張駱琪，李 森，崔如意，杜 霞，5，陳 鴻，王 猛，許海玉*

（1.中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所，北京 100700；2.中國(guó)科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所，北京 100101；3.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)中藥材學(xué)院，吉林 長(zhǎng)春 130118；4.中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中心，北京 100700；5.陜西省中醫(yī)藥研究院，陜西 西安 710003）

癌癥是由基因突變引起不受調(diào)節(jié)的細(xì)胞過(guò)度增殖的疾病，是全球第二大死亡原因。2012 年全球新發(fā)癌癥病例為1 410 萬(wàn)例，預(yù)計(jì)在2030 年癌癥發(fā)病高達(dá)2 170 萬(wàn)例［1］。抑制癌癥發(fā)展，減少高發(fā)病率的重要策略之一是靶向癌癥的藥物。癌癥的發(fā)生、發(fā)展與細(xì)胞增殖、凋亡等途徑密切相關(guān)。因此，細(xì)胞周期調(diào)控因子和凋亡刺激因子是開發(fā)潛在抗癌藥物的重要靶點(diǎn)。

MAPK 通路（RAS-RAF-MEK-ERK） 是關(guān)鍵的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路，參與調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期、細(xì)胞存活、血管生成、細(xì)胞遷移等過(guò)程［2-3］。通過(guò)抑制MAPK 通路的異常激活，會(huì)減少癌細(xì)胞增殖、侵襲能力及生長(zhǎng)，促進(jìn)癌細(xì)胞凋亡［4-5］。目前臨床上針對(duì)作用于MAPK 通路針對(duì)癌癥的抑制劑基本上是化學(xué)合成藥物，例如vemurafenib、dabrafenib、trametinib 等［6］。價(jià)格昂貴、不良反應(yīng)大、且容易產(chǎn)生耐藥性。

人參皂苷是一種固醇類天然產(chǎn)物，是人參、西洋參、三七等人參屬藥材的主要活性成分［7-8］。研究表明，人參等藥材在抗癌作用顯著，且減輕化療、放療的不良反應(yīng)，提高患者的生活質(zhì)量［8-9］。對(duì)其活性成分人參皂苷的作用機(jī)制進(jìn)行研究迫在眉睫。

人參皂苷種類繁多，作用靶點(diǎn)廣，實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證藥效周期長(zhǎng)，消耗經(jīng)費(fèi)巨大。通過(guò)分子對(duì)接技術(shù)預(yù)測(cè)活性成分-蛋白相互作用，分析構(gòu)效關(guān)系［10］。結(jié)合SPRi 技術(shù)高通量篩選，分析分子相互作用［11］。能夠快速篩選出最有希望的小分子進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

因此本研究運(yùn)用分子對(duì)接技術(shù)研究人參皂苷與MAPK通路相互作用的潛在機(jī)制，構(gòu)建“成分-靶點(diǎn)蛋白” 網(wǎng)絡(luò)模型，利用SPRi 技術(shù)篩選與核心靶點(diǎn)ERK1 結(jié)合的人參皂苷類成分，并進(jìn)一步通過(guò)分子對(duì)接技術(shù)確定其結(jié)合位點(diǎn)。

1 材料

1.1 儀器 PCR 擴(kuò)增儀 （北京東勝科技有限公司）；Superdex 200 increase 分子篩（美國(guó)GE Healthcare 公司）；Kx5 Sinstrument SPRi 儀（美國(guó)Plexera 公司）。

1.2 試劑 ginsenoside Rb1、ginsenoside Rb2、ginsenoside Rg1、ginsenoside Rg3、ginsenoside Rc、ginsenoside Re、ginsenoside Rd 等27 個(gè)小分子（成都曼思特生物科技有限公司）；限制性核酸內(nèi)切酶AscI、NotI、T4 DNA Ligase （美國(guó)NEB 公司）；Trans-T1 感受態(tài)細(xì)胞、BL21 （DE3） 感受態(tài)細(xì)胞、pET-24-2-his 質(zhì)粒（北京全式金生物技術(shù)有限公司）。引物合成及測(cè)序由北京擎科生物科技股份有限公司完成。

2 方法

2.1 分子對(duì)接

2.1.1 小分子準(zhǔn)備 小分子結(jié)構(gòu)來(lái)源于PubChem 數(shù)據(jù)庫(kù)（https：／／pubchem.ncbi.nlm.nih.gov／） 和ECTM 數(shù)據(jù)庫(kù)（http：／／www.tcmip.cn／ETCM／index.php／Home／Index／），使用Chem3D 19.0 軟件構(gòu)建小分子3D 結(jié)構(gòu)的MOL2 格式文件，并將MOL2 格式文件轉(zhuǎn)化為AutoDock Vina 分子對(duì)接（http：／／vina.scripps.edu／） 可識(shí)別的PDBQT 格式文件。

2.1.2 靶點(diǎn)蛋白準(zhǔn)備 通過(guò)KEGG 數(shù)據(jù)庫(kù)及相關(guān)文獻(xiàn)收集ERK 通路的相關(guān)蛋白［12］，從RCSB PDB 數(shù)據(jù)庫(kù) （www.rcsb.org） 獲得ERK 通路中關(guān)鍵蛋白的晶體結(jié)構(gòu)。AutoDock 軟件對(duì)蛋白結(jié)構(gòu)進(jìn)行優(yōu)化，添加缺失氫原子，減去多余水分子。

2.1.3 確定活性口袋及分子對(duì)接步驟 根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道以及PyMOL 1.8.6 軟件插件GetBox Plugin 確定蛋白分子的活性口袋（表1）。AutoDock Vina 和Python 腳本進(jìn)行高通量分子對(duì)接。以結(jié)合能作為評(píng)價(jià)函數(shù)，分析小分子與蛋白的最佳結(jié)合方式。PyMOL 可視化小分子和蛋白結(jié)合模式，并分析關(guān)鍵結(jié)合位點(diǎn)。

表1 靶點(diǎn)蛋白活性口袋

2.1.4 人參皂苷與蛋白作用網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建 采用Cytoscape 3.7.2 軟件構(gòu)建人參皂苷與靶點(diǎn)蛋白互作的網(wǎng)絡(luò)模型。

2.2 制備ERK1 蛋白

從表1可以看出，廣西金融術(shù)語(yǔ)的翻譯過(guò)于放在字面的翻譯，而忽略了實(shí)際的意義體現(xiàn)。但是，縱觀后期的金融翻譯，廣西金融翻譯也出現(xiàn)了采用香港金融翻譯的現(xiàn)象。[4]

2.2.1 構(gòu)建原核表達(dá)載體 根據(jù)NCBI 收錄的人ERK1 基因的CDS 序列和原核表達(dá)質(zhì)粒（pET-24-2-his） 酶切位點(diǎn)設(shè)計(jì)引物，利用高保真DNA 聚合酶進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，獲得帶有酶切位點(diǎn)的ERK1 基因CDS 序列，用AscI、NotI 限制性內(nèi)切酶對(duì)PCR 產(chǎn)物和質(zhì)粒在37 ℃、90 min 條件下進(jìn)行酶切，酶切產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，并純化回收；純化回收的ERK1 片段和質(zhì)粒片段在16 ℃下通過(guò)T4 DNA 連接酶連接120 min；連接產(chǎn)物通過(guò)熱激法轉(zhuǎn)入Trans-T1 感受態(tài)細(xì)胞內(nèi)，37 ℃培養(yǎng)12～16 h，挑選單菌落，并進(jìn)行菌液PCR 篩選陽(yáng)性克隆，測(cè)序驗(yàn)證。選取序列完全正確的菌液進(jìn)行質(zhì)粒提取，提取后的質(zhì)粒通過(guò)熱激法轉(zhuǎn)入原核表達(dá)細(xì)菌BL21（DE3） 中，選取陽(yáng)性克隆進(jìn)行后續(xù)蛋白表達(dá)。

2.2.2 重組蛋白誘導(dǎo)表達(dá) 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化菌在含Kan 抗性的LB 培養(yǎng)液中進(jìn)行培養(yǎng)，當(dāng)菌液OD600nm為0.6～0.8 時(shí)，調(diào)整溫度為17 ℃，加入IPTG 終濃度為0.4 mmol／L，誘導(dǎo)蛋白表達(dá)16 h。在4 ℃下4 500 r／min 離心10 min，收集菌體。每1 g 菌體中加入5 mL 破菌buffer （50 μL 蛋白酶抑制劑、50 μL 10 mg／mL 溶菌酶、25 μL DNaseI），混勻，冰浴30 min。使用高壓細(xì)胞破碎儀，在4 ℃下破碎4 次。在4 ℃下12 000 r／min 離心40 min，收集上清與沉淀。

2.2.3 蛋白純化 用鎳柱粗純化，將提取的粗蛋白上清與平衡好的beads，4 ℃結(jié)合60 min。15 mmol／L 咪唑洗脫，待洗脫液與G250 考馬斯亮藍(lán)溶液反應(yīng)不發(fā)生顏色變化時(shí)，則停止用該梯度咪唑溶液洗脫。通過(guò)相同步驟，依次用50、100、150、250 mmol／L 咪唑洗脫，收集洗脫液。

利用superdex 200 increase 分子篩柱純化蛋白。吸取樣品進(jìn)入進(jìn)樣環(huán)；pump path 改為inject，洗脫2 mL 時(shí)，將pump path 改為load，25 mL 洗脫。體積流量0.4 mL／min；壓力2 MPa。根據(jù)蛋白峰圖，收集樣品。通過(guò)SDS-PAGE 法鑒定純化的蛋白為單一條帶，見(jiàn)圖1。

2.3 SPRi 分析小分子與ERK1 蛋白的相互作用 參照Plexera 相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)流程，通過(guò)SPRi 分析儀分析ERK1 和人參皂苷的相互作用。人參皂苷均用DMSO 配制濃度為20 mmol／L 的母液，ERK1 蛋白母液用含有150 mmol／L NaCl 的50 mmol／L Tris-HCl （pH＝8.0） 緩沖溶液分別稀釋為0.5、1.0、5.0 μmol／L。選擇3D UVC 芯片，將5 mg／mL 人參皂苷種植于芯片表面，點(diǎn)樣濕度＜45%，溫度20 ℃，真空干燥，進(jìn)行光交聯(lián)反應(yīng)。

3 結(jié)果

3.1 分子對(duì)接 通過(guò)AutoDock Vina 進(jìn)行分子對(duì)接，分析27 種人參皂苷與靶點(diǎn)蛋白的相互作用，以Binding Energy 作為考察小分子配體與蛋白受體結(jié)合的指標(biāo)，結(jié)合能小于-1.2 kcal／mol或者小于-5 kJ／mol，則認(rèn)為小分子與蛋白可以結(jié)合。選擇結(jié)合能最低、小分子結(jié)構(gòu)最舒展的結(jié)合構(gòu)象作為分子對(duì)接的結(jié)果，人參皂苷與靶點(diǎn)蛋白結(jié)合能匯總見(jiàn)表2。

表2 人參皂苷與靶點(diǎn)蛋白對(duì)接的結(jié)合能

篩選結(jié)合能小于-1.2 kcal／mol 的小分子-靶點(diǎn)蛋白繪制人參皂苷-靶點(diǎn)蛋白網(wǎng)絡(luò)，見(jiàn)圖2。由此可知，人參皂苷與MAPK 信號(hào)通路的相互作用存在1 個(gè)化合物作用于多靶點(diǎn)，也有多個(gè)化合物調(diào)控1 個(gè)靶點(diǎn)的情況，這體現(xiàn)了中藥多成分、多靶點(diǎn)協(xié)同調(diào)控的特點(diǎn)。

圖2 人參皂苷-MAPK 通路蛋白靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)

通過(guò)結(jié)合能高低分析這27 種人參皂苷成分與MAPK 信號(hào)通路上靶點(diǎn)蛋白的結(jié)合，發(fā)現(xiàn)27 種人參皂苷中，有21種人參皂苷成分與ERK1 的結(jié)合能低，例如ginsenoside Rh2、ginsenoside Rb3、ginsenoside CK 等。因此，選擇通過(guò)SPRi 實(shí)驗(yàn)對(duì)這21 種人參皂苷與ERK1 靶點(diǎn)蛋白的結(jié)合作用進(jìn)行研究。

圖3 SPRi 檢測(cè)ERK1 蛋白與7 種人參皂苷的結(jié)合能力

表3 ERK1 蛋白與7 種人參皂苷結(jié)合的動(dòng)力學(xué)、親和力參數(shù)

3.3 人參皂苷人參皂苷與ERK1 蛋白結(jié)合可視化 基于SPRi 結(jié)合結(jié)果，通過(guò)PyMOL 軟件對(duì) （20R）-ginsenoside Rg3、ginsenoside Rc、pseudoginsenoside Rh2 等7 種人參皂苷與ERK1 蛋白的分子對(duì)接進(jìn)行可視化，見(jiàn)圖4，并對(duì)人參皂苷與蛋白的結(jié)合作用進(jìn)一步分析，發(fā)現(xiàn)人參皂苷與ERK1結(jié)合的主要位點(diǎn)是Lys71、Glu88、Asp184。人參皂苷與ERK1 蛋白分子對(duì)接能和結(jié)合位點(diǎn)匯總結(jié)果見(jiàn)表4。

圖4 人參皂苷與ERK1 蛋白分子對(duì)接圖

表4 人參皂苷與ERK1 蛋白分子對(duì)接能和結(jié)合位點(diǎn)

4 討論

隨著科技的進(jìn)步，癌癥的治療手段多種多樣，包括化療、手術(shù)、放療等等，但癌癥愈后差、復(fù)發(fā)概率高、死亡率高，靶向抑制劑為癌癥的治療提供了更多的選擇。已經(jīng)有多項(xiàng)研究表明MAPK 通路在各種癌癥中的作用，針對(duì)MAPK 通路篩選靶向抑制劑的開發(fā)已經(jīng)取得了令人鼓舞的成果。但這些抑制劑主要作用于是RAF （vemurafenib、dabrafenib、encorafenib） 和MEK （trametinib、binimetinib、cobimetinib），關(guān)于ERK 的抑制劑很少［13］。

ERK1 在MAPK 通路上處于獨(dú)特位置，其上游分子RAF 除了MEK 外幾乎沒(méi)有其他效應(yīng)子，而MEK 除了ERK沒(méi)有其他底物；下游通路中，ERK 是唯一能夠刺激多種下游底物的激活劑［14-16］。抑制ERK1 活性能夠逆轉(zhuǎn)上游突變引起的MAPK 通路的異常激活，靶向ERK1 抑制劑在MAPK 信號(hào)通路異常導(dǎo)致的癌癥治療中起重要作用。目前關(guān)于ERK1 的抑制劑處于不同的臨床試驗(yàn)階段，ulixertinib（BVD-523）、GDC-0994、ASN007 等，然而這些抑制劑的缺點(diǎn)也是顯而易見(jiàn)的，它們的作用有限，抑制劑僅對(duì)少數(shù)特定的癌癥類型有效，因此，篩選新型的ERK 抑制劑是很有價(jià)值的研發(fā)方向。

人參皂苷具有廣泛的生物活性。本研究利用分子對(duì)接和SPRi 技術(shù)，挖掘分析人參皂苷調(diào)節(jié)MAPK 信號(hào)通路的關(guān)鍵成分和作用靶點(diǎn)。共篩選得到（20R）-ginsenoside Rg3、ginsenoside Rc、ginsenoside Rg1、pseudoginsenoside F11、panaxadiol、ginsenoside Rb2、pseudoginsenoside Rh2 等7 種成分，調(diào)節(jié)關(guān)鍵靶點(diǎn)ERK1。研究發(fā)現(xiàn)，人參能夠緩解非小細(xì)胞肺癌患者的嘔吐、腹瀉等癥狀，提高白細(xì)胞、血小板數(shù)量等，增強(qiáng)化療的效果、減少不良反應(yīng)、提高免疫力等［17］。人參根總提取物能夠在體內(nèi)和體外抑制MAPK 信號(hào)通路激活自噬、減輕炎癥［18］。Ginsenoside Rg1 能夠抑制6-OHDA 誘導(dǎo)的ERK1／2 磷酸化［19］；ginsenoside Rb2 通過(guò)作用于Ras-ERK1／2 信號(hào)通路來(lái)保護(hù)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞免受地塞米松誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡［20］。結(jié)合本實(shí)驗(yàn)結(jié)果，推測(cè)（20R）-ginsenoside Rg3、ginsenoside Rc、ginsenoside Rg1 等可能是人參等藥材抗癌的重要活性成分之一，能夠作用于ERK 蛋白靶點(diǎn)。

綜上所述，本研究基于分子對(duì)接和SPRi 技術(shù)分析了人參皂苷與ERK 信號(hào)通路的相互作用，為人參皂苷機(jī)制研究及ERK1 蛋白抑制劑研究提供方向，也為中藥體外篩選提供新思路。同時(shí)，體外和體內(nèi)存在一定差異，需要分子實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)等進(jìn)行分析驗(yàn)證。