梁 云,牛首瑞,劉露露,邱金珠,魏淑東,任亞輝,宋 巍

(1.長江大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院,湖北 荊州 433200;2.河南城建學(xué)院 生命科學(xué)與工程學(xué)院,河南 平頂山 467000)

中藥在我國具有悠久的歷史[1],最早可追溯至五千年前的神農(nóng)氏時期,千百年來中藥在我國的醫(yī)療衛(wèi)生方面發(fā)揮了重要作用[2]。中藥的主要來源為天然藥物及其加工產(chǎn)品[3],分為植物藥、動物藥、礦物藥及部分化學(xué)、生物制品類藥物。

動物膽汁作為我國傳統(tǒng)的中藥材,在疾病治療方面發(fā)揮著不可小覷的作用[4]。動物膽汁多味苦、性寒,具有清熱解毒、止咳、通便等功效[5]。常見的動物膽有豬膽[6]、熊膽[7]、蛇膽[8]、牛膽和羊膽等,它們在止咳、清熱解毒和提高免疫力等方面具有顯著效果[9]。目前國內(nèi)外對動物膽汁的理化性質(zhì)及其藥理作用的研究主要集中在熊膽、蛇膽和豬膽,而對兔膽的研究鮮有報道。在市場中,也見到過由動物膽開發(fā)出的藥物,如霍膽丸、熊膽含片及八寶五膽藥墨等,由兔膽開發(fā)出的藥物卻寥寥無幾。

近年來,人們對于兔肉、兔皮毛、寵物兔等的需求越來越高,導(dǎo)致兔產(chǎn)業(yè)發(fā)展迅速[10],但是對于兔副產(chǎn)品的開發(fā)利用卻仍然較少。兔膽作為兔的副產(chǎn)品之一,被大量丟棄,造成極大浪費[11]。據(jù)研究報道,兔膽不僅具有止咳、止痛、消炎、鎮(zhèn)靜、抗驚厥以及保護心肌等作用[12-13],而且有望成為常用的中藥材。以兔膽為主要原料研發(fā)的各種治療藥品以及保健產(chǎn)品,可為兔膽的利用提供更多的可能性。本文對兔膽汁的止咳效果進行研究,并致力于開發(fā)出一種具有顯著止咳效果的復(fù)方兔膽止咳露,為兔膽的開發(fā)利用提供科學(xué)的理論基礎(chǔ)以及選擇方向,更好地實現(xiàn)開發(fā)兔膽資源的目的。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

昆明種小白鼠,體重(20±1.0)g,雌雄各半,均購于河南省動物實驗中心。兔膽購于平頂山市新華區(qū)綜合農(nóng)貿(mào)市場,蜂蜜、薄荷葉、川貝、枇杷葉、百合、蛇膽川貝枇杷膏均購于張仲景大藥房。氨水為化學(xué)純。

1.2 儀器與設(shè)備

N-1300D-W型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀:東京理化公司;18N/A型冷凍干燥機:寧波新芝生物科技股份有限公司;Performance-86立式超低溫冰箱:賽默飛世爾公司。

1.3 兔膽粉的制備

取新鮮兔膽剪碎,收集膽汁后用雙層紗布脫脂。脫脂后倒入大皿,每皿不得超過皿容積的2/3,用保鮮膜密封后放入-20 ℃冰箱2 h,待液體完全冷凍,再移入-80 ℃冷凍,6 h后取出,在密封的保鮮膜上扎孔,迅速放入預(yù)冷的冷凍干燥機。密閉冷凍干燥機,開啟真空泵,進行冷凍干燥[14],48 h后迅速取出,研磨成粉末狀,密封,4 ℃下保存。

1.4 中藥水提物的制備

分別稱取等量的中藥材,用蒸餾水將300 g中藥材浸泡30 min后,將浸泡好的中藥材與1 500 mL蒸餾水一起倒入砂鍋,武火煎煮45～60 min后用文火煎煮30～45 min。煎煮至砂鍋中液體剩余200～250 mL倒出[15]。冷卻至室溫,用真空泵抽濾后,倒入大皿中分裝,再用冷凍干燥機冷凍干燥制成粉末。

1.5 復(fù)方兔膽制劑的制備

1.6 氨水引咳法

參考文獻[16]的方法,略加改進。昆明小鼠,雌雄各半,每組10只,隨機分為PBS組,陽性對照組,兔膽粉低劑量組(0.4 g/kg)、中劑量組(0.6 g/kg)、高劑量組(0.8 g/kg),復(fù)方兔膽制劑低比例組(15)、中比例組(25)、高比例組(45)等8組。每日灌胃給藥1次,連續(xù)5 d,末次給藥l h后,將小鼠放入實驗室自制噴霧箱內(nèi),之后開動霧化器,待氨水呈霧狀噴入水箱20 s后,取出小鼠,置于清潔大燒杯內(nèi),對小鼠的咳嗽潛伏期 (以小鼠腹肌收縮,并張口吐舌作為咳嗽指標(biāo))和3 min內(nèi)的咳嗽次數(shù)進行觀察記錄。

1.7 止咳實驗

參照文獻[17]和[18]的方法,略加改進。昆明小鼠,雌雄各半,隨機分成陰性對照組、陽性對照組、受試藥物組,每組10只。陰性對照組加入PBS,陽性對照組按25 mg/kg劑量給予蛇膽川貝枇杷膏,受試藥物組分別為低劑量組(0.4 g/kg)、中劑量組(0.6 g/kg)、高劑量組(0.8 g/kg)的劑量給予兔膽粉和比例分別為低比例組(15)、中比例組(25)、高比例組(45)的劑量給予復(fù)方兔膽制劑。在第5 d給藥1 h后用3.1%的氨水噴霧刺激,預(yù)先設(shè)定一個刺激時間20 s,刺激后觀察小鼠出現(xiàn)典型的咳嗽次數(shù),若咳嗽次數(shù)大于或等于3次,即記為有咳嗽;若小于3次,則記為無咳嗽。用序貫法(上下法)的原理求算小鼠半數(shù)引咳的噴霧時間(EDT50)。即若前一只小鼠未有咳嗽,則后一只就用低一級的時間刺激;相反則后一只小鼠用高一級的時間刺激,相鄰兩個刺激時間的對數(shù)差取0.08。

EDT50=lg-1c/n

式中:n為動物數(shù);c為rx值的總和;r為每劑量組的動物數(shù);x為劑量(即噴霧時間)的對數(shù)。

根據(jù)各組的EDT50計算R值,R=實驗組EDT50/陰性對照組EDT50,R≥130%則認(rèn)為有鎮(zhèn)咳作用,R≥150%則鎮(zhèn)咳作用顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 兔膽粉止咳效果的研究

在探究單獨兔膽粉的止咳效果的研究中,如表1所示,陽性對照組和低劑量組(0.4 g/kg)、中劑量組(0.6 g/kg)、高劑量組(0.8 g/kg)的EDT50分別為35.403 8、32.888 2、41.787 3、31.286 5,根據(jù)各組的EDT50值與陰性對照組的EDT50比值計算出R值。結(jié)果如圖1所示,陽性對照組和中劑量組(0.6 g/kg)的R值分別為139.32%、164.41%,大于130%,表明具有止咳效果,其中中劑量組(0.6 g/kg)的R值大于150%,表明其具有顯著鎮(zhèn)咳作用。低劑量組(0.4 g/kg)和高劑量組(0.8 g/kg)的R值分別為129.42%、123.11%,均小于130%,表明其不具有止咳效果。

表1 兔膽粉止咳實驗結(jié)果

圖1 不同膽粉濃度的R值

2.2 兔膽復(fù)方止咳露的止咳效果研究

在探究兔膽與中藥的最佳止咳效果復(fù)方制劑的止咳實驗中,兔膽和中藥的比例分別為低比例組(15)、中比例組(25)、高比例組(45),各中藥之間的比例為11111。采用藥物蛇膽川貝枇杷膏作為陽性對照,如表2所示,陽性對照組和低比例組(15)、中比例組(25)、高比例組(45)的EDT50分別為45.818 4、45.818 4、45.818 4、39.541 2,根據(jù)各組的EDT50值與陰性對照組的EDT50比值計算出R值。結(jié)果如圖2所示,陽性對照組、低比例組(15)、中比例組(25)、高比例組(45)的R值分別為187.06%、187.06%、187.06%、161.43%,均大于150%,表明其均具有顯著鎮(zhèn)咳效果。另外低比例組(15)和中比例組(25)與陽性對照組的止咳效果相一致。

表2 復(fù)方制劑止咳實驗結(jié)果

圖2 兔膽粉與中藥不同比例組R值

3 結(jié)論

鑒于膽酸具有清熱解毒功效[19],兔膽在止咳方面的開發(fā)利用有待進一步研究。在探究單獨兔膽粉的止咳效果時,低劑量組(0.4 g/kg)和高劑量組(0.8 g/kg)的R值分別為129.42%、123.11%,均小于130%,表明其不具有止咳效果。而陽性對照組和中劑量組(0.6 g/kg)的R值分別為139.32%、164.41%,均大于130%,表明有止咳作用,其中中劑量組(0.6 g/kg)的R值大于150%,表明其具有顯著鎮(zhèn)咳作用。

單味中藥雖具有止咳功效,但復(fù)方制劑在止咳方面具有更好的表現(xiàn)。本文參考蛇膽川貝止咳糖漿中膽汁與中藥的比例設(shè)置了比例范圍,用蛇膽川貝枇杷膏作為陽性對照,陽性對照組、低比例組(15)、中比例組(25)、高比例組(45)的R值分別為187.06%、187.06%、187.06%、161.43%,均大于150%,表明其均具有顯著鎮(zhèn)咳效果。

將兔膽粉組的R值與復(fù)方制劑組的R值相比較發(fā)現(xiàn),復(fù)方制劑組的止咳效果明顯優(yōu)于兔膽粉單獨作用的止咳效果。這可能是因為復(fù)方兔膽止咳制劑的每種成分都具有止咳功效,且不同成分之間具有協(xié)同效果[20]。各個成分具體如何發(fā)揮協(xié)同作用,仍需進一步研究。

通過一系列實驗發(fā)現(xiàn),兔膽粉給藥量在0.6 g/kg時,對小鼠有顯著鎮(zhèn)咳效果,在與中藥混合后,兔膽粉與中藥的比例在15和25之間時具有顯著鎮(zhèn)咳效果,當(dāng)比例大于45時,鎮(zhèn)咳效果會減弱。整體來說,復(fù)方制劑對小鼠的止咳效果優(yōu)于兔膽粉作用的止咳效果,復(fù)方兔膽止咳露具有顯著的止咳效果,這為復(fù)方兔膽止咳露的新藥開發(fā)奠定了一定的基礎(chǔ),為兔膽的資源利用提供了理論依據(jù)。