李曉晨，王 帥，李天嬌，趙 琳*，包永睿*，孟憲生，王義明，羅國安，張貴民，關(guān)永霞，程國良，李 冰

（1.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，遼寧 大連 116600；2.清華大學(xué)，北京 100084；3.中藥制藥共性技術(shù)國家重點實驗室，山東 臨沂 276000）

鼻淵通竅顆粒由辛夷、蒼耳子（炒）、麻黃、連翹、黃芩等14 味中藥組成，是在《濟生方》 所載“蒼耳散”的基礎(chǔ)上加味而成，配伍嚴謹，組方合理，具有扶正祛邪、益氣固表的功效［1］?，F(xiàn)代臨床用于用鼻淵（急性鼻竇炎）、反復(fù)感冒、鼻塞、流涕。多種中藥配伍應(yīng)用，實現(xiàn)了多層面、多途徑、多靶點的調(diào)節(jié)治療作用。目前，關(guān)于鼻淵通竅顆粒的報道僅限于常規(guī)的定性定量研究，對其物質(zhì)基礎(chǔ)的研究鮮有報道［2-11］。而中藥的藥效物質(zhì)不清晰、不明確恰是阻礙中藥發(fā)展的關(guān)鍵問題。本實驗擬對鼻淵通竅顆粒藥效物質(zhì)基礎(chǔ)進行研究，采用超高效液相色譜-四極桿-飛行時間質(zhì)譜（UPLC-Q-TOF-MS／MS） 法對鼻淵通竅顆粒中的化學(xué)成分進行表征，并在明確鼻淵通竅顆粒的化學(xué)成分的同時，進一步對鑒定成分進行結(jié)構(gòu)層級分類，根據(jù)結(jié)構(gòu)-活性關(guān)系為鼻淵通竅顆粒藥效活性、質(zhì)控指標的篩選評價提供參考，以期為其今后藥效物質(zhì)基礎(chǔ)及臨床合理應(yīng)用等研究奠定扎實的前期基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 試劑與藥物 鼻淵通竅顆粒（批號0022003008，山東新時代藥業(yè)有限公司）；綠原酸、連翹苷、阿魏酸、槲皮素、1，3-二咖啡奎寧酸對照品（批號753-8701、821-9401、0773-9910、100081-200406、111717-200501，純度＞98%，中國食品藥品檢定研究院）；橙皮苷、咖啡酸、歐前胡素、佛手柑內(nèi)酯、木犀草素、芹糖基甘草苷對照品 （批號160590、17122804、160511、150126、17120702、140614，成都普菲德生物技術(shù)有限公司）；黃芩素、甘草苷、白楊素、木犀草苷、蒙花苷對照品（批號18021403、16071504、18042601、16071504、16080201，四川省維克奇生物科技有限公司）。甲醇（色譜純，德國Merck 公司）；甲酸（色譜純，美國Thermo Fisher Scientific 公司）；純凈水（杭州娃哈哈集團有限公司）。

1.2 儀器 Agilent 1290 型快速高效液相色譜儀、Agilent 6550 Q-TOF-MS 質(zhì)譜 （美國 Agilent 公司）；Sartorius CP225D 電子分析天平（德國Sartorius 公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液制備2.1.1 對照品溶液 精密稱取綠原酸、咖啡酸、1，3-二咖啡酰奎寧酸、芹糖甘草苷、甘草苷、阿魏酸、橙皮苷、連翹苷、黃芩苷、槲皮素、木犀草素、蒙花苷、佛手柑內(nèi)酯、白楊素、黃芩素、歐前胡素對照品適量，置于10 mL棕色量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，離心，取上清液，即得。

2.1.2 供試品溶液 取鼻淵通竅顆粒細粉2.0 g，精密稱定，至具塞錐形瓶中，加入25 mL 甲醇，精密稱定質(zhì)量，超聲處理40 min，放冷后用甲醇補足減失的質(zhì)量，過濾，取續(xù)濾液，0.22 μm 微孔濾膜過濾，即得。

2.2 UPLC-Q-TOF-MS／MS 分析條件

2.2.1 色譜 Agilent poroshell120 SB-C18色譜柱（100 mm×2.1 mm，2.7 μm）；流動相0.1%甲酸（A）-甲醇（B），梯度洗脫（0～30 min，5%～100%B）；體積流量0.4 mL／min；柱溫30 ℃；進樣量0.5 μL。

2.2.2 質(zhì)譜 電噴霧離子源（ESI）；正、負離子模式；毛細管電壓4 000 V （ESI+）、-3 500 V （ESI-）；干燥氣體溫度250 ℃；鞘氣溫度350 ℃；干燥氣體體積流量13 L／min；鞘氣體積流量11 L／min；霧化器壓力45 psi （1 psi＝6.895 kPa）；碎裂電壓125 V；質(zhì)量范圍m／z100～1 000。

2.3 數(shù)據(jù)分析 結(jié)合中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺，PubChem 數(shù)據(jù)庫中質(zhì)譜信息以及相關(guān)文獻，建立全方化學(xué)成分信息庫，要色譜峰的精確相對分子質(zhì)量與自建的化學(xué)成分信息庫進行比對，推測各化合物的分子式，結(jié)合對照品質(zhì)譜碎片信息對色譜峰進行指認以及化學(xué)結(jié)構(gòu)層級分類。

2.4 化學(xué)成分分析 取“2.1” 項下對照品溶液、供試品溶液適量，在“2.2” 項條件下進樣測定，依據(jù)對照品保留時間和文獻報道分析數(shù)據(jù)，對各色譜峰進行成分鑒定，再進一步將鼻淵通竅顆粒全方圖譜中已知化合物的保留時間與各單味藥圖譜的色譜峰進行比對，將各化合物結(jié)構(gòu)進行層級分類。

3 結(jié)果

3.1 UPLC-Q-TOF-MS／MS 成分鑒定 取“2.1” 項下對照品溶液、供試品溶液適量，在“2.2” 項條件下進樣測定，得正、負離子模式下的基峰離子圖，見圖1。

圖1 鼻淵通竅顆粒正、負離子模式下基峰離子圖

按“2.3” 項下MS 數(shù)據(jù)分析方法確定化學(xué)成分的結(jié)構(gòu)，對鼻淵通竅顆粒主要成分進行快速表征出105 個色譜峰，結(jié)果共推斷出104 種化學(xué)成分，包括29 種黃酮類、19種萜類、12 種木脂素類、11 種香豆素類、9 種醌類、24 種其他類，結(jié)果見表1。

表1 鼻淵通竅顆粒中的化學(xué)成分

3.2 主要化合物多層級研究

3.2.1 黃酮類

3.2.1.1 層級分類 黃酮類化合物廣泛存在于自然界，是一類基本母核為2-苯基色原酮的化合物，大部分以游離形式、與糖結(jié)合成苷類或以碳糖基的形式存在，黃酮類化合物在質(zhì)譜條件下的斷裂方式主要有CO、CO2、C2H2O、H2O等中性粒子的丟失和RDA 裂解以及糖基的斷裂。從鼻淵通竅顆粒中共鑒定出29 個黃酮類化合物?；瘜W(xué)結(jié)構(gòu)層級分類見圖2 （其中紅色部分為該類化合物母核結(jié)構(gòu)，紫色為一級結(jié)構(gòu)，藍色為二級結(jié)構(gòu)）。

圖2 黃酮類化合物層級結(jié)構(gòu)分類

3.2.1.2 裂解規(guī)律 以槲皮素為例，正離子模式下可見準分子離子峰為m／z303.050 0 ［M+H］+，其產(chǎn)生的特征二級離子碎片m／z285.039 1 ［M+H-H2O］+、257.043 3 ［M+HH2O-CO］+、247.060 4 ［M+H-2CO］+，均為槲皮素的特征碎片，結(jié)合數(shù)據(jù)庫及文獻報道，與對照品對比，推測54 號峰為槲皮素，其可能的裂解規(guī)律見圖3。

圖3 槲皮素裂解規(guī)律

3.2.2 萜類

3.2.2.1 層級分類 萜類化合物具有（C5H8）n通式及其衍生物，自然界廣泛存在的一類植物次生代謝產(chǎn)物，是植物次生代謝產(chǎn)物中種類最多的化合物，迄今已發(fā)現(xiàn)近40 000種，以異戊二烯為基本結(jié)構(gòu)單位。從鼻淵通竅顆粒中共鑒定出19 個萜類化合物。

3.2.2.2 裂解規(guī)律 以茯苓新酸A 為例，正離子模式下可見準分子離子峰為m／z521.323 7 ［M+Na］+，推測其分子式為C31H46O5，在二級質(zhì)譜中可見碎片離子m／z507.308 1 ［M+Na-CO2］+、489.297 5 ［M+Na-CO2-H2O］+、433.271 3 ［M+Na-CO2-C3H6O2］+特征碎片，推測100 號峰為茯苓新酸A，其可能的裂解規(guī)律見圖4。

圖4 茯苓新酸A 裂解規(guī)律

3.2.3 木脂素類

3.2.3.1 層級分類 木脂素是一類由兩分子苯丙素衍生物（即C6-C3單體） 聚合而成的天然化合物，多數(shù)呈游離狀態(tài)，少數(shù)與糖結(jié)合成苷。組成木脂素的單體有桂皮酸、桂皮醇、丙烯苯、烯丙苯等。它們可脫氫，形成不同的游離基，各游離基相互縮合，即形成各種不同類型的木脂素，結(jié)合位置多在β 位。從鼻淵通竅顆粒中共鑒定出12 個木脂素類化合物。

3.2.3.2 裂解規(guī)律 以連翹苷為例，正離子模式下可見準分子離子峰為m／z557.199 8 ［M+Na］+，推測其分子式為C27H34O11，在二級質(zhì)譜中可見碎片離子m／z395.136 6 ［M+Na-C6H10O］+、379.199 8 ［M+Na-C6H10O6］+、309.134 5［M+Na-C14H16O4］+特征碎片，通過與對照品質(zhì)譜圖比對，推測50 號峰為連翹苷，其可能的裂解規(guī)律見圖5。

圖5 連翹苷裂解規(guī)律

3.2.4 香豆素類

3.2.4.1 層級分類 從鼻淵通竅顆粒中鑒定出11 個香豆素類化合物，該類成分經(jīng)高能碰撞后易發(fā)生CH3、CO 等中性丟失。

3.2.4.2 裂解規(guī)律 以佛手柑內(nèi)酯為例，正離子模式下可見準分子離子峰為m／z239.031 7 ［M+Na］+，推測其分子式為C12H8O4，在二級質(zhì)譜中可見碎片離子m／z224.007 7 ［M+Na-CH3］+、196.012 1 ［M+Na-CH3-CO］+、168.018 8 ［M+Na-CH3-CO-CO］+特征碎片，通過對照品質(zhì)譜圖比對，推測63 號峰為佛手柑內(nèi)酯，其可能的裂解規(guī)律見圖6。

圖6 佛手柑內(nèi)酯裂解規(guī)律

3.2.5 醌類

3.2.5.1 層級分類 醌類化合物是中藥中一類具有醌式結(jié)構(gòu)的化學(xué)成分，主要分為苯醌、萘醌、菲醌、蒽醌。從鼻淵通竅顆粒中共鑒定出9 個醌類化合物。

3.2.5.2 裂解規(guī)律 以丹參酮ⅡA為例，正離子模式下可見準分子離子峰為m／z317.114 7 ［M+Na］+，推測其分子式為C19H18O3，在二級質(zhì)譜中可見碎片離子m／z299.122 7 ［M+Na-CH3］+、302.104 9 ［M+Na-H2O］+特征碎片，通過對照品質(zhì)譜圖比對，推測97 號峰為丹參酮ⅡA。

3.2.6 其他

3.2.6.1 分類 從鼻淵通竅顆粒中鑒定出8 個芳香族類、7 個有機酸類、4 個酯類、3 個生物堿類、2 個脂肪酸類、1個未知化合物。

3.2.6.2 裂解規(guī)律 以綠原酸為例，正離子模式下可見準分子離子峰為m／z377.083 7 ［M+Na］+，推測其分子式為C16H18O9，在二級質(zhì)譜中可見綠原酸特征碎片m／z499.119、203.035 5、193.049 2、163.038 1，通過對照品質(zhì)譜圖比對，推測22 號峰為綠原酸。

4 討論

本研究以鼻淵通竅顆粒為研究對象，采用HPLC-QTOF-MS／MS 技術(shù)對其化學(xué)成分進行表征，進一步對表征出的化學(xué)成分進行層級分類。包括29 個黃酮類成分，推斷其來源于蒼耳子、麻黃、黃芩、天花粉、甘草［12］，所占數(shù)量比重最大，與文獻報道相符；19 種萜類成分，推斷其來源于野菊花、茯苓、甘草；12 種木脂素類成分，主要來源于連翹、地黃［13-14］；9 種醌類成分，主要來源于丹參［15］；11種香豆素類成分，主要來源于白芷［16］；25 種其他類成分，主要來源于辛夷、薄荷、藁本。

化學(xué)結(jié)構(gòu)層級分類是描述經(jīng)典的結(jié)構(gòu)-活性關(guān)系。現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，各種成分發(fā)揮的藥理藥效作用由其母核結(jié)構(gòu)決定，在此基礎(chǔ)上，不同結(jié)合位點所連接的取代基、官能團不同劃分出其二級結(jié)構(gòu)；藥物在體內(nèi)與特定的受體部位發(fā)生相互作用，引發(fā)生物活性，不同結(jié)構(gòu)的化合物影響藥物在體內(nèi)的吸收、分布和代謝。黃酮類化合物基本母核為2-苯基色原酮，黃酮類化合物結(jié)構(gòu)中常連接有酚羥基、甲氧基、甲基、異戊烯基等官能團，基于其不同的結(jié)合位點又將其分為二氫黃酮類、異黃酮類、二氫異黃酮類等。已有研究表明，黃酮類化合物具有抗炎、止咳、祛痰、平喘及抗菌，抗自由基，抗氧化，抑菌，延緩正常組織細胞凋亡，調(diào)節(jié)動物激素，提高機體免疫機能等多種藥理作用［17］；萜類物質(zhì)具有抗炎、免疫調(diào)節(jié)、抗過氧化、抗感冒、抗流感等藥理作用；木脂素類抗病毒、抗菌、保肝作用；醌類成分具有抗菌抗病毒的功效，其中抑菌作用的效果最為顯著；香豆素類成分具有抗炎、解熱、鎮(zhèn)痛、抗病原微生物的作用，用于治療感冒頭痛、眉棱骨痛、鼻淵等［18-19］。

化合物骨架結(jié)構(gòu)決定其性質(zhì)，明確各類成分結(jié)構(gòu)及其一、二級結(jié)構(gòu)，依據(jù)結(jié)構(gòu)-活性關(guān)系可為今后鼻淵通竅顆粒中各類化學(xué)成分的分離結(jié)構(gòu)鑒定，單體化合物的藥效活性篩選和評價以及藥效物質(zhì)基礎(chǔ)及臨床合理應(yīng)用等研究奠定基礎(chǔ)。