鐘國(guó)華,廖繼梅,彭方毅,姜海蓉,鐘詩淇

(1.重慶市奉節(jié)縣興隆鎮(zhèn)中心衛(wèi)生院,重慶 404604;2.重慶萊博科醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室,重慶 40003;3.重慶市公共衛(wèi)生醫(yī)療救治中心,重慶 400030;4.西南大學(xué),重慶 400715)

尿酸作為人體重要的一種代謝物,其在血清中的含量是反映人們身體情況的重要指標(biāo)。關(guān)于血清中尿酸含量的檢測(cè),部分學(xué)者也進(jìn)行了很多研究,如制備了海藻酸鈉-銀納米粒功能探針,用于尿酸的檢測(cè),結(jié)果表明:該比色探針環(huán)保,制備簡(jiǎn)單,特異性強(qiáng),穩(wěn)定性好,有望為尿酸臨床相關(guān)疾病的生化診斷提供一種新的檢測(cè)方法[1]。通過rGO/GCE修飾電極對(duì)尿酸進(jìn)行測(cè)試,結(jié)果表明:rGO/GCE修飾電極對(duì)尿酸的電催化氧化有明顯增強(qiáng)作用,表現(xiàn)出較好的檢測(cè)效果[2]。使用電化學(xué)法對(duì)血清中尿酸含量進(jìn)行分析,但由于生物樣品中尿酸和多巴胺的氧化電位相近,容易出現(xiàn)干擾的情況,使得檢測(cè)結(jié)果存在一定的誤差[3]。利用碳量子點(diǎn)(CDs)還原Ag離子,得到核殼結(jié)構(gòu)的Ag-CDs納米粒子,并以此為SERS基底,通過SERS光譜對(duì)尿酸濃度進(jìn)行檢測(cè)[4]。建立了以紙芯片為分析平臺(tái)的尿酸含量快速檢測(cè)方法,并對(duì)其檢測(cè)效果進(jìn)行研究,結(jié)果表明:該方法用于血清中尿酸檢測(cè)時(shí),表現(xiàn)出良好的檢測(cè)效果,且15種共存物質(zhì)在允許誤差范圍內(nèi)均無干擾,可用于血清中尿酸含量檢測(cè)[5]?；诖?本試驗(yàn)以文獻(xiàn)[6]的方法為參考,制備了一種新型熒光納米材料用于血清中尿酸的檢測(cè)。

1 試驗(yàn)部分

1.1 材料與設(shè)備

主要材料:魯米諾(AR),博杰生物科技;硝酸鋱(AR),中航新材料;醋酸-醋酸鈉緩沖液(AR),尚寶生物科技);尿酸標(biāo)液(AR),信康醫(yī)藥化工。

主要設(shè)備:VORTEX-6型渦旋振蕩器(歐萊博技術(shù));SNE-3200M型掃描電鏡(武訓(xùn)科技);HT7800型透射電鏡(莊潤(rùn)國(guó)際貿(mào)易);F-380型熒光發(fā)光光譜儀(今時(shí)邁科技)。

1.2 化學(xué)合成方法

1.2.1熒光納米材料的制備

(1)將一定量魯米諾固體放入燒杯中,然后逐步加入濃度為0.2 mol/L氫氧化鈉溶液,添加量為剛好溶解魯米諾固體,然后通過超純水將魯米諾溶液稀釋至指定的濃度體積;

(2)將10 μL濃度為0.025 mmol/L魯米諾溶液和50 μL濃度為0.125 mmol/L的硝酸鋱溶液混合反應(yīng)10 min,得到熒光納米材料。

1.2.2尿酸的檢測(cè)

在熒光納米材料中依次放入200 μL濃度為0.2 mol/L,一定pH值的緩沖溶液、不同濃度的尿酸,并用超純水將溶液體積定容至1 mL左右,設(shè)置好反應(yīng)溫度后,在VORTEX-6型渦旋振蕩器的作用下進(jìn)行充分混合反應(yīng)一段時(shí)間,然后對(duì)熒光信號(hào)進(jìn)行檢測(cè)。

1.3 性能測(cè)試

1.3.1微觀結(jié)構(gòu)表征

通過SNE-3200M型掃描電鏡和HT7800型透射電鏡對(duì)熒光納米材料的微觀形貌結(jié)構(gòu)進(jìn)行表征。

1.3.2熒光強(qiáng)度測(cè)試

通過熒光發(fā)光光譜儀測(cè)試材料的熒光強(qiáng)度。

熒光強(qiáng)度猝滅率表達(dá)式[7-8]:

δ=(I0-I)/I0×100%

(1)

式中:δ為熒光強(qiáng)度猝滅率,%;I0、I分別為未添加、添加了尿酸的熒光納米材料的熒光信號(hào)強(qiáng)度,a.u.。

1.3.3線性關(guān)系確定

對(duì)添加了不同濃度尿酸的熒光納米材料熒光強(qiáng)度進(jìn)行測(cè)試,確定方法的標(biāo)準(zhǔn)曲線。以空白樣品熒光強(qiáng)度檢測(cè)值的3倍作為方法檢測(cè)限。

1.3.4選擇性分析

在熒光納米材料中分別放入尿酸、常見金屬陽離子和小分子,觀察不同離子和分子對(duì)熒光納米材料熒光強(qiáng)度猝滅率的影響。

1.3.5實(shí)際樣品檢測(cè)

在實(shí)際樣品中添加不同濃度的尿酸標(biāo)準(zhǔn)溶液,通過實(shí)際樣品的平均加標(biāo)回收率表征熒光納米材料用于尿酸檢測(cè)的可行性。

2 結(jié)果與討論

2.1 熒光納米材料表征

2.1.1熒光效果分析

對(duì)納米材料熒光效果進(jìn)行分析,結(jié)果如圖1所示。

圖1 熒光發(fā)射光譜圖

由圖1可知,在激發(fā)波長(zhǎng)為290 nm的條件下,魯米諾溶液的最大發(fā)射波長(zhǎng)為430 nm,溶液發(fā)出微弱藍(lán)色熒光。相同激發(fā)波長(zhǎng)條件下,熒光納米材料熒光強(qiáng)度達(dá)到了魯米諾溶液的40倍,溶液發(fā)出較強(qiáng)的藍(lán)色熒光。這說明魯米諾顆粒聚集后,在聚集誘導(dǎo)發(fā)光的作用下,使得納米熒光材料表現(xiàn)出較好的熒光強(qiáng)度[9-10]。在納米熒光材料中加入50 μL尿酸溶液后,熒光納米材料熒光強(qiáng)度被猝滅了約31.4%,這說明尿酸與納米熒光材料間存在光誘導(dǎo)電子轉(zhuǎn)移,使得納米熒光材料熒光強(qiáng)度被猝滅,出現(xiàn)較明顯的信號(hào)變化[11]。以上變化說明了通過熒光納米材料檢測(cè)尿酸是可行的。

2.1.2光穩(wěn)定性試驗(yàn)

圖2為光穩(wěn)定性測(cè)試結(jié)果。

圖2 光穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果

由圖2可知,經(jīng)過42 d冷凍放置后,熒光材料的熒光信號(hào)不發(fā)生改變,表現(xiàn)出良好的光穩(wěn)定性。

2.2 尿酸檢測(cè)條件優(yōu)化

2.2.1試驗(yàn)溫度優(yōu)化

對(duì)尿酸檢測(cè)溫度進(jìn)行優(yōu)化,結(jié)果如圖3所示。I0和I分別為未添加和添加了尿酸的熒光納米材料的熒光信號(hào)強(qiáng)度。

圖3 試驗(yàn)溫度優(yōu)化結(jié)果

由圖3可知,試驗(yàn)溫度對(duì)熒光納米材料檢測(cè)尿酸的影響不大,在所有溫度條件下,熒光納米材料熒光強(qiáng)度猝滅率均穩(wěn)定在90%左右。為了避免高溫對(duì)后續(xù)試驗(yàn)產(chǎn)生影響,因此選擇適合的試驗(yàn)溫度為15 ℃。

2.2.2反應(yīng)時(shí)間優(yōu)化

圖4為反應(yīng)時(shí)間優(yōu)化結(jié)果。

圖4 反應(yīng)時(shí)間優(yōu)化結(jié)果

由圖4可知,反應(yīng)進(jìn)行2 min后,熒光強(qiáng)度趨于穩(wěn)定。這說明反應(yīng)時(shí)間達(dá)到2 min后,尿酸對(duì)熒光納米材料的熒光強(qiáng)度猝滅值達(dá)到穩(wěn)定狀態(tài),即熒光納米材料與尿酸的反應(yīng)是快速且穩(wěn)定的,可以通過該熒光納米材料快速檢測(cè)尿酸[12-13]。為了得到穩(wěn)定的試驗(yàn)數(shù)據(jù),避免時(shí)間的浪費(fèi),選擇適合的反應(yīng)時(shí)間為2 min。

2.2.3緩沖溶液的選擇及pH值優(yōu)化

選擇2種不同種類和不同pH值的緩沖液進(jìn)行試驗(yàn),觀察不同反應(yīng)條件下,熒光納米材料檢測(cè)尿酸熒光強(qiáng)度猝滅率的變化,結(jié)果如圖5所示。

(a)醋酸-醋酸鈉緩沖液

由圖5(a)可知,選擇醋酸-醋酸鈉緩沖液時(shí),熒光納米材料猝滅率隨pH值的增加而增加,當(dāng)醋酸-醋酸鈉緩沖液pH值達(dá)到7.0時(shí),熒光納米材料熒光強(qiáng)度的猝滅率達(dá)到90%以上,表現(xiàn)出良好的猝滅效果。由于醋酸-醋酸鈉緩沖液的有效緩沖范圍均為酸性環(huán)境,因此以Tris-HCl 緩沖溶液為對(duì)照,觀察堿性環(huán)境下,熒光納米材料的熒光強(qiáng)度猝滅率變化情況。由圖5(b)可知,選擇Tris-HCl 緩沖溶液進(jìn)行試驗(yàn)時(shí),熒光猝滅率在pH值為7.1時(shí)達(dá)到最高60%。結(jié)合圖5(a)和圖5(b)可知,2種緩沖液的最佳pH值均為中性環(huán)境,且在醋酸-醋酸鈉緩沖液條件下,尿酸對(duì)熒光納米材料的熒光猝滅率更高。因此,選擇pH值為7的醋酸-醋酸鈉緩沖液繼續(xù)試驗(yàn)。

2.3 尿酸檢測(cè)效果分析

2.3.1檢測(cè)靈敏度分析

通過對(duì)不同濃度尿酸進(jìn)行測(cè)試,記錄在激發(fā)波長(zhǎng)為290 nm條件下,最大發(fā)射波長(zhǎng)430 nm處熒光納米材料的熒光強(qiáng)度猝滅率,結(jié)果如圖6所示。

圖6 線性曲線

由圖6可知,隨尿酸濃度的增加,尿酸對(duì)熒光納米材料熒光強(qiáng)度猝滅率也明顯增加,兩者間表現(xiàn)出良好的線性關(guān)系。在濃度為0.1～50 μmol/L時(shí),R2為0.99,檢測(cè)限(LOD)為28 nmol/L,表現(xiàn)出良好的檢測(cè)效果。

表1為方法靈敏度試驗(yàn)結(jié)果。

表1 與其他方法對(duì)比Tab.1 Comparison with other methods

由表1可知,本試驗(yàn)構(gòu)建的熒光猝滅法檢測(cè)尿酸的檢測(cè)限明顯低于其他檢測(cè)方法,表現(xiàn)出較好的靈敏度。

2.3.2 選擇性分析

圖7為選擇性試驗(yàn)結(jié)果。

圖7 選擇性試驗(yàn)結(jié)果

由圖7可知,尿酸對(duì)熒光納米材料的猝滅率超過了90%,表現(xiàn)出較好的猝滅效果。其余金屬陽離子和小分子對(duì)熒光納米材料的猝滅率均小于5%,猝滅效果可忽略不計(jì)。這說明本試驗(yàn)制備的熒光納米材料對(duì)尿酸的檢測(cè)表現(xiàn)出較好的選擇性[19]。

2.4 實(shí)際樣品分析

通過加標(biāo)回收率試驗(yàn)對(duì)血清樣品中的尿酸含量進(jìn)行檢測(cè),確定熒光納米材料用于血清中尿酸檢測(cè)的可行性,試驗(yàn)結(jié)果如表2所示。

表2 加標(biāo)回收率Tab.2 Recovery rate of spiking

由表2可知,在加標(biāo)樣品濃度分別為5、15和30 μmol/L時(shí),樣品平均加標(biāo)回收率為98.2%～101.1%,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)均未超過3%,加標(biāo)回收效果良好。這說明了本試驗(yàn)制備的熒光納米材料可以用于血清中尿酸含量的檢測(cè),且表現(xiàn)出良好的檢測(cè)效果[20]。

3 結(jié)語

(1)在鋱離子的作用下,魯米諾顆粒發(fā)生了聚集,熒光強(qiáng)度較未經(jīng)過處理的魯米諾溶液增強(qiáng)了約40倍;

(2)尿酸與熒光納米材料發(fā)生反應(yīng)后,熒光納米材料熒光強(qiáng)度猝滅率約為31.4%,表現(xiàn)出良好的猝滅效果;

(3)熒光納米材料與尿酸優(yōu)化反應(yīng)條件為,反應(yīng)溫度15 ℃,反應(yīng)時(shí)間2 min,反應(yīng)環(huán)境pH值為7.0的醋酸-醋酸鈉緩沖液。在此條件下,尿酸對(duì)熒光納米材料熒光強(qiáng)度猝滅率超過90%;

(4)在濃度為0.1～50 μmol/L時(shí),R2為0.99,LOD為28 nmol/L,檢測(cè)效果良好;

(5)與同類檢測(cè)方法進(jìn)行對(duì)比,通過熒光納米材料檢測(cè)尿酸的檢測(cè)限明顯低于其他檢測(cè)方法,表現(xiàn)出較好的靈敏度;

(6)尿酸對(duì)熒光納米材料的猝滅率超過了90%,其余金屬陽離子和小分子對(duì)熒光納米材料的猝滅率均小于5%,表現(xiàn)出較好的選擇性;

(7)對(duì)實(shí)際樣品進(jìn)行分析,在濃度為5～30 μmol/L加標(biāo)內(nèi),樣品平均加標(biāo)回收率為98.2%～101.1%,RSD不大于3%,表現(xiàn)出良好加標(biāo)回收效果。