高書春，杜卓琦，馬世平，鄧雪陽(yáng)

（中國(guó)藥科大學(xué)，江蘇 南京 211198）

糖尿病是一種常見的代謝疾病，受遺傳和環(huán)境因素等影響，發(fā)病率逐年增高［1］。糖尿病腦病是指糖尿病導(dǎo)致的中樞神經(jīng)系統(tǒng)病變，這種使大腦在結(jié)構(gòu)、神經(jīng)生理及認(rèn)知功能等方面發(fā)生病理改變是糖尿病最常見的并發(fā)癥之一［2］。阿爾茨海默病是一種慢性神經(jīng)退行性疾病，以記憶缺失逐漸進(jìn)展為癡呆特征的神經(jīng)退行性疾?。?］。糖尿病作為認(rèn)知功能障礙的獨(dú)立危險(xiǎn)因素之一，與阿爾茨海默病關(guān)系密切［4］。目前糖尿病腦病的治療仍以控制血糖為主，然而療效有限，而西藥治療可能會(huì)導(dǎo)致低血糖，誘發(fā)或加重神經(jīng)病變［5］。

糖尿病屬中醫(yī)學(xué)“消渴癥” 范疇［6-7］，阿爾茨海默病屬“呆病”［7］，無(wú)論是糖尿病還是阿爾茨海默病，其病因繁多，病情表現(xiàn)反復(fù)，暫無(wú)根治辦法，因此探索中藥多成分、多靶點(diǎn)的治療機(jī)制就顯得尤為重要。黃芩具有清熱燥濕、瀉火解毒、止血、安胎的功效，可用于糖尿病的治療［8］，因此認(rèn)為黃芩治療糖尿病腦病具有臨床應(yīng)用價(jià)值。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)以網(wǎng)絡(luò)為基礎(chǔ)，結(jié)合藥理學(xué)并涉及多層次、多方向的數(shù)據(jù)分析，在分子、細(xì)胞、生物過程及通路等方面解析藥物與疾病靶點(diǎn)之間多成分、多靶點(diǎn)、多通路的結(jié)果，這也與中醫(yī)藥的整體觀相同［9］。

1 材料與方法

1.1 黃芩活性成分篩選 通過中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)與分析平臺(tái) （TCMSP，https：／／tcmspw.com／tcmsp.php）［10］檢索黃芩的化學(xué)成分，根據(jù)黃芩ADME 性質(zhì)，以口服生物利用度 （oral bioavailability，OB） ≥30%，類藥性 （druglikeness，DL） ≥0.18 進(jìn)行篩選［11］，然后獲得其相關(guān)靶點(diǎn)蛋白，并根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)及PharmMapper 庫(kù)（http：／／lilabecust.cn／pharmmapper／index.html）、SwissTargetPrediction庫(kù)（http：／／swisstargetprediction.ch／） 進(jìn)行補(bǔ)充，并篩選符合糖尿病和阿爾茨海默病的靶點(diǎn)。利用UniProt 庫(kù)（https：／／www.uniprot.org／）、DrugBank 庫(kù)（https：／／go.drugbank.com／） 查詢靶點(diǎn)蛋白對(duì)應(yīng)的基因名，將黃芩活性化合物對(duì)應(yīng)的靶點(diǎn)蛋白進(jìn)行統(tǒng)一規(guī)范。

1.2 糖尿病和阿爾茨海默病靶點(diǎn)篩選 在OMIM 庫(kù)（https：／／www.omim.org／）、GeneCards 庫(kù) （https：／／www.genecards.org／）、Therapeutic Target Database （http：／／db.idrblab.net／ttd／） 及DrugBank庫(kù) （https：／／go.drugbank.com／） 中，以“diabetes mellitus” 為關(guān)鍵詞檢索糖尿病的潛在靶點(diǎn)，以“Alzheimer’s disease” 為關(guān)鍵詞檢索阿爾茨海默病的潛在靶點(diǎn)，依據(jù)潛在靶點(diǎn)與疾病的高相關(guān)性以及后續(xù)的網(wǎng)絡(luò)分析，對(duì)所得靶點(diǎn)按relevance score 值等由大到小，以4 倍中位數(shù)為閾值進(jìn)行篩選［12］，合并糖尿病和阿爾茨海默病的疾病靶點(diǎn)。

1.3 構(gòu)建黃芩活性成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò) 將靶點(diǎn)與黃芩活性成分導(dǎo)入Cytoscape3.7.2 軟件（https：／／cytoscape.org／） 構(gòu)建“活性成分-靶點(diǎn)” 網(wǎng)絡(luò)。

1.4 構(gòu)建黃芩-糖尿病-阿爾茨海默病靶點(diǎn)的PPI 網(wǎng)絡(luò) 將黃芩、糖尿病和阿爾茨海默病的靶點(diǎn)導(dǎo)入VENNY2.1（https：／／bioinfogp.cnb.csic.es／tools／venny／index.html）在線繪制韋恩圖，得到交集靶點(diǎn)，并將交集靶點(diǎn)上傳至STRING11.0 （https：／／string-db.org／），得到蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò) （protein-protein interaction networks，PPI），并將該P(yáng)PI 網(wǎng)絡(luò)信息保存為TSV 文件，導(dǎo)入Cytoscape3.7.2 中詳細(xì)繪制PPI 互作網(wǎng)絡(luò)并進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治?，根?jù)degree 值篩選關(guān)鍵靶點(diǎn)［13］。

1.5 GO 功能與KEGG 通路富集分析 將黃芩-糖尿病-阿爾茨海默病交集靶點(diǎn)上傳至Metascape 庫(kù)［14］（http：／／www.metascape.org／gp／index.html＃／main／step1） 中進(jìn)行基因本體（gene ontology，GO） 與京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG） 富集分析，獲得KEGG 通路結(jié)果及GO 富集分析中分子功能（molecular functions，MF）、細(xì)胞組成（cellular components，CC）、生物過程 （biological processes，BP）［15］，用GraphPad Prism 7 軟件進(jìn)行可視化。

1.6 構(gòu)建黃芩成分-疾病靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò) 將上述得到的核心通路和交集靶點(diǎn)、藥物成分導(dǎo)入到Cytoscape3.7.2 軟件中，構(gòu)建“藥物-成分-疾病靶點(diǎn)-通路” 網(wǎng)絡(luò)圖，利用內(nèi)部工具Network Analyzer 對(duì)黃芩活性成分及交集靶點(diǎn)進(jìn)行拓?fù)鋵W(xué)分析。

1.7 分子對(duì)接 利用TCMSP 獲得主要活性成分的mol2 結(jié)構(gòu)，在PDB （http：／／www.rcsb.org／） 數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索核心靶點(diǎn)的三維結(jié)構(gòu)，利用Auto Dock Tools 1.5.6 軟件對(duì)蛋白3D 結(jié)構(gòu)進(jìn)行去水、加氫并計(jì)算電荷，保存為pdbqt 格式；同法將活性成分的mol2 結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)為pdbqt 格式。最后用Auto Dock Tools 1.5.6 軟件進(jìn)行分子對(duì)接，并用Pymol 2.4.1 進(jìn)行可視化。

2 結(jié)果

2.1 黃芩活性成分的篩選及成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建 經(jīng)過檢索TCMSP 庫(kù)，篩選獲得黃芩活性成分36 種，進(jìn)一步查詢對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)，去重后獲得黃芩重要的活性成分22 種，見表1，其中僅黃芩中存在的成分為黃芩新素、黃芩黃酮Ⅱ、紅花素、二氫奧洛昔林、5，8，2'-三羥基-7-甲氧基黃酮、5，7，2，5-四羥基-8，6-二甲氧基黃酮，而2，6，2'，4'-四羥基-6'-甲氧基查爾酮因未查到靶點(diǎn)信息而舍去。篩選得到作用靶點(diǎn)146 個(gè)。黃芩成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)中有節(jié)點(diǎn)164 個(gè)，見圖1。

圖1 黃芩化合物-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖

表1 黃芩活性成分的基本信息

2.2 糖尿病和阿爾茨海默病靶點(diǎn)的獲取 糖尿病靶點(diǎn)主要來(lái)自于GeneCards 庫(kù)，獲得靶點(diǎn)6 134 個(gè)，其Relevance Score 值的4 倍中位數(shù)為7.9，score＞7.9 的靶點(diǎn)有1 299 個(gè)，再與OMIM 等庫(kù)合并，去重后獲得1 125 個(gè)糖尿病潛在靶點(diǎn)；同理獲得阿爾茨海默病靶點(diǎn)9 553 個(gè)，score＞5.06 的靶點(diǎn)有2 391 個(gè)，合并去重后獲得1 144 個(gè)糖尿病潛在靶點(diǎn)。

2.3 黃芩-糖尿病-阿爾茨海默病靶點(diǎn)的PPI 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 將上述獲得的146 個(gè)黃芩靶點(diǎn)，1 125 個(gè)糖尿病靶點(diǎn)，1 144個(gè)阿爾茨海默病靶點(diǎn)導(dǎo)入Venny2.1 繪制Venn 圖，見圖2。

圖2 黃芩、糖尿病、阿爾茨海默病靶點(diǎn)交集Venn 圖

將交集靶點(diǎn)上傳至STRING 11.0 （因?yàn)榇嬖? 個(gè)游離靶點(diǎn)，故實(shí)際得到的PPI 網(wǎng)絡(luò)中靶點(diǎn)為60 個(gè)） 進(jìn)行處理，接著導(dǎo)入Cytoscape 3.7.2 軟件中詳細(xì)繪制PPI 互作網(wǎng)絡(luò)，見圖3。STRING 數(shù)據(jù)分析可知節(jié)點(diǎn)數(shù)60 個(gè)，邊數(shù)630 條，平均節(jié)點(diǎn)度值20.7，預(yù)測(cè)的邊數(shù)248。在Cytoscape 中用內(nèi)部工具NetworkAnalyzer 進(jìn)行拓?fù)鋵W(xué)分析，篩選度值前二十的靶點(diǎn) （degree ＞28），分別為AKT1、IL-6、VEGFA、TNF、CASP3 JUN、TP53、FOS、EGFR、HSP90AA1、PTGS2、MMP9、NOS3、ESR1、CYCS、FN1、MAPK14、PPARG、CXCL8、CCL2。

圖3 黃芩、糖尿病、阿爾茨海默病交集靶點(diǎn)的PPI 網(wǎng)絡(luò)

2.4 核心靶點(diǎn)的GO 功能與KEGG 通路富集分析 將黃芩、糖尿病、阿爾茨海默病交集靶點(diǎn)經(jīng)Metascape 庫(kù)分析后，得到KEGG 通路258 條，GO 富集分析中分子功能（MF） 101條、細(xì)胞組成（CC） 76 條、生物過程（BP） 1 413 條。根據(jù)P值篩選得到KEGG 通路排名前二十的通路，見圖4，主要涉及AGE-RAGE 信號(hào)介導(dǎo)的糖尿病并發(fā)癥通路（AGERAGE signaling pathway in diabetic complications）、IL-17 信號(hào)通路（IL-17 signaling pathway）、MAPK 信號(hào)通路（MAPK signaling pathway）、TNF 信號(hào)通路（TNF signaling pathway）、磷脂酰肌醇3 激酶-蛋白激酶B 信號(hào)通路 （PI3K-Akt signaling pathway）、C 型凝集素受體信號(hào)通路（C-type lectin receptor signaling pathway）、胰島素抵抗通路 （insulin resistance） 等。

圖4 交集靶點(diǎn)KEGG 通路富集分析

GO 富集分析中，MF 主要涉及核受體活性 （nuclear receptor activity）、轉(zhuǎn)錄輔激活因子結(jié)合 （transcription coactivator binding）、類固醇激素受體 （steroid hormone receptor activity）、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域特異性結(jié)合（protein domain specific binding）、脂質(zhì)結(jié)合（lipid binding） 等，見圖5A。CC 主要涉及囊腔（vesicle lumen）、分泌顆粒腔（secretory granule lumen）、胞質(zhì)泡腔（cytoplasmic vesicle lumen）、膜微區(qū)（membrane microdomain）、膜區(qū)（membrane region）、受體復(fù)合物（receptor complex） 等，見圖5B。BP 主要涉及脂多糖的反應(yīng)（response to lipopolysaccharide）、活性氧代謝過程（reactive oxygen species metabolic process）、細(xì)胞對(duì)脂質(zhì)的反應(yīng) （cellular response to lipid）、氧化應(yīng)激反應(yīng)（response to oxidative stress）、心血管系統(tǒng)發(fā)育（cardiovascular system development）、MAPK 級(jí)聯(lián)的調(diào)節(jié)（regulation of MAPK cascade）、跨膜受體蛋白酪氨酸激酶信號(hào)通路 （transmembrane receptor protein tyrosine kinase signaling pathway） 等，見圖5C。

圖5 交集靶點(diǎn)GO 功能富集分析

2.5 黃芩成分-疾病靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 經(jīng)Cytoscape3.7.2軟件構(gòu)建“藥物成分-疾病靶點(diǎn)-通路” 網(wǎng)絡(luò)圖，見圖6。經(jīng)分析后可知，平均度值為7，度值靠前的成分主要是漢黃芩素、黃芩素、β-谷甾醇、金合歡素、降穿心蓮黃酮、紅花素、二氫奧洛昔林、5，8，2'-三羥基-7-甲氧基黃酮等，其中紅花素、二氫奧洛昔林、5，8，2'-三羥基-7-甲氧基黃酮等為黃芩中獨(dú)有的成分。度值靠前的靶點(diǎn)主要是AKT1、IL-6、JUN、MAPK14、FOS、TNF、PRKCA、VEGFA 等。

圖6 黃芩成分-疾病靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)

2.6 分子對(duì)接驗(yàn)證 將漢黃芩素、金合歡素、黃芩素、紅花素、二氫奧洛昔林、黃芩黃酮Ⅱ、5，7，2，5-四羥基-8，6-二甲氧基黃酮、降穿心蓮黃酮等活性成分與核心靶點(diǎn)VEGFA、AKT1、TNF、MAPK14、IL-6 進(jìn)行對(duì)接，對(duì)接結(jié)果見表2。由此可知，黃芩是通過多成分、多靶點(diǎn)以不同活性結(jié)合，進(jìn)一步驗(yàn)證了關(guān)鍵活性成分與核心交集靶點(diǎn)的相互作用。部分結(jié)果可視化后見圖7，其中氫鍵以虛線顯示，結(jié)合位點(diǎn)以不同顏色在蛋白質(zhì)與分子之間顯示。

圖7 黃芩活性成分與核心靶點(diǎn)的對(duì)接

表2 黃芩活性成分與核心靶點(diǎn)的分子對(duì)接結(jié)果

3 討論

黃芩性寒，味苦，具有瀉火除煩之功效，是歷代醫(yī)家治療神志病及消渴病的常用中藥。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)黃芩及其活性成分具有顯著的神經(jīng)保護(hù)活性，及抗氧化、抗神經(jīng)細(xì)胞凋亡等作用［16-18］。因此，本研究結(jié)合網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對(duì)接技術(shù)系統(tǒng)地探索黃芩治療糖尿病腦病的分子機(jī)制。

本研究對(duì)活性成分-靶點(diǎn)的研究中得到僅黃芩中存在的成分為黃芩新素、黃芩黃酮Ⅱ、紅花素、二氫奧洛昔林、5，8，2'-三羥基-7-甲氧基黃酮、5，7，2，5-四羥基-8，6-二甲氧基黃酮、2，6，2'，4'-四羥基-6'-甲氧基查爾酮，在相關(guān)實(shí)驗(yàn)研究中均有報(bào)道證實(shí)。Guo 等［19］研究發(fā)現(xiàn)漢黃芩素能減輕神經(jīng)炎癥，其作用機(jī)制與緩解Aβ 蛋白導(dǎo)致的認(rèn)知功能喪失有關(guān)［20］。黃芩素還可抑制小膠質(zhì)細(xì)胞活化，減少炎癥，減輕氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡［21-22］。漢黃芩素可以通過AKT／GLUT4 途徑發(fā)揮降血糖作用，以改善胰島素抵抗［23］。目前研究發(fā)現(xiàn)紅花素提取自黃芩莖葉總黃酮，其可以抑制Aβ 蛋白引起的神經(jīng)元凋亡，改善胰島素抵抗［24-26］。崔曉燕等［27］研究發(fā)現(xiàn)黃芩提取物在海馬和皮質(zhì)中可促使乙酰膽堿的合成，以此改善阿爾茨海默病表現(xiàn)出的學(xué)習(xí)記憶障礙。

本研究通過構(gòu)建活性成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)、PPI 網(wǎng)絡(luò)及疾病-靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)，經(jīng)網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治觯Y選出一部分重要的靶點(diǎn)，度值靠前的成分主要是漢黃芩素、黃芩素、β-谷甾醇、金合歡素、降穿心蓮黃酮、紅花素、二氫奧洛昔林、5，8，2'-三羥基-7-甲氧基黃酮等，其中紅花素、二氫奧洛昔林、5，8，2'-三羥基-7-甲氧基黃酮等為黃芩中獨(dú)有的成分。度值靠前的靶點(diǎn)主要是AKT1、IL-6、JUN、MAPK14、FOS、TNF、PRKCA、VEGFA 等，其在基礎(chǔ)研究中均得到驗(yàn)證，說(shuō)明這些靶點(diǎn)對(duì)糖尿病腦病的重要性。在糖尿病中，一方面AKT1 的過表達(dá)可促進(jìn)葡萄糖的吸收，另一方面AKT 可抑制胰高血糖素的分泌，其機(jī)制與改善胰島素抵抗有關(guān)［28-29］。在阿爾茨海默病中，AKT1 磷酸化表達(dá)的增加被認(rèn)為與淀粉樣蛋白負(fù)荷增加有關(guān)［30］；腫瘤壞死因子和IL-6 在葡萄糖和脂質(zhì)代謝、心血管功能中起重要作用；IL-6 的升高被認(rèn)為與炎癥、胰島素抵抗和β 細(xì)胞功能障礙的發(fā)展有關(guān)［31］；慢性應(yīng)激和Aβ 蛋白會(huì)破壞小膠質(zhì)細(xì)胞的活性，導(dǎo)致IL-6 進(jìn)一步釋放［32］；MAPK14 參與了自噬過程，抑制MAPK14 的活性一定程度上可以緩解病癥，也可通過靶向調(diào)節(jié)MAPK14 表達(dá)來(lái)減少Aβ 蛋白沉積以減輕病癥［33-34］。目前研究發(fā)現(xiàn)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF） 的變異與糖尿病、阿爾茨海默病發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)增加有關(guān)，還可能與其他神經(jīng)系統(tǒng)疾病有關(guān)［35-36］。

本研究通過KEGG 富集通路分析，得出黃芩治療糖尿病腦病的主要通路涉及AGE-RAGE 信號(hào)通路、IL-17 信號(hào)通路、MAPK 信號(hào)通路、TNF 信號(hào)通路、PI3K-Akt 信號(hào)通路等。AGE-RAGE 信號(hào)通路中AGE 與受體RAGE 結(jié)合，誘導(dǎo)促炎性細(xì)胞因子、ROS 的產(chǎn)生，影響神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的活力［37］，通過抑制AGE-RAGE 通路和隨后的氧化應(yīng)激、炎癥，可以預(yù)防糖尿病導(dǎo)致的神經(jīng)系統(tǒng)病變［38-39］。IL-17 和TNF 信號(hào)通路主要是通過誘發(fā)炎癥級(jí)聯(lián)通路的激活導(dǎo)致糖尿病神經(jīng)系統(tǒng)病變，現(xiàn)階段普遍認(rèn)為通過抑制IL-17 和TNF 可以有效治療糖尿病及其相關(guān)并發(fā)癥［40-41］。PI3K-Akt信號(hào)通路被認(rèn)為是胰島素作用的主要介質(zhì)，在阿爾茨海默病患者腦中已觀察到PI3K 亞基表達(dá)降低，此外胰島素可以通過PI3K-Akt 信號(hào)通路增強(qiáng)神經(jīng)元生長(zhǎng)，而胰島素活性的恢復(fù)有望成為治療糖尿病及其并發(fā)癥認(rèn)知障礙的靶點(diǎn)［42-43］。

綜上所述，本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析得出，黃芩可能通過漢黃芩素、黃芩素、金合歡素、降穿心蓮黃酮、紅花素、二氫奧洛昔林等多成分，通過多靶點(diǎn)，以AGERAGE、IL-17、TNF、MAPK、PI3K-Akt 及胰島素抵抗等多種信號(hào)通路，影響糖尿病涉及的炎癥、氧化應(yīng)激、胰島素活性等多種方式，來(lái)緩解并發(fā)癥阿爾茨海默病，并利用分子對(duì)接來(lái)驗(yàn)證關(guān)鍵活性成分和核心靶點(diǎn)的相互作用。本研究結(jié)果為黃芩治療糖尿病腦病提供了一定的理論指導(dǎo)和方向，但仍需進(jìn)一步開展相關(guān)的藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)，進(jìn)一步驗(yàn)證和闡明黃芩治療糖尿病腦病的作用機(jī)制。