蔣騫 陳毅飛 陳雅秋 朱志丹 張嘉杰 孫曉婧

1桂林醫(yī)學(xué)院附屬口腔醫(yī)院，桂林 541000；2桂林醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，桂林 541000；3桂林市口腔醫(yī)院正畸科，桂林 541000

髁突作為顳下頜關(guān)節(jié)的主要承力部位，其頸部骨折占比高達(dá)17.0%～37.1%［1-2］。此時(shí)顳下頜關(guān)節(jié)應(yīng)力改變甚至中斷，會(huì)影響髁突軟骨超微結(jié)構(gòu)變化，導(dǎo)致髁突異常發(fā)育［3］。由于骨折愈合需要的時(shí)間較長(zhǎng)，在這個(gè)過程中會(huì)出現(xiàn)咬合紊亂、創(chuàng)傷和顏面部不對(duì)稱等現(xiàn)象［4-5］。類胰島素一號(hào)生長(zhǎng)因子（insulin-like growth factor-1，IGF-1）、血小板衍生生長(zhǎng)因子-BB（platelet derived growth factor-BB，PDGF-BB）作為參與髁突軟骨力學(xué)信號(hào)傳導(dǎo)，影響其細(xì)胞增殖代謝及骨折斷端骨增殖分化的細(xì)胞因子，其網(wǎng)絡(luò)調(diào)節(jié)在代謝轉(zhuǎn)換過程中發(fā)揮著極其重要的作用［6-10］。目前，對(duì)于處在生長(zhǎng)發(fā)育高峰期或之前的髁突骨折患者的治療仍以保守治療為主［11-13］。

注射用骨肽是含有多種骨代謝的活性肽類，具有調(diào)節(jié)骨代謝、刺激成骨細(xì)胞增殖，調(diào)節(jié)鈣磷代謝，促進(jìn)新骨形成，防治骨質(zhì)疏松和促進(jìn)骨折愈合等效果，臨床上主要作為輔助治療應(yīng)用于四肢骨骨折，可以有效地改善骨折愈合情況，抑制炎性反應(yīng)，增加骨代謝，達(dá)到縮短骨折愈合時(shí)間、減輕術(shù)后疼痛等效果［14-16］。為深入了解髁突骨折后使用復(fù)方骨肽注射液進(jìn)行治療，對(duì)頜骨發(fā)育及血清內(nèi)IGF-1、PDGF-BB含量變化的影響，本研究擬建立生長(zhǎng)發(fā)育高峰期SD大鼠右側(cè)髁突頸部骨折動(dòng)物模型，觀察各組顳下頜關(guān)節(jié)的形態(tài)、影像學(xué)及血清學(xué)改變。

材料與方法

1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF雄性SD大鼠72只，體質(zhì)量為120 g，4周齡，由長(zhǎng)沙市天勤生物技術(shù)有限公司提供，合格證號(hào)：SCXK（湘）2019-0014；使用許可證號(hào)：SYXK（桂）2020-0005。適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d，采用隨機(jī)數(shù)字表法分為3大組，即空白對(duì)照組、手術(shù)組和手術(shù)給藥組，隨后每大組分為4小組，即1周齡組、3周齡組、5周齡組、9周齡組，每組6只。全部大鼠飼養(yǎng)在無(wú)病原體的環(huán)境中，喂養(yǎng)和建模過程得到了桂林醫(yī)學(xué)院附屬口腔醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)（編號(hào)為KQDW-20210003），并遵循了3R原則等所有有關(guān)動(dòng)物倫理使用的適用機(jī)構(gòu)和政府法規(guī)給予人道主義關(guān)懷。

2.主要試劑及儀器

主要試劑：復(fù)方骨肽注射液（吉林輝南長(zhǎng)龍），規(guī)格2 ml/10 mg；PDGF酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)試劑盒（武漢博士德生物工程有限公司）；IGF酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)試劑盒（武漢博士德生物工程有限公司）；2%戊巴比妥鈉（上海恩化化學(xué)技術(shù)有限公司）；多聚甲醛溶液（北京蘭杰柯科技有限公司）。

主要儀器：小動(dòng)物活體成像儀（美國(guó)PerkinElmer，IVIS Lumina Ⅲ）、高速離心機(jī)（德國(guó)Eppendorf，5424R）、多功能酶標(biāo)儀（美國(guó)BioTek，EL×800）、游標(biāo)卡尺（0.02mm分辨率）、鑷子、金冠剪等由桂林醫(yī)學(xué)院提供。

3.實(shí)驗(yàn)方法

3.1.動(dòng)物編號(hào) 每組按照實(shí)驗(yàn)動(dòng)物顏料涂擦被毛編號(hào)法，用3%苦味酸溶液進(jìn)行編號(hào)。

3.2.動(dòng)物模型建立 實(shí)驗(yàn)于2019年10月25號(hào)開始，空白組不予以處理，手術(shù)組和手術(shù)給藥組在適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d后，建立大鼠單側(cè)髁突頸部骨折的動(dòng)物模型。術(shù)前記錄大鼠體質(zhì)量，術(shù)前8 h禁食，2%戊巴比妥納（0.2 ml/kg）行腹腔注射麻醉。待無(wú)角膜反射后即可開始手術(shù)。在實(shí)驗(yàn)過程中注意動(dòng)物的反應(yīng)，適時(shí)追加0.1 ml麻醉劑以維持麻醉效果。取左側(cè)臥位固定大鼠，常規(guī)脫毛、消毒。待干燥后右耳前縱切口，切開皮膚、皮下組織。拉開腮腺，從顳肌、咬肌及外耳道之間的凹陷處入手。鈍剝離暴露髁頸部，用眼科剪剪斷髁頸造成骨折（圖1）。手術(shù)過程中注意避讓附近血管和神經(jīng)，分層縫合創(chuàng)口。術(shù)后2 d內(nèi)給予精細(xì)食物與常規(guī)飼料的混合喂養(yǎng)，之后恢復(fù)常規(guī)飼料飼養(yǎng)。

圖1 大鼠髁突頸部骨折造模（箭頭處為手術(shù)骨折端）

3.3.藥物干預(yù) 手術(shù)給藥組術(shù)后每天注射復(fù)方骨肽注射液。依據(jù)體表面積算法換算大鼠的等效劑量為每日用藥量0.9 mg/kg，將復(fù)方骨肽注射液（2 ml/10 mg）溶于98 ml生理鹽水中，按照大鼠體質(zhì)量行腹腔注射?？瞻讓?duì)照組和手術(shù)組給予等量生理鹽水行腹腔注射。

3.4.血清樣本的收集 將3組大鼠分別于術(shù)后1、3、5、9周各取6只，進(jìn)行眼球取血。將大鼠頭部朝斜下固定住，剪掉大鼠胡須及眼眶周圍的鼠毛，待眼球充分充血后，用鑷子快速夾掉大鼠眼球。用EP管收集全血，于試管架上做好標(biāo)記后室溫靜置30 min后，以轉(zhuǎn)速3 000 r/min離心15 min，離心半徑9 cm，后取上方血清分裝于冰箱-20 ℃保存以待檢測(cè)。

3.5.解剖標(biāo)本采集與保存 將3組大鼠分別于術(shù)后1、3、5、9周各取6只，進(jìn)行眼球取血后，腹腔注射2%戊巴比妥納（0.6 ml/kg）行大鼠安樂死。隨后斷頭，去皮，手術(shù)結(jié)束后，統(tǒng)一將大鼠頭部沿正中矢狀面一分為二，取左右側(cè)下頜骨作為檢驗(yàn)標(biāo)本，修整標(biāo)本，按照組別分類標(biāo)號(hào)后，4%甲醛浸泡。

3.6.觀測(cè)與檢驗(yàn)方案 （1）下頜骨的解剖學(xué)觀測(cè)測(cè)量3組組織標(biāo)本的下頜骨，使用分規(guī)卡尺和游標(biāo)卡尺（0.02 mm分辨率）測(cè)量以下解剖結(jié)構(gòu)標(biāo)志。下頜體長(zhǎng)度（Id-Ap）：下頜角點(diǎn)至下齒槽緣點(diǎn)的距離；下頜體高度（TM-AN）：角前切跡至下頜磨牙遠(yuǎn)中的距離；下頜升支高度（Co-Ap）：下頜角點(diǎn)至髁頂點(diǎn)的距離，1個(gè)標(biāo)本上每個(gè)解剖標(biāo)志的距離測(cè)量3次，求平均值，由1人完成。觀測(cè)下頜骨的生長(zhǎng)發(fā)育情況。（2）顳下頜關(guān)節(jié)的影像學(xué)觀察使用小動(dòng)物活體成像儀，用X-ray攝片，觀察3組的下頜骨形態(tài)和骨折線愈合情況。（3）檢驗(yàn)血清內(nèi)的IGF-1、PDGF-BB含量采用血清學(xué)夾心法酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測(cè)標(biāo)本血清內(nèi)IGF-1、PDGF-BB含量。利用酶標(biāo)儀、恒溫箱等實(shí)驗(yàn)儀器，分別按照IGF-1、PDGF-BB檢測(cè)試劑盒檢測(cè)各組SD大鼠血清中IGF-1、PDGF-BB的含量。檢測(cè)流程：配制標(biāo)準(zhǔn)曲線、加樣后反應(yīng)、加抗體后反應(yīng)、洗板、加ABC工作液后反應(yīng)、洗板、加TMB顯色液后避光反應(yīng)、加終止液。

4.統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 26.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，對(duì)結(jié)果數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，采用各組均數(shù)比較，兩兩比較用LSD檢驗(yàn)。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

1.下頜骨生長(zhǎng)觀察結(jié)果（圖2）

圖2 各組大鼠生長(zhǎng)長(zhǎng)度比較（樣本量=6）

通過對(duì)空白對(duì)照組右側(cè)標(biāo)本、手術(shù)組左側(cè)標(biāo)本、手術(shù)組右側(cè)標(biāo)本、手術(shù)給藥組右側(cè)標(biāo)本進(jìn)行測(cè)量，發(fā)現(xiàn)TM-AN、Co-Ap、Id-Ap在術(shù)后4個(gè)時(shí)間點(diǎn)各組比較，呈現(xiàn)出空白對(duì)照組大于手術(shù)組左側(cè)，手術(shù)組左側(cè)與手術(shù)給藥組右側(cè)相近，手術(shù)給藥組右側(cè)大于手術(shù)組右側(cè)的結(jié)果。其中，對(duì)照組右側(cè)、手術(shù)組左側(cè)、手術(shù)組右側(cè)的TM-AN、Co-Ap、Id-Ap在術(shù)后1、3周比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。給藥組的Id-Ap在每個(gè)時(shí)間點(diǎn)比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），但TM-AN和Co-Ap僅在術(shù)后1、3周差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。繪制各組TM-AN、Co-Ap、Id-Ap的距離均數(shù)柱狀圖可見，各組下頜骨生長(zhǎng)均表現(xiàn)為遞增狀態(tài)，但手術(shù)組右側(cè)生長(zhǎng)變化低于其他組，手術(shù)給藥組右側(cè)生長(zhǎng)變化與手術(shù)組左側(cè)相近。

2.下頜骨影像學(xué)觀察結(jié)果（圖3）

圖3 各組髁突頸部骨折大鼠骨折下頜骨X片

在術(shù)后1周時(shí)，手術(shù)組左側(cè)及空白對(duì)照組右側(cè)下頜骨影像密度均勻連續(xù)，手術(shù)組及手術(shù)給藥右側(cè)骨折線均清晰可見骨折斷端密度不均，骨折線內(nèi)見高密度影像，邊界模糊。術(shù)后3周時(shí)大鼠髁突頸部骨折線邊界手術(shù)組較手術(shù)給藥組模糊，手術(shù)給藥組的骨折邊界線逐漸消失。術(shù)后5周大鼠下頜骨形態(tài)逐漸恢復(fù)，手術(shù)組骨折邊界逐漸消失，手術(shù)給藥組未見骨折邊界線。手術(shù)組大鼠在術(shù)后9周時(shí)下頜骨影像密度趨于均勻。

3.血清PDGF-BB水平（表1）

表1 各組大鼠術(shù)后不同時(shí)間血清血小板衍生生長(zhǎng)因子-BB水平比較（ng/L，）

表1 各組大鼠術(shù)后不同時(shí)間血清血小板衍生生長(zhǎng)因子-BB水平比較（ng/L，）

注：空白組不予以處理，手術(shù)組和手術(shù)給藥組建立大鼠單側(cè)髁突頸部骨折的動(dòng)物模型，手術(shù)給藥組術(shù)后每天注射復(fù)方骨肽注射液，空白對(duì)照組和手術(shù)組給予等量生理鹽水行腹腔注射；表中同一列數(shù)值有相同肩標(biāo)字母表示P＜0.05

術(shù)后9周370.81±78.81ab 188.74±22.51a 202.79±51.77b組別手術(shù)組手術(shù)給藥組空白對(duì)照組樣本量6 6 6術(shù)后1周104.21±15.01a 241.69±22.49a 406.47±26.88a術(shù)后3周487.6±141.76a 337.37±51.28b 718.4±153.52ab術(shù)后5周432.61±33.03a 438.16±63.43b 348.65±68.24ab

分析各組大鼠生長(zhǎng)過程中血清PDGF-BB水平的測(cè)定結(jié)果得出：3組PDGF-BB含量均呈先上升后下降趨勢(shì)。相同周齡的3組大鼠血清內(nèi)PDGF-BB的含量?jī)蓛杀容^得出：術(shù)后1周時(shí)，空白對(duì)照組大鼠的血清PDGF-BB含量高于手術(shù)給藥組、手術(shù)組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.001）；術(shù)后3～5周時(shí)，手術(shù)組、手術(shù)給藥組分別與空白對(duì)照組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P3周=0.006、＜0.001，P5周=0.022、0.016）；術(shù)后9周時(shí)，手術(shù)組含量最高，手術(shù)給藥組與空白對(duì)照組相近，此時(shí)手術(shù)組與其他兩組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.001）。

4.血清IGF-1水平（表2）

表2 各組大鼠術(shù)后不同時(shí)間血清類胰島素一號(hào)生長(zhǎng)因子水平比較（ng/L，）

表2 各組大鼠術(shù)后不同時(shí)間血清類胰島素一號(hào)生長(zhǎng)因子水平比較（ng/L，）

注：空白組不予以處理，手術(shù)組和手術(shù)給藥組建立大鼠單側(cè)髁突頸部骨折的動(dòng)物模型，手術(shù)給藥組術(shù)后每天注射復(fù)方骨肽注射液，空白對(duì)照組和手術(shù)組給予等量生理鹽水行腹腔注射；表中同一列數(shù)值有相同肩標(biāo)字母表示P＜0.05

術(shù)后9周1 413.96±227.77a 1 525.63±153.13b 304.92±212.84ab組別手術(shù)組手術(shù)給藥組空白對(duì)照組樣本量6 6 6術(shù)后1周2 036.87±121.73a 2 048.85±133.19b 3 989.05±106.05ab術(shù)后3周3 133.14±320.36a 2 318.26±440.46ab 3 299.01±510.28b術(shù)后5周2 109.95±181.74a 2 714.89±180.21a 2 499.27±186.04a

分析各組大鼠生長(zhǎng)過程中血清IGF-水平的測(cè)定結(jié)果得出：空白對(duì)照組IGF-1的含量呈逐步下降趨勢(shì)，但手術(shù)組與手術(shù)給藥組均為先上升后下降趨勢(shì)。術(shù)后1周時(shí)，空白對(duì)照組與其他兩組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.001）；術(shù)后3周時(shí)，手術(shù)組血清IGF-1含量達(dá)到頂峰，與空白對(duì)照組相近，手術(shù)組、空白對(duì)照組分別與手術(shù)給藥組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.005、0.001）；術(shù)后5周時(shí)，手術(shù)給藥組血清IGF-1的含量達(dá)到峰值，3組含量?jī)蓛杀容^差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.006、0.024）；術(shù)后9周時(shí)，空白對(duì)照組含量低于其余兩組（P＜0.001），手術(shù)組與手術(shù)給藥組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.165）。

討論

髁突頸部骨折是口腔頜面外科的高發(fā)骨折類型之一。在臨床上，其治療方式要考慮髁突骨折時(shí)所受到的作用力方向、大小以及個(gè)體年齡等差異［17-18］。若處于生長(zhǎng)高峰期之前的兒童或正處于生長(zhǎng)高峰期的青少年在下頜骨尚未發(fā)育完全的情況下出現(xiàn)髁突骨折，而髁突作為下頜骨主要生長(zhǎng)發(fā)育中心之一，此時(shí)髁突所受到的應(yīng)力刺激改變或中斷將導(dǎo)致下頜骨發(fā)育暫?；蚓徛?9］。復(fù)方骨肽注射液是用動(dòng)物胎骨制成，具有多種促進(jìn)骨生長(zhǎng)、骨發(fā)育等活性物質(zhì)。近年來，復(fù)方骨肽注射液在臨床上常常作為輔助治療藥物用于促進(jìn)四肢骨骨折的愈合。但骨折愈合是一個(gè)非常復(fù)雜的過程，會(huì)受到各種外界因素、個(gè)體差異、骨折區(qū)血供、軟組織損傷程度等影響［20］。

本研究選擇的是處于生長(zhǎng)發(fā)育高峰期的雄性SD大鼠，實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析表明。⑴空白對(duì)照組在術(shù)后4個(gè)時(shí)間節(jié)點(diǎn)內(nèi)TM-AN、Co-Ap、Id-Ap均大于其他2組，表明單側(cè)髁突骨折會(huì)對(duì)大鼠下頜骨的生長(zhǎng)發(fā)育帶來影響；手術(shù)組左側(cè)（正常側(cè)）大于右側(cè)（骨折側(cè)），這意味著手術(shù)組下頜骨因右側(cè)髁突骨折造成雙側(cè)髁突受力不平衡，左側(cè)受到咀嚼等應(yīng)力刺激增加，使下頜骨左側(cè)的生長(zhǎng)發(fā)育快于右側(cè)，下頜骨偏斜至患側(cè)。手術(shù)給藥組的生長(zhǎng)距離與手術(shù)組左側(cè)相近，大于手術(shù)組右側(cè)，說明復(fù)方骨肽注射液能促進(jìn)髁突骨折愈合，降低下頜骨的偏斜程度。⑵影像學(xué)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，手術(shù)給藥組在術(shù)后5周時(shí)就能使骨折斷端基本愈合，這種現(xiàn)象在手術(shù)組術(shù)后9周時(shí)才出現(xiàn)，說明骨肽在一定程度上能促進(jìn)骨折斷端的愈合。⑶血清學(xué)檢測(cè)結(jié)果顯示，術(shù)后1周時(shí)，手術(shù)給藥組血清PDGF-BB含量比手術(shù)組高，可能是骨肽注射液刺激了機(jī)體內(nèi)PDGF-BB的表達(dá)，而空白組血清IGF-1含量與其他2組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說明手術(shù)和藥物處理對(duì)IGF-1的影響已經(jīng)開始；術(shù)后5周時(shí)，手術(shù)給藥組的血清PDGF-BB和IGF-1的含量比其他2組高且達(dá)到峰值，這可能是由于骨肽加速了骨折愈合過程中生長(zhǎng)因子的表達(dá)，但具體作用機(jī)制還有待研究。

綜上所述，本研究結(jié)果表明，手術(shù)和藥物處理都會(huì)對(duì)大鼠血清IGF-1含量產(chǎn)生影響，并且這種影響是動(dòng)態(tài)的，不同時(shí)間點(diǎn)的影響不同。這些數(shù)據(jù)為進(jìn)一步研究髁突骨折和骨肽對(duì)大鼠生長(zhǎng)和恢復(fù)的影響提供了重要的信息。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突

作者貢獻(xiàn)聲明蔣騫：醞釀和設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)，實(shí)施研究，采集數(shù)據(jù)，分析/解釋數(shù)據(jù)，文章撰寫，工作支持；陳毅飛：醞釀和設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)，實(shí)施研究，采集數(shù)據(jù)，分析/解釋數(shù)據(jù)，文章撰寫，統(tǒng)計(jì)分析，指導(dǎo)，支持性貢獻(xiàn)；陳雅秋、朱志丹：實(shí)施研究，采集數(shù)據(jù)，分析/解釋數(shù)據(jù)，起草文章，統(tǒng)計(jì)分析，行政、技術(shù)或材料支持；張嘉杰：實(shí)施研究，采集數(shù)據(jù)，起草文章，獲取研究經(jīng)費(fèi)；孫曉婧：醞釀和設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)，分析/解釋數(shù)據(jù)，對(duì)文章的知識(shí)性內(nèi)容作批評(píng)性審閱，獲取研究經(jīng)費(fèi)，行政、技術(shù)或材料支持，指導(dǎo)