張軍政,靳淑博,楊治廣,陳 碩,郝晴圓,楊靜也,王晨曦,賀曉曉,孫文浩,孔令展

(河南城建學院 河南省水體污染防治與修復重點實驗室,河南 平頂山 467000)

隨著科學技術(shù)的不斷創(chuàng)新和發(fā)展,越來越多的新化合物被合成出來,這些化合物的出現(xiàn)對于人類有利有弊,對環(huán)境也如此。其對環(huán)境會產(chǎn)生什么樣的影響需要通過實驗進行判斷。

水蚤(大型蚤)具有個體小、繁殖快、易獲取、便于操作、二次處理量小等優(yōu)點,利用水蚤對水生生物安全的影響進行評價是一種快速高效的途徑。張晶晶等[1]對比了吡丙醚、氟鈴脲、除蟲脲、滅蠅胺、噻嗪酮、蟲酰肼6種昆蟲生長調(diào)節(jié)劑以及吡蟲啉、三唑磷、高效氯氰菊酯、氟蟲腈、丁硫克百威原藥5種殺蟲劑對大型蚤的急性毒性。Claudia等[2]研究并建立了農(nóng)藥對大型蚤的急性毒性模型。Tinkov等[3]研究了有機化合物結(jié)構(gòu)對大型蚤急性毒性的影響。Xu等[4]研究了塑料顆粒對大型蚤的急性毒性。王倓倓[5]研究了多氯聯(lián)苯醚在巢湖中分布特征及其在大型蚤體內(nèi)的富集轉(zhuǎn)化和毒性效應。高磊[6]研究了印染廢水的生物毒性測試方法。王娜[7]及胡奕[8]研究了納米銀對大型蚤毒性的影響。堵錫華等[9]研究了苯砜基乙酸酯類化合物對大型蚤急性毒性的結(jié)構(gòu)信息指數(shù)。李渭印等[10]進行了次氯酸鈉、表面活性劑、苯酚對大型蚤的急性毒性研究。李建鳳等[11]對芳烴類化合物結(jié)構(gòu)與大型蚤急性毒性關(guān)系進行了相關(guān)的研究。廉潔等[12]探究了三氯生對蚤狀溞急性毒性。

十二烷基三甲基氯化銨是一種無色或淡黃色膠體,化學式C15H34NCl,可溶于水和乙醇。它的化學穩(wěn)定性良好,耐熱、耐光、耐壓、耐強酸強堿,具有優(yōu)良的滲透性、乳化性、柔軟性、抗靜電性和殺菌性能,因此在化工等領(lǐng)域使用較為廣泛。十二烷基三甲基氯化銨在使用過程中會通過各種途徑進入自然水體,對水生態(tài)產(chǎn)生影響。利用水體中常用的指示生物水蚤探究十二烷基三甲基氯化銨對水生生物的影響較為方便安全,同時與利用個體較大的魚等動物相比還能節(jié)約資源,保護環(huán)境。

1 材料與方法

1.1 試驗蚤種

試驗水蚤為河北省邢臺市魚藝傳統(tǒng)金魚漁場引種并在實驗室經(jīng)過3年穩(wěn)定馴化培養(yǎng)后的水蚤。隨機選取20只健康母蚤,將母蚤置于水族箱中進行繁殖培養(yǎng),培養(yǎng)水采用靜置3 d的自來水,水族箱置于陽光散射光能夠照射到的地方,用小球藻喂養(yǎng)。種群密度為每升水約50只,溫度為室溫。經(jīng)過母蚤孤雌生殖純系培養(yǎng)3代以后,選用培養(yǎng)3代以上的健康幼蚤為試驗蚤。

1.2 試驗試劑

重鉻酸鉀為河北省保定化學試劑廠生產(chǎn)的分析純試劑,十二烷基三甲基氯化銨為天津市光復精細化工研究所生產(chǎn)的分析純試劑。

1.3 試驗儀器設備

水族箱材質(zhì)為有機玻璃,規(guī)格為900 mm×600 mm×300 mm;分組試驗采用100 mL常規(guī)玻璃燒杯;藥品和水蚤的稱量使用萬分之一電子分析天平。

1.4 試驗方法

參考《GB/T 16125—2012大型溞急性毒性實驗方法》進行相關(guān)試驗。試驗期間不喂食,定時觀察記錄水蚤的死亡數(shù),以水蚤心臟停止跳動為死亡標準,得出半致死濃度24 h LC50。

1.5 試驗蚤的敏感性測試

采用國際標準《水質(zhì)——大型蚤運動抑制的測定》(ISO6341:1996)進行敏感性測試。以重鉻酸鉀作為敏感性測定毒物,對水蚤進行24 h LC50測試試驗,檢驗所用水蚤是否符合敏感性要求。重鉻酸鉀對水蚤的急性毒性試驗結(jié)果見表1。3次試驗水蚤的24 h LC50平均值為1.304 mg/L,3次試驗濃度變化較小,誤差為0.54%,說明試驗水蚤具有非常好的重復性與穩(wěn)定性。重鉻酸鉀對水蚤24 h有效濃度的國際標準值為0.9～2.0 mg/L,說明所用水蚤的敏感性符合試驗要求。

表1 重鉻酸鉀對水蚤的急性毒性試驗

1.6 十二烷基三甲基氯化銨試驗濃度預實驗

采用靜置3 d的自來水為培養(yǎng)水體,十二烷基三甲基氯化銨水溶液濃度0.10 mg/L、1.00 mg/L為預實驗濃度,經(jīng)24 h急性毒性試驗后,0.10 mg/L濃度條件下的30只水蚤死亡1只,1.00 mg/L濃度條件下30只水蚤全部死亡。因此,十二烷基三甲基氯化銨對水蚤的急性毒性效應濃度按對數(shù)濃度設定為:0.00 mg/L、0.10 mg/L、0.16 mg/L、0.25 mg/L、0.40 mg/L、0.63 mg/L、1.00 mg/L。

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析方法

根據(jù)受試物濃度與水蚤死亡數(shù),利用統(tǒng)計軟件SPSS 26(IBM SPSS Statistics 26),結(jié)合數(shù)據(jù)繪圖工具Origin 2021和Microsoft Office Excel 2016對實驗結(jié)果進行繪圖分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 十二烷基三甲基氯化銨對水蚤的急性毒性效應

采用靜置3 d的自來水為培養(yǎng)水體,十二烷基三甲基氯化銨線性對數(shù)濃度0.10～1.00 mg/L為試驗濃度,24 h急性毒性試驗濃度與水蚤死亡數(shù)關(guān)系如圖1所示。

圖1 24 h濃度與水蚤死亡數(shù)關(guān)系圖

空白對照組30只水蚤生長正常,未有死亡現(xiàn)象,說明所用培養(yǎng)水體對水蚤生長代謝不會產(chǎn)生毒性作用,在十二烷基三甲基氯化銨溶液濃度為0.10 mg/L時24 h死亡數(shù)為1只,由圖1可以看出,水蚤死亡數(shù)隨著十二烷基三甲基氯化銨溶液濃度的變大而增加。濃度為0.10～0.25 mg/L時,水蚤死亡數(shù)低于3,說明在此濃度范圍內(nèi)水蚤對十二烷基三甲基氯化銨不敏感。當溶液濃度增加到0.40 mg/L時,水蚤死亡數(shù)從3指數(shù)式快速增大到9,說明水蚤對十二烷基三甲基氯化銨的敏感性突然增大。濃度為0.63 mg/L時,水蚤死亡數(shù)為21只。濃度為1.00 mg/L時,30只水蚤全部死亡。

不同濃度的十二烷基三甲基氯化銨在不同時間段內(nèi)對水蚤的影響如圖2所示。前4 h內(nèi)水蚤的死亡數(shù)基本為0,說明在前4 h內(nèi)水蚤對十二烷基三甲基氯化銨的敏感性較低。從第4 h到第8 h的這段時間,在濃度為0.63 mg/L和1.00 mg/L的條件下水蚤死亡數(shù)分別從1、2增加到7、23,水蚤死亡數(shù)量的突然增大說明水蚤對十二烷基三甲基氯化銨的耐受性在8 h左右,且從第8 h到24 h時間段內(nèi)濃度越高水蚤的死亡數(shù)越高。

圖2 不同濃度不同時間段水蚤死亡數(shù)的關(guān)系圖

圖3是16 h和24 h水蚤死亡數(shù)隨濃度的變化與指數(shù)Exp3P2模型曲線。由圖3a可以看出,16 h的兩條曲線幾乎重合,說明水蚤的死亡數(shù)隨著十二烷基三甲基氯化銨溶液濃度的增大呈指數(shù)增長。由圖3b可以看出,十二烷基三甲基氯化銨溶液濃度為0.10～0.63 mg/L時,其水蚤的死亡曲線與指數(shù)擬合曲線幾乎重合,溶液濃度為1.00 mg/L時水蚤的死亡數(shù)低于指數(shù)擬合曲線,水蚤試驗數(shù)由30只改為60只,相同條件下試驗發(fā)現(xiàn)60只水蚤也全部死亡,說明試驗時間為24 h、溶液濃度為1.00 mg/L的條件下,水蚤的死亡數(shù)與指數(shù)擬合曲線偏離較大的原因是試驗水蚤的樣本數(shù)量不同。

a 16 h

16 h和24 h水蚤死亡數(shù)與溶液濃度之間的關(guān)系可用指數(shù)Exp3P2模型描述,其指數(shù)擬合曲線方程為

y=ea+bx+cx2

(1)

其中16 h和24 h指數(shù)擬合曲線所對應方程(1)的具體參數(shù)值如表2所示。

表2 16 h和24 h對應方程(1)的具體參數(shù)值

由表2可知,16 h時R2值為0.999 29,表明水蚤的死亡數(shù)與十二烷基三甲基氯化銨溶液濃度在Exp3P2模型下擬合度非常高,說明水蚤的死亡數(shù)與溶液濃度之間的關(guān)系符合Exp3P2指數(shù)模型,水蚤的死亡數(shù)隨著溶液濃度的增大呈指數(shù)增長的趨勢。24 h同理可得,R2值為0.999 17,其擬合度也非常高,水蚤的死亡數(shù)也符合隨溶液濃度的增大呈指數(shù)增長的規(guī)律。

將表2數(shù)據(jù)輸入SPSS 26軟件所得結(jié)果如下:

(1) 卡方檢驗:由皮爾遜擬合優(yōu)度檢驗得,在樣品濃度不取對數(shù)時得到的卡方值為0.609;在樣品濃度取對數(shù)時得到的卡方值為11.638;卡方值越接近零時擬合效果越好,因此采用樣品濃度不取對數(shù)時的卡方值作為最終的檢驗值。

(2) 概率估算:由參數(shù)估算值得到線性回歸方程為:y=-2.388+4.717x,95%置信區(qū)間為3.513～5.921。概率為0.500時對應的估算值為0.506,下限值為0.451,上限值為0.576。

由內(nèi)插法計算十二烷基三甲基氯化銨轉(zhuǎn)換后概率響應如圖4所示,當y=0.5(概率為50%)時,x的值為0.625,即十二烷基三甲基氯化銨的24 h LC50=0.625 mg/L。說明十二烷基三甲基氯化銨在濃度為0.625 mg/L的條件下對水生生物即有較高毒性,對水生態(tài)影響較大。十二烷基三甲基氯化銨能溶解紅細胞,水蚤屬于枝角類動物,其血液含有血紅素,血紅素溶于血漿,肌肉、卵巢和腸壁的細胞中也含血紅素,因此十二烷基三甲基氯化銨可通過破壞血紅素對水蚤生長代謝產(chǎn)生影響,從而導致其死亡。

圖4 十二烷基三甲基氯化銨轉(zhuǎn)換后概率響應圖

2.2 水蚤急性毒性分級

樣品的急性毒性主要根據(jù)動物經(jīng)口、經(jīng)皮半數(shù)致死量(LD50)、吸入半數(shù)致死濃度(LC50)進行分級,由受試動物體重與樣品的半數(shù)致死量(濃度)進行評價。水體中污染物對動物的急性毒性分級不但與污染物濃度有關(guān),還與受試動物體重有關(guān)。

2.2.1 水蚤稱重實驗

水蚤稱重實驗設計兩種稱重方法。

方法一:將水蚤分為大水蚤(≥4 mm)、中水蚤(1～4 mm)、小水蚤(≤1 mm),如圖3所示。這3種水蚤分別隨機選取10只,用吸水紙將其表面水分吸干,用接種環(huán)將其移放至稱量紙上,稱量后記錄數(shù)據(jù)并將水蚤放回原處,再重新隨機選取10只水蚤,重復操作以上步驟,稱取10次,得到大水蚤、中水蚤、小水蚤稱量10次的數(shù)據(jù),分別求取平均值,再將得到的3組平均值求取平均值,為0.007 61 g。

方法二:不分大小隨機選取十只水蚤按照方法一的步驟進行稱重,稱取10次,求取平均值,為0.006 48 g。

由圖5可知,將水蚤實體用顯微鏡全部放大70倍,獲得的圖片經(jīng)測量得到隨機選取的大水蚤實際長度為5 mm。同理可得中水蚤實際長度為2 mm,小水蚤實際長度為1 mm。據(jù)此劃分大、中、小水蚤的范圍為:長度≤1 mm的水蚤劃分為小水蚤;長度在1～4 mm的水蚤劃分為中水蚤;長度≥4 mm的水蚤劃分為大水蚤。

小水蚤

在探究十二烷基三甲基氯化銨對水蚤影響的試驗中,每個燒杯的試驗蚤數(shù)量都是10只,因此將10只水蚤作為一個整體所得到的平均質(zhì)量用于后續(xù)步驟的比例縮放。將兩種方法所得10只水蚤平均質(zhì)量再取平均值(0.007 045 g),得到最終將用于后續(xù)推算步驟中使用的數(shù)值。

2.2.2 水蚤急性毒性分級推算

由于國家目前對藥品急性毒性的劃分是經(jīng)過大鼠或者小鼠實驗得到結(jié)果進行劃分,沒有通過水蚤急性毒性試驗進行劃分,所以根據(jù)目前已知的急性毒性分級推算得到以水蚤為研究對象的急性毒性分級。

推算步驟如下:根據(jù)前面水蚤稱重實驗所得10只水蚤平均質(zhì)量為0.006 67 g,用于急性毒性使用小鼠體重以18～25 g、大鼠180～240 g、豚鼠200～250 g、家兔2.0～2.5 kg、貓1.5～2.0 kg為宜。表3為工業(yè)毒物急性毒性分級標準。

表3 工業(yè)毒物急性毒性分級標準

將小鼠作為研究對象,用于急性毒性使用小鼠體重以18～25 g,取其平均值為21.5 g。10只水蚤平均質(zhì)量為0.007 045 g,即小鼠的平均質(zhì)量是10只水蚤平均質(zhì)量的3 052倍。由表4可知,小鼠吸入2 h不同毒性分級LC50值為已知。將這些數(shù)值乘以12得到的數(shù)值,再除以3 052即可得到新的毒性分級以及相對應的濃度范圍。將最終得到的數(shù)值作為水蚤在溶液中接觸24 h LC50值。結(jié)果如表4所示。十二烷基三甲基氯化銨的24 h LC50為0.625 mg/L,經(jīng)過查詢比對發(fā)現(xiàn)推算得到的十二烷基三甲基氯化銨毒性與其他實驗得到的結(jié)果基本一致,屬于高毒性物質(zhì)。

表4 新急性毒性劃分等級

李渭印等[10]研究了次氯酸鈉、表面活性劑、苯酚對大型蚤的急性毒性并根據(jù)相關(guān)毒性評價標準對次氯酸鈉、表面活性劑、苯酚進行等級劃分。其試驗結(jié)果表明次氯酸鈉、表面活性劑、苯酚對大型蚤的24 h LC50分別為0.216 mg/L、8.590 mg/L、41.295 mg/L。劃分結(jié)果為:次氯酸鈉屬于高毒等級,表面活性劑屬于中毒等級,苯酚屬于低毒等級。將其試驗結(jié)果按照表4急性毒性劃分等級進行毒性劃分,結(jié)果為:次氯酸鈉屬于高毒等級,表面活性劑屬于中等毒級,苯酚屬于低毒等級,所得結(jié)果和李渭印等得到的結(jié)果一致。

3 結(jié)論

以水蚤(大型蚤)為研究對象,探究了十二烷基三甲基氯化銨對水蚤的急性毒性影響,并設計相關(guān)試驗得到了以水蚤為研究對象的急性毒性劃分等級,結(jié)果如下:

(1)十二烷基三甲基氯化銨的24 h LC50值為0.625 mg/L,對應急性毒性劃分等級為高毒性,對水生生物毒性較高,如果進入自然水體中的濃度高于LC50值,將對水生態(tài)環(huán)境造成一定的負面影響,產(chǎn)生安全風險。

(2)對目前已知的急性毒性等級劃分進行改進,得到了以水蚤為研究對象的新的急性毒性劃分等級,并通過相關(guān)案例的對比驗證其準確性。

(3)水蚤的急性毒性試驗可以快捷方便地初步評估判斷水體中是否含有有毒有害物質(zhì)及其是否會對周圍生態(tài)環(huán)境產(chǎn)生一定的影響。