存在相互轉(zhuǎn)化[15]。本研究結(jié)果也顯示，PHN 病人外周血中Treg/Th17隨著時(shí)間的推移而上升，這意味著Treg 的相對增加。這可能與這兩個(gè)T 細(xì)胞子集的可塑性有關(guān)，其中Th17 細(xì)胞可能在炎癥細(xì)胞因子的作用下轉(zhuǎn)化為Treg 細(xì)胞[16]。一項(xiàng)研究也表明在風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎病人外周血中，病理性的Th17 細(xì)胞可以轉(zhuǎn)化Treg 細(xì)胞，發(fā)揮抗炎的功能[17]。且已有研究證明，Treg 細(xì)胞與Th17 細(xì)胞之間存在一種CD4+Foxp3+IL-17+的中間型細(xì)胞，這也為兩者之間的轉(zhuǎn)化提供有力的證據(jù)[18]。是否在PHN 病人外周血中存在Th17 向Treg細(xì)胞轉(zhuǎn)化，使外周血中Treg 數(shù)量上升，導(dǎo)致后遺神經(jīng)痛病程的延長呢？這一點(diǎn)仍需我們的后期研究得以闡明。

本研究局限性在于，所采集樣本量較少，且已知Treg 細(xì)胞隨年齡增加而增加，在探究Treg/Th17與發(fā)病時(shí)間相關(guān)性時(shí)，未考慮PHN 組內(nèi)年齡因素。另外，本研究僅能證實(shí)Treg/Th17 與發(fā)病時(shí)間呈正相關(guān)，無法得出PHN 病人因Treg/Th17 的升高而發(fā)病時(shí)間延長的結(jié)論。

綜上所述，機(jī)體免疫功能失衡可能是PHN 發(fā)病的重要原因，而Treg/Th17 細(xì)胞的比例失衡可能是機(jī)體復(fù)雜的免疫調(diào)節(jié)中關(guān)鍵一環(huán)。且本研究可初步確定，Treg/Th17 細(xì)胞的比例失衡與PHN 發(fā)病時(shí)間呈正相關(guān)，PHN 病人Treg 細(xì)胞的相對升高可能與Th17 細(xì)胞向Treg 細(xì)胞的轉(zhuǎn)化有關(guān)，但具體機(jī)制仍不明確，需要后續(xù)研究進(jìn)行驗(yàn)證。

利益沖突聲明：作者聲明本文無利益沖突。