楊遠(yuǎn)貴，李 凡，許洪波，周新朋，衛(wèi)培峰，唐志書(shū)，5*

[1.陜西中醫(yī)藥大學(xué)，陜西省中藥資源產(chǎn)業(yè)化協(xié)同創(chuàng)新中心，秦藥特色資源研究開(kāi)發(fā)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（培育），陜西 咸陽(yáng) 712046；2.陜西國(guó)際商貿(mào)學(xué)院，陜西 咸陽(yáng) 712046；3.山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，山東 濟(jì)南 250014；4.陜西中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院，陜西 咸陽(yáng) 712000；5.中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院，北京 100700]

肺癌是癌癥相關(guān)疾病死亡的主要原因，統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)肺癌占癌癥死亡的19.4%［1］。目前，化療是治療肺癌病人的主要手段［2］，為提高肺癌患者的生活質(zhì)量和生存期，亟待開(kāi)發(fā)新的肺癌治療藥物。重樓具有清熱解毒、消腫止痛、涼肝定驚的功效［3］，可用于治療鼻咽癌、肺癌、胃癌、肝癌、乳腺癌、子宮肌瘤、白血病等［4］。研究發(fā)現(xiàn)，重樓皂苷Ⅰ、Ⅶ可有效抑制NSCLC 細(xì)胞系A(chǔ)549 的增殖、轉(zhuǎn)移［5］，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡［6］。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)與傳統(tǒng)藥理學(xué)不同，從系統(tǒng)和整體角度研究藥物、靶點(diǎn)、疾病，更能符合中藥的整體觀，其用于中藥的研究具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)［7-8］。Wang 等［9］采用LC-MS 法和網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究毛茛抗類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)及其分子機(jī)制，共發(fā)現(xiàn)9 種活性成分是毛茛化合物-靶點(diǎn)-通路中的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)，采用類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎滑膜成纖維細(xì)胞進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果表明小檗堿和甲氧醉椒素具有抗類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的作用。

針對(duì)重樓抗肺癌藥效物質(zhì)及作用機(jī)制存在的問(wèn)題，本研究以重樓為研究對(duì)象，采用UPLC-Q-TOF-MS／MS 法對(duì)重樓中化學(xué)成分進(jìn)行整體表征，結(jié)合網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)辨識(shí)重樓抗肺癌的活性成分，分析重樓抗肺癌活性關(guān)鍵靶點(diǎn)和作用機(jī)制，探討其藥效物質(zhì)基礎(chǔ)，為質(zhì)量控制的提升提供參考。

1 材料

1.1 儀器 Shimadzu LC-30A 高效液相色譜儀，串聯(lián)飛行時(shí)間質(zhì)譜儀，配有LC-30A 二元液相泵、SIL-30AC 自動(dòng)進(jìn)樣器、CTO-20AC 柱溫箱（日本Shimazdzu 公司）；KQ5200超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；Sartorius BSA 124S-CW 電子分析天平［萬(wàn)分之一，賽多利斯科學(xué)儀器（北京） 有限公司］；Eppendorf 5424R 離心機(jī) （德國(guó)Eppendorf 公司）；S0200-230V 渦旋混合儀（深圳市賽泰克生物科技有限公司）；Milli-Q 超純水系統(tǒng)（美國(guó)Millipore公司）。

1.2 試劑與藥物 重樓為云南省麗江市5 年生滇重樓，由云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院藥用植物所王元忠副研究員鑒定為正品。重樓皂苷Ⅰ、重樓皂苷Ⅱ、重樓皂苷Ⅵ、重樓皂苷Ⅶ對(duì)照品購(gòu)自成都普瑞法科技開(kāi)發(fā)有限公司；重樓皂苷Ⅴ、重樓皂苷Ⅲ購(gòu)自成都曼思特生物科技有限公司。甲酸、乙腈、甲醇為色譜純，購(gòu)自美國(guó)賽默飛世爾公司；甲醇為分析純，購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)上海有限公司。

2 方法

2.1 UPLC-Q-TOF-MS／MS 條件

2.1.1 色譜 ACQUITY UPLCTM HSS T3 色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.8 μm）；流動(dòng)相0.1% 甲酸（A）-乙腈（B），梯度洗脫（0～5 min，19% B；5～15 min，19%～28% B；15～25 min，28%～40% B；25～35.5 min，40%～95% B；35.5～40 min，95%B；40～42 min，19%B）；體積流量0.3 mL／min；進(jìn)樣量2 μL。

2.1.2 質(zhì)譜 電噴霧（ESI） 離子源；負(fù)離子模式；氣簾氣35 psi （1 psi＝6.895 kPa）；離子化電壓4 500 V；加熱模塊溫度500 ℃；噴霧氣55 psi；輔助加熱氣50 psi；碰撞電壓20～60 V；質(zhì)譜掃描范圍m／z100～1 500。

2.2 對(duì)照品溶液制備 精密稱(chēng)取重樓皂苷Ⅰ（5.01 mg）、重樓皂苷Ⅱ（5.42 mg）、重樓皂苷Ⅲ（5.23 mg）、重樓皂苷Ⅴ（5.64 mg）、重樓皂苷Ⅵ（5.26 mg）、重樓皂苷Ⅶ（5.48 mg），溶于5 mL 量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.3 供試品溶液制備 稱(chēng)取滇重樓粉末（過(guò)4 號(hào)篩）1.003 g，精密稱(chēng)定，置于100 mL 錐形瓶中，加入25 mL 70%甲醇，稱(chēng)定質(zhì)量，超聲處理（功率250 W、頻率100 kHz） 50 min，靜置，補(bǔ)足減失的質(zhì)量，過(guò)濾，取續(xù)濾液，即得。

2.4 化合物結(jié)構(gòu)解析 整理重樓化學(xué)成分?jǐn)?shù)據(jù)庫(kù)，將包含化合物名稱(chēng)、分子量、分子式、代表性碎片、化合物藥用部位表格導(dǎo)入到LibraryView 中建立重樓化學(xué)成分?jǐn)?shù)據(jù)庫(kù)。打開(kāi)MasterView，將樣品數(shù)據(jù)導(dǎo)入，與已建立的數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行質(zhì)譜數(shù)據(jù)匹配，并進(jìn)行結(jié)果分析，將匹配程度較高（結(jié)果列表中顯示綠色高亮的化合物） 導(dǎo)出。結(jié)合數(shù)據(jù)庫(kù)匹配、對(duì)照品比對(duì)、樣品質(zhì)譜裂解碎片、文獻(xiàn)數(shù)據(jù)比對(duì)、化合物結(jié)構(gòu)組成等相關(guān)信息，對(duì)滇重樓色譜峰進(jìn)行定性鑒別。

2.5 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析

2.5.1 重樓化學(xué)成分-靶點(diǎn)預(yù)測(cè) 將重樓提取物表征出來(lái)的化合物，采用 Chemspider 數(shù)據(jù)庫(kù) （http：／／www.chemspider.com／Default.aspx），查詢(xún)活性成分的Canonical SMILES 字符串；將查詢(xún)到的字符串輸入到Swiss Target Prediction 數(shù)據(jù)庫(kù)（http：／／www.swisstargetprediction.ch／），從而獲得每個(gè)成分的潛在靶點(diǎn)。以“l(fā)ung cancer”為關(guān)鍵詞進(jìn)行檢索，以相關(guān)性分?jǐn)?shù)（Relevance score＞20）作為篩選條件，得到肺癌的相關(guān)靶點(diǎn)。利用網(wǎng)絡(luò)平臺(tái)繪制韋恩圖 （http：／／bioinformatics.psb.ugent.be／webtools／Venn） 獲得成分和疾病的共有靶點(diǎn)。

2.5.2 蛋白-蛋白互作網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 運(yùn)用Cytoscape 3.7.2 軟件構(gòu)建成分靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)，以節(jié)點(diǎn)表示化合物靶蛋白，邊表示化合物-靶點(diǎn)的相互作用，并篩選出靶點(diǎn)數(shù)靠前的成分作為重樓治療肺癌的有效成分。將靶點(diǎn)輸入String 數(shù)據(jù)庫(kù)，物種選擇“Homosapiens”，以Combined score＞0.9 作為篩選條件，得到PPI 網(wǎng)絡(luò)圖，并篩選出治療肺癌的關(guān)鍵靶點(diǎn)。采用DAVID 6.8 數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)治療肺癌的關(guān)鍵靶點(diǎn)進(jìn)行GO 和KEGG 分析。將KEGG 篩選排名靠前的與抗肺癌相關(guān)的信號(hào)通路，與重樓活性成分、作用靶點(diǎn)一一對(duì)應(yīng)，構(gòu)建“成分-靶點(diǎn)-通路” 多維網(wǎng)絡(luò)圖。

3 結(jié)果

3.1 重樓化學(xué)成分分析 總離子流圖見(jiàn)圖1，滇重樓化合物鑒定見(jiàn)表1?；衔镏饕匀ベ|(zhì)子化離子［M-H］-和醋酸根加合離子［M+HCOO］-離子化形式存在。裂解主要以化合物母核與糖鏈裂解為主。滇重樓提取物共鑒定出26 個(gè)化合物，包括17 個(gè)異螺甾烷醇型（9 個(gè)薯蕷皂苷型和8 個(gè)偏諾皂苷型）、1 個(gè)螺甾烷醇型、1 個(gè)C21 甾體化合物、2個(gè)黃酮類(lèi)、1 個(gè)其他類(lèi)型。

表1 滇重樓化合物鑒定

圖1 滇重樓總離子流圖

3.1.1 異螺甾烷醇型 異螺甾烷醇型為重樓皂苷的主要類(lèi)型，包括薯蕷皂苷型、偏諾皂苷型，17β 位有羥基取代為偏諾皂苷型。該類(lèi)型化合物一般在5、6 位有雙鍵，3β、7β 有羥基取代，3 位與D-葡萄糖、L-鼠李糖、L-阿拉伯糖等糖鏈，發(fā)生成苷反應(yīng)。峰2～3、6、13～15、18～19 為偏諾皂苷型。以峰6 和18 為例，進(jìn)行化合物解析。負(fù)離子模式下，峰6 的甲酸根加合離子為m／z1 107.496 0 ［M+HCOO］-，分子離子m／z1 061.489 9 ［M-H］-失去一分子木糖得到碎片離子m／z929.447 0，失去一分子鼠李糖和1個(gè)羥基基團(tuán)得到碎片離子m／z765.373 6，斷裂一分子夫糖生成碎片離子m／z619.310 3，失去一分子葡萄糖生成碎片離子m／z439.253 2，得到1 個(gè)不含糖鏈的母核結(jié)構(gòu)，根據(jù)化合物結(jié)構(gòu)和質(zhì)譜裂解碎片，推測(cè)峰6 為parisyunnanoside H，質(zhì)譜圖見(jiàn)圖2。峰18 分子離子m／z1 029.534 2，連續(xù)失去3 個(gè)鼠李糖，分別得到碎片離子m／z883.967 2、737.416 3、591.985 8，失去一分子葡萄糖得到碎片離子m／z429.136 3，結(jié)合化合物結(jié)構(gòu)、碎片離子、對(duì)照品比對(duì)，推測(cè)峰18 為重樓皂苷Ⅶ。

圖2 峰6 一級(jí)（A）、二級(jí)（B） 質(zhì)譜圖

根據(jù)化合物質(zhì)譜裂解信息，峰7、9～11、22～24 為薯蕷皂苷型。以峰22、24 為例，進(jìn)行化合物解析。負(fù)離子模式下，峰22 分子離子為m／z1 013.535 5，連續(xù)斷裂3 個(gè)鼠李糖，分別得到離子碎片m／z867.482 4、721.417 9、575.358 8，失去一分子的葡萄糖得到離子碎片m／z413.228 8，結(jié)合化合物結(jié)構(gòu)、碎片離子、對(duì)照品比對(duì)，推測(cè)峰22 為重樓皂苷Ⅱ，質(zhì)譜圖見(jiàn)圖3。峰24 分子離子m／z853.464 5 失去一分子阿拉伯糖得到碎片離子m／z721.418 7，失去一分子鼠李糖得到m／z575.361 9 碎片離子，失去一分子葡萄糖，生成母核結(jié)構(gòu)離子碎片m／z413.082 9。

圖3 峰22 一級(jí)（A）、二級(jí)（B） 質(zhì)譜圖

3.1.2 呋甾烷醇型和C21 甾體 呋甾烷醇型為F 環(huán)開(kāi)環(huán)的甾體皂苷，一般在C3-OH、C26-OH 位與葡萄糖成苷。根據(jù)化合物結(jié)構(gòu)、裂解碎片信息、文獻(xiàn)數(shù)據(jù)等，推測(cè)峰8 和峰12 為呋甾烷醇型皂苷。峰8 分子離子為m／z1 049.525 4，失去兩分子鼠李糖和兩分子葡萄糖（C3、C26位） 得到母核結(jié)構(gòu)碎片為m／z433.161 7，推測(cè)其為重樓皂苷G。峰12 甲酸根加合離子為m／z1 109.547 4，失去一分子鼠李糖得到碎片m／z917.483 0，失去一分子鼠李糖得到m／z755.431 0，失去C3位的葡萄糖產(chǎn)生碎片m／z593.373 0，失去C26位葡萄糖生成碎片m／z431.320 6，根據(jù)化合物結(jié)構(gòu)、質(zhì)譜裂解規(guī)律，推斷峰12 為重樓皂苷H。C21甾體皂苷為重樓皂苷活性成分，峰4 分子離子為m／z977.430 7，失去一分子鼠李糖生成碎片m／z845.384 3，失去一分子半乳糖生成碎片m／z665.321 2，斷裂一分子鼠李糖得到m／z519.260 3，推測(cè)峰4 為parisyunnanoside J。

3.1.3 其他 負(fù)離子模式下，峰21 分子離子m／z313.240 4 脫去一分子羰基生成碎片離子m／z285.228 4，根據(jù)質(zhì)譜裂解碎片、文獻(xiàn)數(shù)據(jù)對(duì)比，可推測(cè)為myrincitrin。峰26 分子離子失去一分子鼠李糖和一分子葡萄糖，生成黃酮母核結(jié)構(gòu)碎片離子m／z287.235 4，可推測(cè)為7-O-rhakaempferol-3-O-glc。峰1 分子離子m／z479.306 1 脫去一分子水生成碎片離子m／z461.292 1，失去C7H14O4支鏈結(jié)構(gòu)得到碎片m／z319.195 5，失去一分子C7H14O4和兩分子水生成m／z283.170 6，可推測(cè)為β-ecdysone。峰17 分子離子脫去一分子葡萄糖生成母核結(jié)構(gòu)m／z348.278 4。

3.2 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析

3.2.1 重樓治療肺癌的關(guān)鍵靶點(diǎn)分析 根據(jù)滇重樓化學(xué)成分表征，結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)，查詢(xún)滇重樓中化學(xué)成分Canonical SMILES 字符串。得到16 種活性成分，均具有抗肺癌作用，其中 UPLC-Q-TOF-MS／MS 法鑒定得到9 種成分 （βecdysone、重樓皂苷B、重樓皂苷Ⅱ、重樓皂苷G、重樓皂苷H、重樓皂苷Ⅰ、重樓皂苷Ⅲ、重樓皂苷Ⅵ、重樓皂苷Ⅴ），文獻(xiàn)查找得到7 種成分（dioscinin、chonglouoside SL-13、chonglousideSL-15、parisyunnanosideA、parisyunnanoside B、parisyunnanoside F、重樓皂苷F）。采用Swiss Target Prediction 平臺(tái)對(duì)16 種活性成分進(jìn)行靶基因預(yù)測(cè)，共得到455 個(gè)相關(guān)靶點(diǎn)，進(jìn)一步剔除重復(fù)靶點(diǎn)后得到靶點(diǎn)344 個(gè)。運(yùn)用GeneCards 數(shù)據(jù)庫(kù)篩選與肺癌相關(guān)的靶點(diǎn)，共23 470 個(gè)。剔除重復(fù)的并選擇相關(guān)性得分大于20 的肺癌相關(guān)靶點(diǎn)798 個(gè)。將重樓344 個(gè)活性成分靶點(diǎn)與798 個(gè)肺癌疾病靶點(diǎn)繪制韋恩圖（圖4），獲得滇重樓抗肺癌共性靶點(diǎn)91 個(gè)。

圖4 滇重樓提取物成分與肺癌靶點(diǎn)韋恩圖

3.2.2 活性成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)分析 將滇重樓中抑制肺癌作用的16 種活性成分和344 個(gè)交集靶點(diǎn)導(dǎo)入Cytoscape 軟件，構(gòu)建成分靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖，見(jiàn)圖5。結(jié)果顯示，共有92 個(gè)節(jié)點(diǎn)，16 個(gè)六邊形節(jié)點(diǎn)為重樓提取物的16 種活性成分，76 個(gè)圓形節(jié)點(diǎn)代表與成分對(duì)應(yīng)的潛在相關(guān)靶點(diǎn)。采用“NetworkAnalysizer” 分析網(wǎng)絡(luò)圖，得到化合物靶點(diǎn)相關(guān)度大小，得到重樓皂苷 VI、重樓皂苷 V、dioscinin、parisyunnanoside F、重樓皂苷I 為相關(guān)度較大的成分。

圖5 成分-潛在相關(guān)靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖

3.2.3 重樓治療肺癌的關(guān)鍵靶點(diǎn)PPI 網(wǎng)絡(luò) 將滇重樓抗肺癌靶點(diǎn)基因?qū)隨TRING 數(shù)據(jù)庫(kù)，查詢(xún)靶點(diǎn)的相互作用關(guān)系，進(jìn)行可視化分析得到疾病蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)圖，見(jiàn)圖6。將Combined score＞0.9 為篩選條件，共得到69 個(gè)關(guān)鍵的治療肺癌靶點(diǎn)。將這69 個(gè)靶點(diǎn)與對(duì)應(yīng)的成分進(jìn)行匹配，按照度值大小進(jìn)行排序，得到β-ecdysone、dioscinin、重樓皂苷B、重樓皂苷Ⅵ、重樓皂苷Ⅴ為貢獻(xiàn)較高成分。綜合活性成分-靶點(diǎn)分析結(jié)果，得到dioscinin、重樓皂苷Ⅵ、重樓皂苷Ⅴ為滇重樓治療肺癌的關(guān)鍵成分。

圖6 重樓治療肺癌潛在靶點(diǎn)的PPI 網(wǎng)絡(luò)圖

3.2.4 重樓治療肺癌的KEGG、GO 分析 GO 富集分析分為生物過(guò)程、細(xì)胞組成、分子功能。利用WebGestalt 對(duì)69個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)基因進(jìn)行GO 生物功能標(biāo)注，分別對(duì)前10 個(gè)條目進(jìn)行可視化分析，見(jiàn)圖7A。結(jié)果表明，生物過(guò)程主要涉及酪氨酸多肽磷酸化、酪氨酸多肽修飾、阿米巴型細(xì)胞遷移、組織遷移、跨突觸信號(hào)調(diào)節(jié)等。細(xì)胞組成主要影響膜筏、膜微區(qū)、遠(yuǎn)端軸突、質(zhì)膜筏。分子功能主要包括蛋白絲氨酸／蘇氨酸激酶活性、蛋白絲氨酸激酶活性、跨膜受體蛋白酪氨酸激酶活性等方面。

圖7 重樓活性成分GO 生物過(guò)程分析（A） 和活性成分-靶點(diǎn)KEGG 通路富集分析（B）

利用WebGestalt 數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)關(guān)鍵靶點(diǎn)基因進(jìn)行KEGG 富集分析。由圖7B 可知，關(guān)鍵靶點(diǎn)主要富集通路為PI3K-Akt信號(hào)通路、Ras 信號(hào)通路、MAPK 信號(hào)通路、鈣離子信號(hào)通路、Rap1 信號(hào)通路、蛋白聚糖等。

4 討論

滇重樓提取液化學(xué)共鑒定出活性成分26 種，多數(shù)為異螺甾烷醇型皂苷，包含薯蕷皂苷型和偏諾皂苷型。研究發(fā)現(xiàn)，薯蕷皂苷型重樓皂苷Ⅰ、重樓皂苷Ⅱ、重樓皂苷Ⅴ，偏諾皂苷型重樓皂苷Ⅵ、重樓皂苷Ⅶ，均具有良好的抗腫瘤活性［10-13］，為滇重樓提取液抗腫瘤提供理論支持。中藥發(fā)揮藥效為多成分、多靶點(diǎn)協(xié)同作用的結(jié)果。中藥提取液中包含大量活性成分，那些成分可以發(fā)揮協(xié)同增效作用。有必要對(duì)中藥中活性成分，進(jìn)行整體藥效關(guān)聯(lián)分析，尋找具有協(xié)同增效的功效成分。

本研究在全面表征滇重樓活性成分的基礎(chǔ)上，對(duì)活性成分靶點(diǎn)及肺癌相關(guān)靶點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測(cè)，取兩者交集進(jìn)行后續(xù)成分-靶點(diǎn)關(guān)聯(lián)分析。篩選出了與功效相關(guān)的關(guān)鍵靶點(diǎn)，與靶點(diǎn)相關(guān)度較大的成分有dioscinin、重樓皂苷Ⅵ、重樓皂苷Ⅴ。研究發(fā)現(xiàn)，dioscinin 可抑制腫瘤細(xì)胞HeLa、L929、MCF 的增殖，從而發(fā)揮良好抗肺癌的作用［14］。重樓皂苷Ⅵ可抑制腫瘤細(xì)胞LA795，重樓皂苷Ⅴ可抑制腫瘤細(xì)胞HeLa、L929，有效抑制肺癌細(xì)胞的增長(zhǎng)［15］。結(jié)果表明，通過(guò)活性成分結(jié)合網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，可有效篩選具有抗肺癌作用的活性成分，這些成分在調(diào)控疾病相關(guān)靶點(diǎn)發(fā)揮了協(xié)同增效的作用。

滇重樓活性成分發(fā)揮抗肺癌作用，主要富集通路為PI3K-Akt 信號(hào)通路、Ras 信號(hào)通路、MAPK 信號(hào)通路等。PI3K-Akt 信號(hào)通路通過(guò)刺激活化PI3K，催化產(chǎn)生磷脂酰肌醇-3，4，5-三磷酸，下游靶點(diǎn)Akt 轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞膜上，進(jìn)一步被磷酸化獲得活性，從而發(fā)揮調(diào)控下游細(xì)胞功能。研究表明重樓皂苷Ⅱ能增加PI3K、Akt 磷酸化及mRNA 表達(dá)，從而抑制PI3K-Akt 信號(hào)通路來(lái)抑制重樓肺癌細(xì)胞生長(zhǎng)［14］。重樓皂苷Ⅶ能夠促進(jìn)AMPK 和Bcl-2 磷酸化，抑制PI3K／Akt／mTOR 磷酸化，從而誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞HepG2 凋亡［16］。MAPK 信號(hào)通路通過(guò)上游生長(zhǎng)因子與特定受體結(jié)合，逐級(jí)產(chǎn)生磷酸化反應(yīng)，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。Zhang 等［17］研究發(fā)現(xiàn)，重樓皂苷Ⅶ能夠增加JNK、ERK、p38 磷酸化水平，通過(guò)MAPK 信號(hào)通路，抑制腫瘤蛋白p53、PTEN 表達(dá)。此外，重樓皂苷Ⅶ通過(guò)MAPK 信號(hào)通路，抑制炎癥細(xì)胞因子TNFα、IL-1β、IL-6、一氧化氮合酶、環(huán)氧合酶-2 等水平，從而抑制LPS 誘導(dǎo)的RAW264.7 炎性細(xì)胞［18］。在Ras 信號(hào)通路中，Raf1 作為為主要效應(yīng)因子并發(fā)揮作用，研究證明其通過(guò)抑制腫瘤組織中Ras／Raf1 的表達(dá)，可有效抑制IL-6 等炎癥介質(zhì)水平。研究表明，重樓皂苷提取物及其單體成分能夠有效抑制肺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)。然而，對(duì)于Ras 信號(hào)通路的相關(guān)研究報(bào)道較少。

5 結(jié)論

本研究采用UPLC-Q-TOF-MS 技術(shù)結(jié)合網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)明確了重樓抗肺癌的關(guān)鍵活性成分是dioscinin、重樓皂苷Ⅵ、重樓皂苷Ⅴ。滇重樓活性成分發(fā)揮抗肺癌作用主要通過(guò)PI3KAkt 信號(hào)、Ras 信號(hào)、MAPK 信號(hào)等通路。通過(guò)篩選滇重樓抗肺癌作用的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)、潛在作用靶點(diǎn)及通路，為滇重樓抗肺癌新藥的研發(fā)提供理論依據(jù)。