張汝勝，李 霞，王亞鳳，陽丙媛，何瑞杰*，黃永林*

（1.桂林理工大學(xué)化學(xué)與生物工程學(xué)院，廣西 桂林 541006；2.廣西植物功能物質(zhì)研究與利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西壯族自治區(qū)中國(guó)科學(xué)院廣西植物研究所，廣西 桂林 541006）

廣西地不容StephaniakwangsiensisLo.是廣西特有植物，屬于防己科千金藤屬多年生草質(zhì)落葉藤本植物，主要分布于當(dāng)?shù)匚鞅?、西南部，生于石灰?guī)r地區(qū)的山地灌叢［1］，具有鎮(zhèn)痛、抗炎［2］、抑菌［3］、抗病毒［4］、殺蟲［5］、治療阿爾茨海默?。?］等作用。該植物藥用部位為根塊，是生產(chǎn)顱痛定的原材料，而地上部分也富含生物堿，其中的青藤堿、氧化青藤堿含量很高。為了提高廣西地不容整體利用率，創(chuàng)建一種快速高效分離制備其非藥用部位中生物堿的方法尤為必要。

高速逆流色譜是一種新型高效的液-液分配色譜技術(shù)，主要通過在2 個(gè)互不相溶的上下相中的分配比的差異來實(shí)現(xiàn)分離，具有無柱污染、無不可逆吸附、進(jìn)樣量大、同一根逆流色譜柱既可用于分析又可用于制備等優(yōu)點(diǎn)［7］。pH 區(qū)帶精制逆流色譜法是在普通制備高速逆流色譜的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的特殊逆流色譜分離制備方法［8］，特別適用于生物堿、有機(jī)酸的制備性分離［9］，本實(shí)驗(yàn)采用該方法對(duì)廣西地不容非藥用部位總生物堿進(jìn)行分離制備，共得到2 個(gè)高純度化合物，以期為相關(guān)大規(guī)模生產(chǎn)提供參考。

1 材料

TBE-300C 型pH 區(qū)帶精制逆流色譜儀（上海同田生物技術(shù)股份有限公司）；LC-20AT 型高效液相色譜儀（日本島津公司）；SP-MAX3500FL 型熒光酶標(biāo)儀（上海閃譜生物科技有限公司）。

阿卡波糖、曲酸、α-葡萄糖苷酶均購自上海源葉生物科技有限公司；酪氨酸酶購自上海麥克林生化科技有限公司。無水碳酸鈉、二氯甲烷、正丁醇、甲醇均為分析純，購于西隴化工股份有限公司。

廣西地不容非藥用部位于2019 年8 月采自廣西桂林恭城瑤族自治縣，經(jīng)廣西植物研究所黃俞淞副研究員鑒定為正品，標(biāo)本（編號(hào)20190824） 保存于廣西植物功能物質(zhì)研究與利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室。

2 方法

2.1 樣品溶液制備 取干燥藥材500 g，粉碎后用95%乙醇回流提取3 次，每次2 h，合并提取液，減壓濃縮至浸膏狀態(tài)，溶于鹽酸（pH＝3） 中，過濾得清液，氨水調(diào)節(jié)pH值至10 左右，二氯甲烷萃取，減壓濃縮得到總生物堿8 g，取1.60 g 至試管中，5 mL 三乙胺固定相溶解，即得。

2.2 溶劑體系制備 前期報(bào)道，與通過HPLC 法測(cè)定K值來確定溶劑系統(tǒng)比較，TLC 法分析Rf值更方便快捷［10-11］，本實(shí)驗(yàn)采用該方法確定二氯甲烷-甲醇-正丁醇-水（10 ∶6 ∶0.1 ∶4） 作為溶劑體系。

2.2.1 正相置換分離模式 量取二氯甲烷850 mL、甲醇510 mL、正丁醇8.5 mL、水340 mL，置于分液漏斗中，室溫下充分混合，靜置分層，將上下相分別收集，上相加入10 mmol／L 三乙胺作固定相，下相加入10 mmol／L 鹽酸為流動(dòng)相，超聲脫氣20 min，即得。

2.2.2 反相置換分離模式 量取二氯甲烷900 mL、甲醇540 mL、正丁醇9 mL、水360 mL，置于分液漏斗中，室溫下充分混合，靜置分層，上下相分別收集，上相加入5 mmol／L 鹽酸作為流動(dòng)相，下相加入10 mmol／L 三乙胺作為固定相，超聲脫氣20 min，即得。

2.3 分離與鑒定

2.3.1 分離原理 pH 區(qū)帶逆流色譜是利用不同化合物之間解離常數(shù)、疏水性的差異來實(shí)現(xiàn)分離［12］，待分離物流出以區(qū)帶pH 為順序，而后者與前者pKa值、疏水性相關(guān)。以分離生物堿（圖1） 為例，疏水性的該成分從洗脫酸中獲得質(zhì)子生成鹽而溶于流動(dòng)相中（位置④），流動(dòng)相中鹽與高pH 值固定相界面接觸（位置①），鹽被保留堿奪去質(zhì)子后生成疏水性的生物堿而溶于固定相中（位置②），此時(shí)保留堿邊界向前推移，生物堿又與洗脫酸界面接觸（位置③），疏水性的生物堿重新獲得質(zhì)子生成鹽又溶入到流動(dòng)相中（位置④），不斷地重復(fù)此循環(huán)過程，直到保留堿流出色譜柱為止［13-15］。

圖1 pH 區(qū)帶精制逆流色譜分離原理圖

2.3.2 分離過程

2.3.2.1 反相置換模式 將下相以30 mL／min 體積流量泵入高速逆流主機(jī)中作為固定相，整個(gè)分離管被固定相充滿后開啟主機(jī)，緩慢調(diào)節(jié)主機(jī)轉(zhuǎn)速達(dá)到850 r／min 并穩(wěn)定后，將樣品溶液注入進(jìn)樣環(huán)，以1.5 r／min 轉(zhuǎn)速泵入流動(dòng)相，開啟紫外檢測(cè)器、記錄儀，在254 nm 波長(zhǎng)處收集餾分，TLC合并并低溫干燥，得到40～90 min 餾分、化合物2，色譜圖見圖2。

圖2 N-氧化青藤堿pH 區(qū)帶精制逆流色譜圖

2.3.2.2 正相置換模式 HPLC 分析顯示，40～90 min 餾分為純度較低的化合物，故調(diào)整洗脫酸濃度（加入10 mmol／L 鹽酸），將上相設(shè)為固定相，下相設(shè)為流動(dòng)相，從中分離得到化合物1，色譜圖見圖3。

圖3 青藤堿pH 區(qū)帶精制逆流色譜圖

2.3.3 HPLC 分析條件 為了得到較好的峰形，實(shí)現(xiàn)基線分離，選擇甲醇-0.1% 三乙胺體系作為流動(dòng)相。分析采用Eclipse XDB-C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；體積流量1 mL／min；柱溫40 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)254 nm。色譜圖見圖4～6。

圖4 總生物堿HPLC 色譜圖

圖5 青藤堿HPLC 色譜圖

圖6 N-氧化青藤堿HPLC 色譜圖

2.3.4 結(jié)構(gòu)鑒定 化合物1：白色粉末，HR-ESI-MSm／z：330.170 0 ［M+H］+（計(jì)算值C19H23NO4）。1H-NMR （500 MHz，CDCl3）δ：6.52 （1H，d，J＝8.3 Hz，H-1），6.62（1H，d，J＝8.2 Hz，H-2），4.34 （1H，d，J＝15.6 Hz，H-5），2.43 （1H，d，J＝15.7 Hz，H-5），5.46 （1H，s，H-8），3.16 （1H，brs，H-9），3.01 （1H，brs，H-10），2.69 （1H，dd，J＝18.5，5.3 Hz，H-10），2.98 （1H，brs，H-14），1.89（1H，m，H-15），1.84 （1H，m，H-15），2.52 （1H，ddd，J＝11.9，4.5，2.1 Hz，H-16），2.06 （1H，td，J＝12.0，3.7 Hz，H-16），3.79 （3H，s，3-OCH3），3.48 （3H，s，7-OCH3），2.42 （3H，s，NCH3）；13C-NMR （125 MHz，CDCl3）δ：118.3 （C-1），109.1 （C-2），145.1 （C-3），144.8（C-4），49.4 （C-5），194.1 （C-6），152.5 （C-7），115.2 （C-8），56.8 （C-9），24.4 （C-10），130.5 （C-11），122.7 （C-12），40.6 （C-13），46.1 （C-14），36.2 （C-15），47.3 （C-16），56.2 （3-OCH3），54.9 （7-OCH3），42.9 （NCH3）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［16］ 報(bào)道一致，故鑒定為青藤堿。

化合物2：白色針晶，HR-ESI-MSm／z：344.150 3 ［MH］-（計(jì)算值C19H23NO5）。1H-NMR （500 MHz，DMSO-d6）δ：6.57 （1H，d，J＝8.4 Hz，H-1），6.82 （1H，d，J＝8.4 Hz，H-2），2.62 （1H，d，J＝15.5 Hz，H-5），4.17 （1H，d，J＝15.4 Hz，H-5），5.72 （1H，d，J＝2.2 Hz，H-8），3.99（1H，t，J＝4.4 Hz，H-9），3.16 （1H，brs，H-10），3.37（1H，brs，H-10），3.86 （1H，brs，H-14），2.32 （1H，brd，J＝4 Hz，H-15），1.77 （1H，brd，J＝13.3 Hz，H-15），3.18（1H，brd，J＝11.6 Hz，H-16），2.90 （1H，m，H-16），3.72（3H，s，3-OCH3），3.63 （3H，s，7-OCH3），3.35 （3H，s，NCH3）；13C-NMR （125 MHz，DMSO-d6）δ：118.5 （C-1），110.7 （C-2），146.2 （C-3），145.2 （C-4），47.7 （C-5），192.0 （C-6），151.9 （C-7），113.7 （C-8），71.5 （C-9），27.4 （C-10），125.8 （C-11），121.2 （C-12），38.7 （C-13），38.4 （C-14），30.8 （C-15），59.8 （C-16），55.9 （3-OCH3），54.6 （7-OCH3），56.2 （NCH3）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［6］ 報(bào)道一致，故鑒定為N-氧化青藤堿。

2.4 酶抑制活性研究

2.4.1 酪氨酸酶 在96 孔板中依次加入樣品溶液20 μL、酶液10 μL，混勻，37 ℃水浴10 min，加入40 μL 左旋多巴溶液，37 ℃水浴再反應(yīng)5 min，平行3 次，在475 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，計(jì)算抑制率，公式為抑制率＝｛1-［（A1-A2）／（B1-B2）］ ｝ ×100%，其中A1、A2、B1、B2分別為樣品組、背景組、陰性對(duì)照組、空白對(duì)照組吸光度。

2.4.2 α-葡萄糖苷酶 在96 孔板中依次加入PBS 緩沖液50 μL、樣品溶液20 μL、酶液10 μL，37 ℃水浴5 min 后加入20 μL PNPG，繼續(xù)水浴25 min 后取出，最后加入50 μL Na2CO3溶液終止反應(yīng)，平行3 次，在405 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，計(jì)算抑制率，公式為抑制率＝｛1-［（A1-A2）／（B1-B2）］ ｝ ×100%，其中A1、A2、B1、B2分別為樣品組、背景組、陰性對(duì)照組、空白對(duì)照組吸光度。

2.4.3 結(jié)果分析 圖7 顯示，青藤堿、N-氧化青藤堿酶抑制活性均存在量效關(guān)系，其中前者隨著其質(zhì)量濃度增加對(duì)酪氨酸酶的抑制活性大于后者，而后者隨著其質(zhì)量濃度增加對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制活性大于前者。表1 顯示，與陽性對(duì)照組（前者為曲酸，后者為阿卡波糖） 比較，青藤堿對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制活性升高（P＜0.05），而后者對(duì)酪氨酸酶的抑制活性升高（P＜0.01），但I(xiàn)C50值均較低。

表1 各化合物對(duì)酪氨酸酶、α-葡萄糖苷酶的IC50值（±s）

表1 各化合物對(duì)酪氨酸酶、α-葡萄糖苷酶的IC50值（±s）

注：與陽性對(duì)照組 （曲酸、阿卡波糖） 比較，* P ＜0.05，**P＜0.01。

樣品IC50／（μmol·L-1）酪氨酸酶α-葡萄糖苷酶青藤堿6 330±160.96 400±172*N-氧化青藤堿6 630±178.9**39 000±900曲酸69.6±0.088—阿卡波糖—0.001 24±0.000 015

圖7 各化合物對(duì)酪氨酸酶（A）、α-葡萄糖苷酶（B） 的抑制作用

3 討論與結(jié)論

生物堿是成藥性較高的一類化合物，但其分離一直都是天然產(chǎn)物化學(xué)研究領(lǐng)域的一大難題。pH 區(qū)帶精制逆流色譜法主要根據(jù)不同化合物在溶劑中的解離常數(shù)和疏水性的不同而實(shí)現(xiàn)分離，可有效解決普通的柱色譜法存在的吸附嚴(yán)重、拖尾、收率低的問題。本實(shí)驗(yàn)采用該方法快速高效地從廣西地不容非藥用部位中分離到青藤堿、N-氧化青藤堿，可為這2 種生物堿的大規(guī)模生產(chǎn)提供指導(dǎo)，也為其他生物堿的分離制備提供新方法。另外，廣西地不容非藥用部位資源豐富，生物堿含量高（尤其是青藤堿、N-氧化青藤堿），開發(fā)潛力巨大，能否成為替代資源仍需進(jìn)一步研究。