吳金山 陸小靜 王思琦 黃家權(quán) 張逸杰 賈迎雪 陳銀華

關(guān)鍵詞：木薯；FRK1類似基因；生物信息學(xué)；表達(dá)分析

果糖激酶（fructokinase，F(xiàn)RK）是植物細(xì)胞中果糖磷酸化的主要催化酶、變構(gòu)酶和高效酶，其國際系統(tǒng)分類編號(hào)為EC2.7.1.4，是植物糖代謝的“控制閥”，在植物生長發(fā)育過程中主要調(diào)控植物的糖代謝、生長發(fā)育和響應(yīng)生物/非生物脅迫等作用，是一種必不可少的不可逆酶[1]。目前，已有20多種植物分離鑒定出FRK基因[2]，如甜菜直根[3]、大豆[4]、馬鈴薯塊莖[5]、番茄果實(shí)[6-7]、豌豆、菠菜葉片、水稻、蘋果、玉米、百合花粉、毛果楊、枇杷[8]、大麥、甘蔗、鱷梨、山茶花粉[1，8]、棉花、谷子、高粱[8]、木薯[9]、北美云杉和蜜柑[10]等，但對(duì)其研究主要集中在果糖磷酸化及其基因表達(dá)方面，而在模式植物擬南芥中的研究相對(duì)較為深入。

FRK作為植物糖代謝過程中重要的碳通量調(diào)節(jié)激酶，其在植物逆境脅迫中發(fā)揮著重要作用。Z?RB等[11]通過對(duì)甘蔗基因組進(jìn)行搜索鑒定，共發(fā)現(xiàn)7個(gè)FRK基因，在干旱脅迫誘導(dǎo)下，其基因家族中只有SsFRK3和SsFRK5兩個(gè)基因表達(dá)量呈顯著上升變化趨勢。在玉米中，短期的鹽脅迫可使FRK2基因的表達(dá)量上調(diào)；在向日葵植株中，利用干旱脅迫誘導(dǎo)，F(xiàn)RK基因表達(dá)呈上調(diào)趨勢，同時(shí)發(fā)現(xiàn)其幼苗葉片中FRK基因表達(dá)量上調(diào)了3.3倍，暗示FRK在干旱脅迫下發(fā)揮著重要作用[12]。目前有關(guān)FRK抗病分子機(jī)理研究在大豆、玉米、水稻、大麥等作物上有涉及[1]。

木薯（ManihotesculentaCrantz）為多年生灌木狀植物，因其塊根富含淀粉類物質(zhì)，與馬鈴薯、甘薯一同被稱為世界三大薯類作物，是熱帶地區(qū)的重要口糧。其主要分布在我國南方的熱帶亞熱帶地區(qū)，如廣西、廣東、海南等省（區(qū)），其中廣西種植量最大，產(chǎn)量位居第一。木薯在種植過程中主要病害有8種，細(xì)菌性萎蔫?。–assavabacterialblight，CBB）是危害最為嚴(yán)重的病害之一，嚴(yán)重時(shí)可造成高達(dá)90%的產(chǎn)量損失[13]。目前CBB抗病分子機(jī)理還不清楚。在擬南芥中，F(xiàn)RK1是先天免疫下游標(biāo)記基因，該基因的表達(dá)意味著病原相關(guān)分子模式觸發(fā)的免疫反應(yīng)（PAMP-triggeredimmunity，PTI）途徑的啟動(dòng)。因此，本研究以模式植物擬南芥為參照，采用同源序列法識(shí)別木薯FRK1類似基因并對(duì)其進(jìn)行生物信息學(xué)及表達(dá)量分析，以期進(jìn)一步推動(dòng)木薯PTI相關(guān)研究，從而加快高產(chǎn)抗病木薯品種選育工作的步伐。

1材料與方法

1.1材料

以木薯SC8品種30d組培幼苗為材料，水培煉苗1周后進(jìn)行處理，共設(shè)置3個(gè)處理，各處理分別為：①100μmol/L水楊酸（SA），②100μmol/L茉莉酸（JA），③黃單胞菌（Xam，OD600為0.6～0.8）。每個(gè)處理20株苗，3個(gè)重復(fù)。SA、JA利用噴霧的方式進(jìn)行處理，Xam利用剪葉法接種進(jìn)行處理，以無菌水作為對(duì)照。SA、JA處理后分別在0（CK）、15、30、60、120min取樣，病原菌Xam處理后分別在0（CK）、2、4、8d取樣，取樣部位均為植株葉片，每個(gè)樣品各取10片葉用錫箔紙包好后置于–80℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2方法

1.2.1木薯葉片總RNA的提取及cDNA合成取木薯葉片0.1g，速凍研磨，參照植物總RNA提取試劑盒（TIANGEN）說明書進(jìn)行木薯葉片總RNA的提取。完成后迅速將總RNA溶解到30μL無酶無菌水中，加DNAⅠ消除總RNA中少量DNA，并用1%瓊脂糖凝膠檢測RNA條帶的完整性及DNA的消除情況。取5μL總RNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，具體實(shí)驗(yàn)步驟參照RevertAidFirstStandcDNAsynthesis（Thermo）說明書進(jìn)行。

1.2.2木薯FRK1類似基因的篩選在NCBI（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/protrin/）數(shù)據(jù)庫檢索得到擬南芥FRK1基因的相關(guān)信息（ORF序列和氨基酸序列），然后在Phytozome（https：//phytozome.jgi.doe.gov/）網(wǎng)站上下載木薯全基因組等相關(guān)數(shù)據(jù)[14]。以擬南芥FRK1蛋白作為輸入序列，運(yùn)用BLASTP軟件對(duì)木薯FRK類似基因進(jìn)行搜索鑒定，e值設(shè)置為–10。

1.2.3木薯FRK基因生物信息學(xué)分析（1）木薯FRK基因家族同源性分析。運(yùn)用ClustalW軟件對(duì)擬南芥FRK1氨基酸序列和木薯FRK氨基酸序列進(jìn)行多序列聯(lián)配分析，序列比對(duì)結(jié)果通過軟件Mega7（http：//www.megasoftware.net/）的鄰接法（neighbor-joiningmethod，NJ）構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，Bootstrap值設(shè)為1000。

（2）木薯FRK類似基因的結(jié)構(gòu)分析。木薯FRK基因的內(nèi)含子和外顯子信息下載于Phytozome（https：//phytozome.jgi.doe.gov/）網(wǎng)站，使用在線網(wǎng)站GSDS（http：//gsds.cbi.pku.edu.cn/）繪制基因模式圖。

（3）木薯FRK類似基因的保守基序分析。利用蛋白質(zhì)保守基序在線搜索程序MEME（http：//meme.nbcr.net/meme/cgi-bin/meme.cgi）預(yù)測木薯FRK蛋白的保守基序，設(shè)置查找基序重復(fù)的數(shù)量為“any”。

（4）木薯FRK類似基因染色體定位分析。運(yùn)用在Phytozome（https：//phytozome.jgi.doe.gov/）網(wǎng)站上下載的木薯FRK類似基因信息制作染色體定位圖。

（5）木薯FRK上游基因共表達(dá)分析。使用在線網(wǎng)站STRING（http：//www.string-db.org/）的數(shù)據(jù)庫，得到擬南芥FRK1蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖。預(yù)測木薯FRK1蛋白的互作關(guān)系。

（6）木薯FRK基因響應(yīng)逆境的表達(dá)值熱圖。在NCBI的SRA（sequencereadarchive）數(shù)據(jù)庫中下載Xam（Xanthomonasaxonopodispv.manihotis）細(xì)菌侵染木薯所得的3個(gè)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)包[15]（SRR1050891、SRR1050892、SRR1050893）。參考文獻(xiàn)[16]的方法計(jì)算MeERF基因在生物脅迫處理下的RPKM值。用Mev（MultiExperimentViewe）軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，內(nèi)置HCL程序進(jìn)行層次聚類[16]。

1.2.4MeFRK1基因Real-timePCR表達(dá)分析利用Oligo7軟件對(duì)MeFRK1基因進(jìn)行特異性引物設(shè)計(jì)，隨后利用一般PCR試驗(yàn)檢驗(yàn)其擴(kuò)增特異性。使用在線網(wǎng)站NCBI的BLAST檢索確認(rèn)設(shè)計(jì)的Real-timePCR引物的特異性。所用引物序列為MeFRK1-F：5-TTCGGTTCCTTTTGCTCTCG-3，MeFRK1-R：5-TGCCATGAGGATGACTACCAA-3。引物合成由華大基因科技服務(wù)有限公司完成。

Real-timePCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?5℃30s；95℃5s，55℃30s，72℃30s，25個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min。結(jié)果采用2–△△CT的計(jì)算方法進(jìn)行相對(duì)定量，以木薯EF1a基因作為內(nèi)標(biāo)校正模板量。每個(gè)樣品3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。各激素處理時(shí)間點(diǎn)MeFRK1基因的表達(dá)水平與處理0min（處理前）相比。使用SigmaPlot軟件處理數(shù)據(jù)并制圖。

2結(jié)果與分析

2.1木薯FRK1同源基因分析

利用AtFRK1的蛋白序列進(jìn)行搜索，共獲得8條木薯FRK類似基因，按照比對(duì)結(jié)果順序命名為MeFRK1～MeFRK8，具體信息見表1。在木薯基因組中，8個(gè)FRK類似基因氨基酸長度各不相同，位于804～921aa之間，其中最長的是MeFRK8，有921個(gè)氨基酸，最短的是MeFRK3，有804個(gè)氨基酸，蛋白質(zhì)序列平均長度為863aa（表1）?；蛟谌旧w上的位置信息是研究基因家族進(jìn)化和功能的重要證據(jù)。8個(gè)FRK類似基因在木薯染色體上呈不均勻分布，其中MeFRK1位于4號(hào)染色體上，MeFRK4、MeFRK5、MeFRK6、MeFRK7、MeFRK8均位于11號(hào)染色體上，而MeFRK2和MeFRK3位于核骨架Scaffold上（表1，圖1）。

2.2木薯FRK類似基因同源性及結(jié)構(gòu)分析

由圖2可知，MeFRK1～MeFRK8和AtFRK1同源性分析可將其分為兩大類。第一大類主要有5個(gè)基因，分別為MeFRK2、MeFRK3、MeFRK4、MeFRK6、MeFRK8，屬于同一亞族[17]。其中MeFRK2和MeFRK6的同源性為99%，MeFRK8與組中各基因的同源性均較高，為100%。第二大類主要有4個(gè)基因，分別為AtFRK1、MeFRK1、MeFRK5和MeFRK7，其中MeFRK5和MeFRK7與AtFRK1的同源性為50%，為旁系同源性，MeFRK5和MeFRK7的同源性更近，為100%。通過對(duì)9個(gè)基因的同源性分析發(fā)現(xiàn)，8個(gè)木薯FRK類似基因與AtFRK1存在較高的同源性，同時(shí)木薯8個(gè)FRK類似基因間也存在較高的同源性。該基因家族中存在如此多的同源旁系基因，可能與木薯在適應(yīng)不同的生長環(huán)境而進(jìn)行有序的基因表達(dá)存在一定的關(guān)聯(lián)[18]。根據(jù)基因結(jié)構(gòu)分析結(jié)果（圖3），也可將8個(gè)類似基因分為兩大類，其結(jié)果與進(jìn)化樹結(jié)果一致。

2.3木薯FRK類似基因編碼蛋白保守基序分析

通過保守基序預(yù)測發(fā)現(xiàn)，8個(gè)MeFRK蛋白與AtFRK蛋白均存在3個(gè)相同保守基序Motif1、Motif2和Motif3（圖4），基序長度位于50～250aa之間（表2）。其中，Motif1為酪氨酸蛋白激酶（proteintyrosinekinase，PTK）結(jié)構(gòu)域，能催化多種底物蛋白質(zhì)酪氨酸殘基磷酸化，在細(xì)胞生長、增殖、分化中具有重要作用。Motif2為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)碳水化合物結(jié)合蛋白（carbohydrate-bindingproteinoftheER）結(jié)構(gòu)域。Motif3為富含亮氨酸重復(fù)（leucinerichrepea，LRR）結(jié)構(gòu)域，參與蛋白質(zhì)的相互作用，是已知抗病蛋白的重要結(jié)構(gòu)。

綜上，8個(gè)MeFRK蛋白可能均參與蛋白質(zhì)間的相互作用。其中，MeFRK1與AtFRK1的同源性最近，為旁系同源性。因此初步篩選MeFRK1基因?yàn)槟臼砘蚪M中先天免疫下游標(biāo)記基因。

2.4木薯FRK基因上游基因共表達(dá)分析

由圖5和表3可知，預(yù)測MeFRK1蛋白與10個(gè)蛋白存在互作關(guān)系，其中8種與2C型蛋白磷酸酶（proteinphosphatase2c，PP2C）相關(guān)，WRKY6也涉及其中。PP2C基因在脫落酸（abscisicacid，ABA）、茉莉酸（jasmonicacid，MeJA）以及水楊酸（salicylicacid，SA）等激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中發(fā)揮著重要作用，參與調(diào)節(jié)木薯在高滲、干旱以及低鹽等逆境中的生存能力[19-20]。由此可推測，F(xiàn)RK1基因也可能參與木薯的生長發(fā)育，是木薯應(yīng)對(duì)不同逆境潛在信號(hào)因子之一。另有研究顯示，WRKY轉(zhuǎn)錄因子家族廣泛參與植物的生長發(fā)育、代謝調(diào)控、生物脅迫與非生物脅迫應(yīng)答等過程，是植物免疫系統(tǒng)中許多信號(hào)通路的核心組成部分，如PTI基礎(chǔ)防御以及ETI系統(tǒng)獲得性抗性，對(duì)于木薯抗病性的研究具有重要的指導(dǎo)意義[21]；而WRKY6在木薯響應(yīng)生物脅迫時(shí)呈正調(diào)控作用，進(jìn)而推測FRK基因家族也參與木薯生物脅迫應(yīng)答過程。

2.5木薯FRK基因響應(yīng)逆境的表達(dá)值熱圖

通過對(duì)各基因接菌Xam前后葉片表達(dá)量變化趨勢分析發(fā)現(xiàn)，隨著時(shí)間的推移，MeFRK1和MeFRK3的表達(dá)量呈不斷上調(diào)的變化趨勢，但MeFRK1的變化趨勢更明顯；MeFRK2、MeFRK4、MeFRK6三個(gè)基因表達(dá)量呈先下調(diào)后上調(diào)且表達(dá)水平接近；而MeFRK8表達(dá)量呈先上調(diào)后下調(diào)的變化趨勢，MeFRK7不斷下調(diào)，但MeFRK5一直維持在一個(gè)相對(duì)較穩(wěn)定的水平（圖6）。

2.6不同處理葉片中MeFRK1基因表達(dá)量測定

利用Real-timePCR法測定SC8組培幼苗葉片MeFRK1基因在SA、JA和病原菌Xam三種處理下的瞬時(shí)表達(dá)量[22]，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，其在3種處理下基本均呈先上升后下降的變化趨勢（圖7）。在激素SA、JA處理后15min時(shí)二者達(dá)到最大值，而在病原菌Xam處理后第4天時(shí)達(dá)到最大值，其表達(dá)量是激素SA處理時(shí)最大值的2.84倍，是JA處理后的3.06倍。由此可以說明，病原菌Xam脅迫更能誘導(dǎo)MeFRK基因的表達(dá)，有助于提高木薯對(duì)病原菌Xam的抗性。本研究通過對(duì)木薯MeFRK1基因瞬時(shí)表達(dá)的研究，為分離鑒定木薯PTI途徑下游的標(biāo)記基因，研究木薯抗病分子機(jī)理有著重要的意義。

3討論

木薯因富含淀粉被譽(yù)為“淀粉之王”“地下糧倉”等[23]。而FRK是植物中糖代謝的關(guān)鍵酶，因此研究FRK對(duì)木薯淀粉的儲(chǔ)藏、改善食用風(fēng)味，提高抗病能力等有著重要的作用。研究發(fā)現(xiàn)，植物中果糖可作為信號(hào)分子直接或通過與其他信號(hào)通路交叉調(diào)節(jié)基因的表達(dá)，在植物遭受逆境脅迫中發(fā)揮重要作用[24]。近年來，隨著生物信息學(xué)技術(shù)普遍應(yīng)用及基因組學(xué)、蛋白組學(xué)的研究快速發(fā)展，有更多潛在的FRK基因在多種植物中被挖掘。如FRK1在番茄整株植株中均有表達(dá)，F(xiàn)RK2具有庫特異性，而在源器官中表達(dá)很低[6]。FRK在缺氧條件下對(duì)水稻幼苗碳水化合物代謝發(fā)揮著重要作用，在轉(zhuǎn)錄水平上，OsFRK1優(yōu)先在有氧條件下表達(dá)，而OsFRK2需要在缺氧條件下表達(dá)[2]。

目前，有關(guān)木薯中FRK基因的抗病性還不清楚。本研究基于擬南芥先天免疫下游標(biāo)記基因FRK1，通過搜索從木薯基因組中篩選出8個(gè)類似基因。隨后利用生物信息學(xué)中的軟件對(duì)其進(jìn)行同源性、在染色體中的位置、蛋白結(jié)構(gòu)以及蛋白質(zhì)間的相互作用等進(jìn)行分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，MeFRK1、MeFRK5和MeFRK7三個(gè)基因與AtFRK1親緣關(guān)系最近，基因相似度最高，由此推斷，此4個(gè)基因在起源上存在一定的相關(guān)性。通過染色體定位發(fā)現(xiàn)，8個(gè)FRK類似基因在木薯染色體上呈不均勻分布，可能分別在木薯生長發(fā)育過程中承擔(dān)不同的功能。在8個(gè)基因中只有MeFRK1位于4號(hào)染色體，與AtFRK1屬于旁系同源，其余5個(gè)位于11號(hào)染色體上，其結(jié)果與雙子葉植物擬南芥等的FRK家族成員在染色體定位基本一致[1]。通過保守基序分析發(fā)現(xiàn)，9個(gè)蛋白存在3個(gè)相同的保守基序，長度位于50～250aa間，且基序的次序和間隔長度比較保守。該家族基因編碼蛋白基序的保守性暗示在木薯中不同的FRK蛋白可能存在功能冗余現(xiàn)象。同時(shí)對(duì)3個(gè)保守基序功能進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，Motif3參與了蛋白質(zhì)間的相互作用，是已知抗病蛋白的重要結(jié)構(gòu)[25]。木薯FRK1類似基因不僅與擬南芥FRK1基因親緣關(guān)系較近，基因結(jié)構(gòu)相似，且二者的功能也類似。由此初步篩選MeFRK1為木薯基因組免疫下游標(biāo)記基因。

激素是植物對(duì)生物非生物脅迫反應(yīng)的調(diào)節(jié)劑，參與各種復(fù)雜的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，以此調(diào)節(jié)不同的應(yīng)激反應(yīng)。水楊酸（SA）、乙烯（ET）、茉莉酸（JA）和脫落酸（ABA）4種激素主要調(diào)節(jié)植物對(duì)病原體的防御[26]。當(dāng)用激素處理植物后，其PRRs識(shí)別PAMPs分子，短時(shí)間內(nèi)植物做出的應(yīng)答反應(yīng)就包括啟動(dòng)水楊酸、茉莉酸信號(hào)傳導(dǎo)途徑[27]?；虮磉_(dá)模式分析在一定程度可推測基因的分子功能，有利于對(duì)該基因功能的研究。本研究通過SA、JA的噴施、黃單胞菌（Xam）的侵染3種方法分別處理木薯葉片，通過分析處理后木薯葉片中FRK1基因在不同時(shí)間的表達(dá)量變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，MeFRK1基因的表達(dá)量在3種處理下呈差異性表達(dá)，表明此基因可能是木薯生物逆境脅迫系統(tǒng)中的關(guān)鍵標(biāo)記因子。在SA處理后，MeFRK1的表達(dá)量在15min時(shí)達(dá)到最高值，其余時(shí)間均表現(xiàn)為下調(diào)。同樣，在JA處理后，15min時(shí)表達(dá)量也遠(yuǎn)高于對(duì)照組，是對(duì)照組的1.5倍以上，隨之下降，在60min和120min的表達(dá)量接近于零。說明此基因在響應(yīng)SA和JA信號(hào)途徑時(shí)，短時(shí)間內(nèi)具有正調(diào)控作用，且反應(yīng)較為迅速。在響應(yīng)生物脅迫時(shí)，3個(gè)時(shí)間的相對(duì)表達(dá)量均高于對(duì)照組，在第4天時(shí)達(dá)到最高值，接近對(duì)照的5倍。由此說明，此基因?qū)τ诓≡嚓P(guān)分子機(jī)制能夠做出快速響應(yīng)，暗示其可能與抗病途徑有關(guān)。

植物在生長發(fā)育過程中，經(jīng)過長期對(duì)逆境的適應(yīng)，自身也產(chǎn)生一些免疫防御機(jī)制，通過上調(diào)或下調(diào)某個(gè)或某些基因的表達(dá)量來調(diào)控逆境有關(guān)信號(hào)通路以適應(yīng)環(huán)境的變化[16]。而植物細(xì)胞中的糖類物質(zhì)可在FRK作用下通過活化免疫反應(yīng)參與植物防衛(wèi)過程，在病原菌等生物脅迫中發(fā)揮重要作用[28]。木薯是熱帶地區(qū)重要的糧食及能源物質(zhì)，其在生長發(fā)育過程中面臨著病蟲害等多種生物非生物的脅迫，嚴(yán)重影響了木薯的產(chǎn)量和品質(zhì)。因此，提高木薯抵抗逆境脅迫的能力至關(guān)重要。本研究通過對(duì)木薯FRK類似基因進(jìn)行篩選分析，并在3種處理情況下驗(yàn)證其瞬時(shí)表達(dá)量，其結(jié)果可為后期驗(yàn)證木薯FRK基因的功能、研究其相關(guān)信號(hào)通路及抗病調(diào)控機(jī)理提供參考。