李宏鐸，李亞楠，沙 淼，夏 天，崔 迎，楊曉莉

（1.西安市食品藥品檢驗(yàn)所，陜西 西安 710054；2.國(guó)家藥品監(jiān)督管理局藥品微生物檢測(cè)技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西 西安 710065；3.陜西省食品藥品檢驗(yàn)研究院，陜西 西安 710065）

2020 年版《中國(guó)藥典》 四部0122 貼膏劑規(guī)定貼膏劑包括凝膠貼膏（原巴布膏劑或凝膠膏劑） 和橡膠貼膏（原橡膠膏劑）［1］。2005 年版《中國(guó)藥典》 二部微生物限度檢查法引入驗(yàn)證理念，使得檢測(cè)結(jié)果更科學(xué)準(zhǔn)確［2］。在微生物限度檢查項(xiàng)下規(guī)定，凝膠貼膏和橡膠貼膏的控制菌為每10 cm2不得檢出金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌。

金黃色葡萄球菌（Staphylococcusaureus） 在自然界中廣泛存在，30%～80% 的人為該病原菌的攜帶者［3］，約32%的食品中含有該菌［4］，金黃色葡萄球菌也是最常見的化膿性感染致病菌［5］。而銅綠假單胞菌 （Pseudomonas aeruginosa） 為條件致病菌，可引起傷口、呼吸道、泌尿道的感染［6-7］。目前藥品微生物檢查的生化方法，操作繁瑣，時(shí)間長(zhǎng)［8］，需要建立更加準(zhǔn)確、快速的檢測(cè)方法。

藥品控制菌檢驗(yàn)的技術(shù)有實(shí)時(shí)熒光PCR 技術(shù)、變性梯度凝膠電泳、隨機(jī)引物擴(kuò)增多態(tài)性技術(shù)、基因芯片技術(shù)、核酸分子雜交技術(shù)等［9-10］。實(shí)時(shí)熒光PCR 靈敏度高，特異性好，是目前微生物檢驗(yàn)重要手段［11］。多重?zé)晒釶CR 通過使用多對(duì)引物、探針，能同時(shí)對(duì)多個(gè)目標(biāo)序列檢測(cè)，結(jié)果更快速、準(zhǔn)確［12］。劉婷婷等［13］建立了實(shí)時(shí)熒光PCR 技術(shù)檢驗(yàn)金黃色葡萄球菌。申應(yīng)德等［14］建立了藥品中沙門菌熒光PCR 方法。柯振華等［15］建立了金黃色葡萄球菌、沙門氏菌和副溶血性弧菌的多重PCR 方法。張靜等［16］提出了食源有害微生物DNA 快速提取與多重PCR 檢測(cè)初探。胡興娟等［17］進(jìn)行了四重?zé)晒舛縋CR 法對(duì)腸炎、鼠傷寒以及傷寒沙門氏菌的鑒定。

1 材料

1.1 儀器與試劑 LC480 熒光定量PCR 儀（瑞士羅氏公司）；5430R 高速冷凍離心機(jī)、Biospectrometer 紫外／可見光／熒光分光光度計(jì)（德國(guó)艾本德公司）。細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒［天根生化科技（北京） 有限公司］；熒光定量PCR 反應(yīng)試劑盒（日本TaKaRa 公司）；胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基（北京三藥科技開發(fā)公司）。水為超純水。

1.2 菌株 見表1。

表1 菌株樣品信息

1.3 引物及探針 參考文獻(xiàn)［18］ 報(bào)道，金黃色葡萄球菌根據(jù)femB基因序列，銅綠假單胞菌根據(jù)ETA基因序列設(shè)計(jì)引物及探針，見表2。

表2 引物與TaqMan 探針

1.4 藥物 本實(shí)驗(yàn)樣品為2021 年國(guó)家藥品評(píng)價(jià)性抽驗(yàn)品種麝香壯骨膏，共計(jì)全國(guó)40 個(gè)生產(chǎn)廠家，260 批。按照2020 年版《中國(guó)藥典》 四部檢查控制菌后，均為未檢出，作為陰性樣品。

2 方法

2.1 細(xì)菌培養(yǎng)及模板DNA 的提取 分別吸取1 mL 菌株的純培養(yǎng)液，細(xì)菌基因組DNA 提取試劑盒提取DNA，Biospectrometer 紫外／可見光／熒光分光光度計(jì)測(cè)定核酸濃度。建立DNA 模板庫，保存于-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

2.2 熒光定量PCR 檢測(cè)方法 雙重?zé)晒舛縋CR 反應(yīng)體系為25 μL，體系組成為10×Probe qPCR mix 12.5 μL，正向、反向引物（10 mol／L） 各1 μL，探針0.5 μL，模板DNA 2 μL，加水至25 μL。實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀反應(yīng)參數(shù)為95 ℃預(yù)變性1 min；95 ℃變性15 s，60 ℃退火并延伸45 s，共40 個(gè)循環(huán)，在每個(gè)循環(huán)的60 ℃退火并在延伸階段收集熒光信號(hào)。設(shè)立培養(yǎng)基提取陰性對(duì)照，無菌水為空白對(duì)照。

2.3 靈敏度 按“2.2” 項(xiàng)下反應(yīng)體系對(duì)金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌進(jìn)行雙重?zé)晒釶CR 反應(yīng)，將DNA 模板10倍系列稀釋，同時(shí)用胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基對(duì)其進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)。選取10-1～10-6DNA 濃度，其對(duì)應(yīng)的初始菌濃度對(duì)數(shù)值與Ct 值作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2.4 特異性 按“2.2” 項(xiàng)下反應(yīng)體系將24 株菌的DNA同時(shí)添加為模板，進(jìn)行雙重?zé)晒舛縋CR 反應(yīng)。此24 種菌為日常藥品檢測(cè)中常見菌種、革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌、球菌、桿菌的典型代表，同時(shí)加入模板可以范圍更廣的證明所用引物特異性的優(yōu)劣。

2.5 重復(fù)性 選取不同濃度金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌DNA 模板混合后，進(jìn)行3 次PCR 分析，比較重復(fù)性。

2.6 控制菌檢查方法 取供試品100 cm2，加5 mL 聚山梨酯80，再加pH 7.0 無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液至100 mL，混勻，靜置，取水相為1 ∶10 的供試液，分別取10 mL 供試液接種至胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中混勻，一份按照《中國(guó)藥典》 規(guī)定方法進(jìn)行檢驗(yàn)，另一份將菌液濃度為10 cfu／mL 金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌加入到培養(yǎng)基中，35 ℃培養(yǎng)24 h，取增菌液1 mL，按細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取DNA 作模板，進(jìn)行熒光定量PCR 檢測(cè)。

3 結(jié)果

3.1 靈敏度試驗(yàn)結(jié)果 金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌基因組DNA 梯度稀釋至10-6。金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌最低檢測(cè)限分別為20、10 cfu／mL，結(jié)果見圖1～2。以DNA 稀釋倍數(shù)為橫坐標(biāo)（X），Ct 值為縱坐標(biāo)（Y） 進(jìn)行回歸，得到金黃色葡萄球菌方程為Y＝3.536X+13.77 （R2＝0.998 7），銅綠假單胞菌方程為Y＝3.325X+15.68 （R2＝0.997 2）。表明Ct 值與DNA 濃度的對(duì)數(shù)值的線性關(guān)系良好，檢測(cè)體系準(zhǔn)確可靠。

圖1 金黃色葡萄球菌靈敏度試驗(yàn)結(jié)果

圖2 銅綠假單胞菌靈敏度試驗(yàn)結(jié)果

3.2 特異性試驗(yàn)結(jié)果 雙重?zé)晒舛縋CR 反應(yīng)對(duì)24 株菌株的結(jié)果見圖3～4。金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌Ct 值分別為16、17，其他菌株均為陰性反應(yīng)。表明對(duì)金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌的雙重?zé)晒釶CR 反應(yīng)特應(yīng)性好，能夠同時(shí)用來檢測(cè)貼膏劑中的金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌這2 種控制菌。

圖3 金黃色葡萄球菌特異性試驗(yàn)結(jié)果

圖4 銅綠假單胞菌特異性試驗(yàn)結(jié)果

3.3 重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果 相同濃度每次擴(kuò)增曲線基本吻合。金黃色葡萄球菌的Ct 值分別為15.43、15.36、15.39，變異系數(shù)為0.19%，銅綠假單胞菌的Ct 值分別為18.22、18.31、18.27，變異系數(shù)為0.20%，均小于2%，表明該方法重復(fù)性良好。結(jié)果見圖5～6。

圖5 金黃色葡萄球菌重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果

圖6 銅綠假單胞菌重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果

3.4 控制菌檢查方法結(jié)果 采用建立的雙重?zé)晒釶CR 方法和藥典規(guī)定的控制菌檢驗(yàn)方法，對(duì)來自40 個(gè)藥廠的271份國(guó)家藥品評(píng)價(jià)性抽驗(yàn)麝香壯骨膏同時(shí)進(jìn)行檢驗(yàn)，2 種方法均未檢出金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌，結(jié)果一致。

4 討論

藥品中污染微生物是評(píng)價(jià)藥品質(zhì)量和安全性的重要指標(biāo)，藥品控制菌檢查是對(duì)微生物污染進(jìn)行定性檢測(cè)［19］，隨著GMP、《中國(guó)藥典》 和相關(guān)技術(shù)指南的不斷提高，對(duì)于藥品及其生產(chǎn)過程中微生物的檢測(cè)、鑒定和溯源的要求，分子生物學(xué)方法開始應(yīng)用于藥品微生物檢驗(yàn)中來。

本研究建立的雙重實(shí)時(shí)熒光PCR 方法，確定了反應(yīng)體系和反應(yīng)參數(shù)，通過對(duì)金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌與樣品和環(huán)境中污染概率較大，一些生化反應(yīng)相同的干擾菌株同時(shí)進(jìn)行檢驗(yàn)，表明該方法特異性高，滿足日常檢驗(yàn)需求。實(shí)時(shí)熒光PCR 檢測(cè)下限為10～100 cfu［20］。本研究建立的金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌檢測(cè)限分別可達(dá)到20、10 cfu／mL，具有良好的靈敏度。但熒光PCR 法也存在不足，傳統(tǒng)的生化檢驗(yàn)方法，活菌能夠被培養(yǎng)，進(jìn)而被分離鑒別，而死菌不能夠被培養(yǎng)，也就無法被檢測(cè)到。由于滅菌工藝的不同，死菌可能殘留在樣品中，通過熒光PCR 方法死菌也會(huì)被檢測(cè)到而判定為陽性。這也可能是熒光PCR方法沒有被廣泛應(yīng)用于的藥品控制菌檢驗(yàn)中的原因之一。

麝香壯骨膏工藝中雖無滅菌工藝，但由于制法中藥品原料都經(jīng)過熬制微生物污染可能小，輔料與包裝過程可能存在污染。雖然沒有陽性結(jié)果數(shù)據(jù)，通過陰性結(jié)果數(shù)據(jù)表明熒光PCR 方法具有靈敏、快速特點(diǎn)，提高了藥品日常檢驗(yàn)工作的效率，對(duì)日常的藥品微生物檢驗(yàn)工作中，大批量相同樣品的金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌的污染的初篩，雙重?zé)晒釶CR 法能夠提供有效的幫助，也為今后建立不同組合和更多控制菌的同步檢測(cè)打下了良好基礎(chǔ)。