周艷 李冬梅 吳坤林 寧祖林

關(guān)鍵詞：瀕危植物；粗莖紫金牛；愈傷組織；再生體系

粗莖紫金牛（ArdisiagigantifoliaStapf）為報春花科（Primulaceae）紫金牛屬常綠灌木，高50～70cm，株型緊湊優(yōu)美，莖粗壯不分枝，葉通常聚生于莖頂端，葉片肥大似扇子，上面深綠色，背面紫紅色，花紫紅色或淡粉色，花量大而密集，花期長，果熟時鮮紅或紫粉色，耐蔭性強，觀賞價值高，可作為室內(nèi)盆花或園林花境素材，極具市場開發(fā)應用前景[1]。粗莖紫金牛自然分布范圍狹窄，僅分布于我國云南河口，生于海拔100～400m的溝谷常綠闊葉林下[2]，筆者在野外調(diào)查過程中僅在河口南溪鎮(zhèn)和古林箐鎮(zhèn)兩地溝谷林下發(fā)現(xiàn)個體數(shù)量極少的野生居群。因粗莖紫金牛野生資源稀少，被列為《中國生物多樣性紅色名錄-高等植物卷》極危（CR）物種[3]，具有重要的保護價值和研究意義。

遷地保護于華南植物園的粗莖紫金牛生長良好，每年開花，但難以結(jié)實，存在繁殖障礙問題。劉華等[4]已申報了粗莖紫金牛扦插、壓條繁殖專利技術(shù)，但受季節(jié)和繁殖材料的限制，繁殖效率不高。李冬梅等[5]申報了利用粗莖紫金牛嫩葉為外植體的組織培養(yǎng)專利技術(shù)，公開了其繼代增殖系數(shù)最高為4.0。孫英坤等[6]研究認為TDZ能有效促進堇葉紫金牛（A.violacea）不定芽分化。符運柳等[7]對走馬胎（A.kteniophylla）離體培養(yǎng)及植株再生生根壯苗階段添加了10%的CW，但未起到壯苗增高效果。迄今為止，紫金牛屬植物組培快繁技術(shù)研究主要以莖段和嫩葉為外植體，研究集中在外植體的消毒方式、不同植物生長調(diào)節(jié)劑配比對腋芽誘導、增殖與生根的影響、不同基質(zhì)對移栽成活率的影響[8-10]等方面。目前尚無粗莖紫金牛愈傷組織再生體系建立方面的研究。鑒于此，本研究利用粗莖紫金牛莖段為外植體進行愈傷組織再生體系的建立，探究植物生長調(diào)節(jié)劑和有機物對其組織培養(yǎng)的影響，以期建立高效的粗莖紫金牛離體再生體系，為該物種的保育和種苗的規(guī)模化生產(chǎn)提供技術(shù)支撐。

1材料與方法

1.1材料

供試材料為粗莖紫金牛（A.gigantifoliaStapf）無菌苗，保存于華南植物園瀕危植物繁育中心。

1.2方法

1.2.1TDZ和NAA對莖段愈傷組織誘導的影響將粗莖紫金牛無菌苗切成長約2.0cm帶1個莖節(jié)的切段，接種到培養(yǎng)基WPM+NAA0.10mg/L+TDZ（0.10、0.25、0.50、0.80、1.00、1.50mg/L）進行愈傷組織誘導，以不添加植物生長調(diào)節(jié)劑為對照，每個濃度梯度處理10瓶，每瓶接種2個外植體，重復3次。培養(yǎng)45d后觀察記錄各處理培養(yǎng)結(jié)果，并統(tǒng)計其愈傷組織誘導率、不定芽誘導率和莖段存活率。

愈傷組織誘導率＝產(chǎn)生愈傷組織的外植體數(shù)/接種外植體總數(shù)×100%

不定芽誘導率＝產(chǎn)生不定芽的外植體數(shù)/接種外植體總數(shù)×100%

莖段存活率=外植體成活數(shù)/接種外植體總數(shù)×100%

1.2.2TDZ對愈傷組織增殖的影響將誘導獲得的愈傷組織分切成重約0.10g的團粒，接種到培養(yǎng)基WPM+TDZ（0.30、0.50、0.80、1.00mg/L）進行愈傷組織的增殖培養(yǎng)，以不添加植物生長調(diào)節(jié)劑為對照，每個濃度梯度處理10瓶，每瓶接種2團，重復3次。培養(yǎng)45d后統(tǒng)計愈傷組織存活率和愈傷組織增殖系數(shù)。

愈傷組織存活率=成活的愈傷組織團粒數(shù)/接種愈傷組織?？倲?shù)×100%

愈傷組織增殖系數(shù)=增殖培養(yǎng)后愈傷組織鮮重/接種愈傷組織鮮重

1.2.36-BA和NAA對愈傷組織不定芽誘導的影響將增殖培養(yǎng)的愈傷組織分切成重約0.10g的團粒，接種到培養(yǎng)基WPM+0.20mg/LNAA+6-BA（1.00、1.50、2.00、2.50、3.00mg/L）進行不定芽誘導，以不添加植物生長調(diào)節(jié)劑為對照，每個濃度梯度處理10瓶，每瓶接種2團，重復3次。培養(yǎng)45d后統(tǒng)計不定芽誘導率。

不定芽誘導率＝產(chǎn)生不定芽的外植體數(shù)/接種外植體總數(shù)×100%

1.2.46-BA對不定芽增殖的影響將誘導出的叢生芽分切，以雙芽為單位接種到培養(yǎng)基WPM+6-BA（2.00、4.00、6.00、8.00mg/L）上進行不定芽的增殖培養(yǎng)，以不添加植物生長調(diào)節(jié)劑為對照，每個處理10瓶，每瓶接種2個單位，重復3次。培養(yǎng)45d后統(tǒng)計不定芽增殖系數(shù)。

不定芽增殖系數(shù)=新增不定芽數(shù)/接種不定芽數(shù)

1.2.5NAA和CW對生根壯苗的影響將生長健壯、長勢基本一致的高2～3cm不定芽接種至WPM+NAA0.20mg/L+CW（5%、10%、15%、20%、25%體積分數(shù)）的培養(yǎng)基中進行生根壯苗實驗，以不添加CW為對照，每個濃度梯度處理10瓶，每瓶接種2個不定芽，重復3次。培養(yǎng)45d后統(tǒng)計生根率、株高、根數(shù)、根長、鮮重增量。

生根率＝生根不定芽數(shù)/接種的不定芽總數(shù)×100%

鮮重增量（g）=培養(yǎng)后組培苗的鮮重-初始不定芽的鮮重

1.2.6移栽基質(zhì)對組培苗生長的影響當粗莖紫金牛生根瓶苗高度達4～5cm、葉片數(shù)達4片時，于遮光率為60%的溫室中煉苗2～3d，接著開蓋煉苗2～3d，將煉苗后的瓶苗取出，小心洗去附著于根部的瓊脂，移栽到準備好的基質(zhì)穴盤中，每個穴孔種植1株。以珍珠巖∶泥炭土按體積比為0∶1、1∶3、1∶6、1∶8和1∶10等5種比例混合基質(zhì)作為移栽基質(zhì)，采用54cm×28cm的32孔育苗篩，用稀釋1000倍的多菌靈溶液浸泡2h后，濾干備用。每種比例混合基質(zhì)處理20株，重復3次，期間保持濕度90%以上，遮陰度60%左右。60d后統(tǒng)計移栽成活率。

移栽成活率＝成活苗數(shù)/移栽總苗數(shù)×100%

1.3數(shù)據(jù)處理

所有數(shù)據(jù)均采用Excel2003軟件進行統(tǒng)計處理，采用SPSS19.0軟件進行方差分析和Duncans多重比較。

2結(jié)果與分析

2.1TDZ和NAA對莖段愈傷組織誘導的影響

從圖1可看出，莖段外植體在培養(yǎng)基WPM中添加0.10mg/LNAA和不同濃度的TDZ可成功誘導出愈傷組織和不定芽。TDZ與0.10mg/LNAA結(jié)合使用時，不同濃度的TDZ對莖段存活、愈傷組織和不定芽誘導具有促進作用。由表1可知，在不添加任何TDZ和NAA的培養(yǎng)基上，莖段存活率為100.00%，但均無愈傷組織和不定芽形成。當TDZ濃度為0.10～0.50mg/L時，TDZ對莖段存活率和愈傷組織誘導的影響差異不顯著，愈傷組織和不定芽的誘導率隨TDZ增加而逐漸遞增；TDZ在0.5mg/L時，愈傷組織誘導率最高達96.67%，且愈傷組織長勢良好，呈黃綠色或淺綠色（圖1C）。TDZ濃度為0.50～1.50mg/L時，莖短成活率、愈傷組織和不定芽的誘導率隨TDZ濃度增加而逐漸降低，但TDZ濃度在0.50～0.80mg/L范圍內(nèi)，TDZ對愈傷組織和不定芽的誘導率差異不顯著。當TDZ濃度為1.50mg/L時，成活率降至80.00%，愈傷組織誘導率達最低值54.17%，不定芽誘導率低至23.33%，此時愈傷組織長勢差，且呈黃綠色（圖1D）。

2.2TDZ對愈傷組織增殖的影響

由表2可知，以WPM培養(yǎng)基添加不同濃度TDZ對愈傷組織增殖具有顯著影響。隨著TDZ濃度增高，愈傷組織存活率呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，TDZ濃度為0.50mg/L時，存活率達到最高93.33%。在不添加TDZ的培養(yǎng)基上，愈傷組織鮮重增殖系數(shù)為1.62，愈傷組織呈淺綠色，僅有少數(shù)芽點。當添加TDZ濃度為0.30mg/L時，其增殖系數(shù)下降為0.26，愈傷組織呈淺黃綠色顆粒狀，結(jié)果表現(xiàn)為低濃度TDZ對愈傷組織鮮重增殖有明顯的抑制作用。當TDZ濃度為0.50mg/L，增殖系數(shù)為4.42，達到最大值，愈傷組織呈淺綠或黃綠色；而TDZ濃度在0.80～1.00mg/L時增殖系數(shù)從1.26下降至0.31，愈傷組織由黃綠色、顆粒狀逐漸呈現(xiàn)褐黃色，且多數(shù)死亡。綜合分析，WPM+0.50mg/LTDZ為愈傷組織增殖的最佳培養(yǎng)基。

2.36-BA和NAA對愈傷組織不定芽誘導的影響

由表3可知，當NAA濃度保持在0.20mg/L時，隨著6-BA濃度的增加，不定芽的誘導率呈先增加后減少的趨勢；當6-BA濃度低于2.00mg/L時，每團愈傷誘導出的不定芽較少，呈黃綠色或綠色（圖2C）；當6-BA濃度為2.00mg/L時，不定芽的誘導率達到最高，為100.00%，每團愈傷誘導出大量不定芽，芽體為綠色，生長狀況較好（圖2A，圖2B）；當6-BA濃度高于2.00mg/L時，不定芽誘導率隨著6-BA濃度的增加而下降；當6-BA濃度為3.00mg/L時，不定芽誘導率最低為56.67%，芽體為黃綠色至黃色（圖2C）。綜合考慮，WPM+2.00mg/L6-BA+0.20mg/LNAA為粗莖紫金牛愈傷組織增殖的最佳培養(yǎng)基。

2.46-BA對不定芽增殖的影響

由表4可知，在WPM培養(yǎng)基上添加不同濃度的6-BA對不定芽的增殖具有顯著差異。本研究發(fā)現(xiàn)，單獨使用6-BA對粗莖紫金牛不定芽的增殖有顯著影響，隨著6-BA濃度的增加，不定芽的增殖系數(shù)呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，當6-BA濃度為4.00mg/L時，誘導出的不定芽生長正常，芽體為淺綠色或綠色，小葉狹窄且未展開（圖2D），增值系數(shù)達到最大值為3.90；當6-BA濃度高于6.00mg/L時，增殖系數(shù)顯著下降；當6-BA濃度為8.00mg/L時，增殖系數(shù)降至最低0.97?？梢姡琖PM+4.00mg/L6-BA為對不定芽的增殖有較好的促進作用，最適濃度因植物種類不同有所差異。

2.5NAA和CW對生根壯苗的影響

將無根苗轉(zhuǎn)接到WPM+0.20mg/LNAA+CW上進行生根壯苗，15d左右開始生根，生根率達100%，CW能誘導根系生長，但對株高生長有抑制作用。由表5可知，NAA濃度固定為0.20mg/L時，在不添加CW的培養(yǎng)基中，植株平均高度為4.25cm，在培養(yǎng)基中添加不同濃度CW，其平均株高均低于不添加CW的處理，當CW濃度在0～10%范圍時，對株高的影響差異不顯著，而當CW濃度高于10%時，隨著CW濃度增加，植株平均高度降低，且達到顯著性差異。

CW濃度在0～10%范圍時，CW濃度對植株的根條數(shù)、根長和鮮重增量的影響均無顯著差異。當CW濃度為10%時，根長和鮮重增量達到最大值，分別為4.36cm和1.48g，生長狀態(tài)最佳（圖3）。當CW濃度高于10%時，隨著CW濃度的增加，根條數(shù)、根長和鮮重均逐漸減少，且達到顯著差異。當CW濃度達到20%以上時，根部出現(xiàn)褐化現(xiàn)象（圖3白色箭頭所示）。

2.6移栽基質(zhì)對組培苗生長的影響

由表6可知，移栽基質(zhì)對粗莖紫金牛組培苗移栽成活率有明顯差異。在泥炭土基質(zhì)中，培養(yǎng)60d，成活率為82.78%，生長狀態(tài)較差，植株弱小，葉片質(zhì)地較薄且??；珍珠巖∶泥炭土以體積比1∶3～1∶10混合范圍時，培養(yǎng)60d，成活率無顯著差異，其中珍珠巖∶泥炭土以體積比1∶3混合時，成活率最高達96.67%，此時植株生長健壯，葉片質(zhì)地較厚，有光澤且葉片較大（圖4）。

3討論

植物組織培養(yǎng)與快速繁殖技術(shù)是植物資源可持續(xù)開發(fā)利用的一種有效手段，可在短時間內(nèi)生產(chǎn)大量優(yōu)質(zhì)種苗[11]。彭光天[12]對9種紫金牛屬（Ardisia）植物進行組織培養(yǎng)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)不同外植體誘導愈傷的能力存在差異，在MS+1.0mg/LNAA培養(yǎng)基誘導5種紫金牛幼苗生根的效果不太理想，其中百兩金（A.crispa）、虎舌紅（A.mamillata）、紫金牛（A.japonica）的莖段愈傷組織分化僅形成一些不定根，血黨（A.punctata）和蓮座紫金牛（A.primulifolia）未能形成根。符運柳等[7]對走馬胎（A.kteniophylla）進行離體培養(yǎng)及植株再生，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在MS（改良）+0.50mg/L6-BA+0.1mg/LNAA+10%CW壯苗培養(yǎng)時，能夠誘導不定芽伸長生長，但不能高頻誘導不定芽增高。在本研究中，通過在WPM培養(yǎng)基上添加0.20mg/LNAA和CW對粗莖紫金牛幼苗生根誘導效果良好，生根率達100%，當添加10%CW時，不定根發(fā)達，植株生長健壯。推測低濃度的NAA可促進愈傷組織誘導生根，同時椰汁也促進了愈傷組織誘導生根和根長生長，使鮮重增加，植株生長健壯。

TDZ作為一種新型的植物生長調(diào)節(jié)劑，已有文獻報道其不但具有很強的細胞分裂素活性，能誘導愈傷組織形成不定芽[13-14]，而且具有生長素的脫分化作用，能有效誘導愈傷組織形成[15]。本研究通過TDZ和NAA的組合不僅能使粗莖紫金牛莖段誘導出愈傷組織和增殖，同時產(chǎn)生不定芽，與前人的研究結(jié)果一致[16-17]。TDZ促進愈傷組織形成，也促進不定芽形成，這可能與TDZ能有效促進外植體直接誘導不定芽產(chǎn)生有關(guān)[18-19]。此外，本研究利用TDZ具有細胞分裂素與生長素的雙重作用，對粗莖紫金牛愈傷組織進行增殖且效果良好，這與劉守贊等[10]研究發(fā)現(xiàn)TDZ對堇葉紫金牛莖段增殖作用效果顯著優(yōu)于6-BA和KT，且當TDZ濃度為0.50mg/L時，增殖倍率最高達3.14的研究結(jié)果類似。

6-BA是常用的細胞分裂素，促進植物細胞分裂、伸長和分化。本研究使用6-BA搭配NAA誘導愈傷組織分化不定芽，結(jié)果表明細胞分裂素與生長素比值對粗莖紫金牛愈傷組織不定芽分化具有顯著影響，當6-BA/NAA=10時，不定芽分化率高達100%；比例大于10時不定芽分化率卻呈下降趨勢。符運柳等[7]對紫金牛屬走馬胎進行離體培養(yǎng)研究，結(jié)果也發(fā)現(xiàn)，2.00mg/L6-BA+0.10mg/LNAA的組合最利于愈傷組織分化不定芽，分化率為88.9%，而當6-BA濃度為3.0mg/L時，不定芽分化率明顯下降，因此合適的細胞分裂素與生長素比值對于紫金牛愈傷組織分化不定芽最重要。

有機物的添加有利于蘭科植物組培生根壯苗培養(yǎng)[20-21]，但在紫金牛的組織培養(yǎng)中還未見CW對其生根壯苗培養(yǎng)影響的報道。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，將2～3cm高的粗莖紫金牛無根苗接種在不添加植物生長調(diào)節(jié)劑的培養(yǎng)基中也能生根，但根量少且纖細；使用0.20mg/L濃度的NAA能有效促進粗莖紫金牛無根苗生根，平均根條數(shù)為3.37，根長為3.91cm，單株鮮重為1.41g；將NAA濃度固定為0.20mg/L，當添加濃度10%的CW時，會進一步促進無根苗的生長，平均根條數(shù)達3.80，根長達4.36cm，單株鮮重達1.48g，試管苗生長狀況較好；但高濃度椰汁會使根部出現(xiàn)褐化現(xiàn)象，抑制根部生長，因此低濃度的CW有促進粗莖紫金牛生根壯苗作用。