張 巖，劉慶煥，王 宏，康 利，劉偉偉，陳 冠，傅 予

（天津市醫(yī)藥科學研究所，天津 300020）

貫葉金絲桃為藤黃科金絲桃屬植物貫葉金絲桃HypericumperforatumL.的干燥地上部分，具有多種藥理作用，為近年來研究的熱點草藥之一［1］。貫葉金絲桃中黃酮類成分含量豐富，為其主要活性成分之一，具有抗炎、抗病毒、抗腫瘤等多種生理活性，可用于防治心腦血管疾病［2-4］。缺血性腦損傷具有高發(fā)病率和致殘率，為嚴重危害人類生命健康的腦血管意外多發(fā)?。?］。研究證實黃酮類化合物對缺血性腦損傷具有保護作用［6］，因此推測貫葉金絲桃中黃酮類成分可能對缺血性腦損傷有一定保護作用。

網絡藥理學在揭示藥物、疾病關系方面具有整體性和系統(tǒng)性的特點，這與中藥多組分、多靶點的治病特點相吻合［7-8］。因此，本研究擬采用網絡藥理學方法揭示貫葉金絲桃中黃酮類成分對缺血性腦損傷的治療作用，探討其多成分、多靶點的作用機制，并采用動物實驗對其作用靶點進行驗證，以期為進一步研究其治療缺血性腦損傷的作用機制奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 網絡藥理學

1.1.1 貫葉金絲桃中黃酮類活性成分及靶點篩選 基于中草藥藥理學分析平臺TCMSP （https：／／tcmspw.com／tcmsp.php） 檢索貫葉金絲桃中黃酮類成分，并篩選口服生物利用度（OB） 值＞30%、類藥性（DL） 值＞0.18 的黃酮類成分；結合前期工作并檢索文獻數據庫獲取貫葉金絲桃中含有的已被證實的黃酮類藥效成分，對于沒有收載的成分則利用ChemDraw 軟件繪制成分結構并在molsoft 分析平臺上（http：／／www.molsoft.com／mprop／） 進行類藥性預測，選取類藥性評分0.9 以上的成分。綜合檢索結果，最終獲得貫葉金絲桃中黃酮類活性成分。

利用TCMSP 平臺檢索黃酮類活性成分的相關靶點，對于平臺中沒有收錄靶點的成分，通過SwissTargetPredicition（https：／／www.swisstargetprediction.ch） 靶點預測平臺進行靶點預測。

1.1.2 檢索缺血性腦損傷靶點 以“stroke” “cerebral ischemia” “ischemia” 為關鍵詞，利用TTD （https：／／bidd.nus.edu.sg／BIDD-Databases／TTD／TTD.asp） 數據庫、DrugBank （https：／／www.drugbank.ca） 數據庫檢索缺血性腦損傷疾病的相關靶點。

1.1.3 活性成分治療缺血性腦損傷潛在靶點預測 利用VENNY 2.1 平臺 （https：／／bioinfogp.cnb.csic.es／tools／venny／index.html） 對成分靶點和疾病靶點構建韋恩圖，并取交集以獲得兩者共有靶點，即為貫葉金絲桃黃酮類成分治療缺血性損傷疾病的潛在靶點。

1.1.4 藥物成分-靶點-疾病網絡構建 對貫葉金絲桃中黃酮類成分、缺血性損傷疾病及其相關靶點構建網絡分析模型并利用Cytoscape 軟件進行可視化分析。

1.1.5 潛在靶點PPI 網絡構建與分析 利用SRING 在線分析平臺（https：／／string-db.org／） 獲取潛在靶點蛋白與蛋白間相互作用關系（PPI），并將分析結果導入Cytoscape 3.2.1 軟件進行可視化分析，并根據度值（Degree） 大小設置節(jié)點的大小、顏色，獲得最終的PPI 網絡。通過網絡節(jié)點中心性和網絡模塊2 種計算方式對PPI 網絡進行綜合分析，從中篩選貫葉金絲桃黃酮類成分治療缺血性腦損傷的關鍵靶點。

1.1.6 靶點生物功能和通路分析 使用Metascape 數據庫，限定物種為人，設定閾值P＜0.01，綜合獲取貫葉金絲桃黃酮類成分治療缺血性腦損傷相關靶點的生物功能注釋信息，并根據P值和富集結果對靶點基因本體論（GO） 和KEGG通路進行篩選分析。

1.2 動物實驗

1.2.1 動物 SPF 級健康雄性SD 大鼠40 只，體質量160～180 g，由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供［實驗動物生產許可證號SCXK （京） 2016-0006］，所有動物實驗部分均符合天津市醫(yī)藥科學研究所動物倫理委員會的要求（倫理號IMPS-EAEP-Z-Z2019017-01）。

1.2.2 藥物與試劑 貫葉金絲桃 （產地為四川，批號20190503） 購于亳州中藥材批發(fā)市場，經天津市醫(yī)藥科學研究所王文彤研究員鑒定為藤黃科植物貫葉金絲桃HypericumperforatumL.的干燥地上部分，取500 g 貫葉金絲桃藥材碎成粗粉，用60%乙醇加熱回流提取，過濾，濾液減壓回收乙醇至無醇味，加沸水溶解后抽濾，濾液用AB-8 大孔樹脂純化，不同體積分數乙醇溶液洗脫，收集60%乙醇洗脫液，濃縮干燥，即得總黃酮提取物［9］。尼莫地平片（規(guī)格30 mg／片，批號2003004，天津市中央藥業(yè)有限公司）；AB-8 大孔吸附樹脂（批號20201110，英德市東鴻化工科技有限公司）；紅四氮唑 （TTC，貨號L09A10S83253，上海源葉生物科技有限公司）；線栓（貨號2432-A4，北京西濃科技有限公司）。

1.2.3 模型制備 術前大鼠禁食不禁水12 h，腹腔注射10%水合氯醛（3.5 mL／kg） 進行麻醉，常規(guī)消毒，分離皮下組織，暴露頸內動脈（ICA）、頸外動脈（ECA） 和右側頸總動脈 （CCA），用5-0 號絲線結扎CCA 和ECA，在CCA 距離分叉處0.5 cm 左右剪一小口，將線栓送入切口并經ICA 順行至中動脈，遇到阻力時停止，即完成一側的MCAO 模型［10］，結扎ICA，縫合切口，2 h 后輕輕抽出線栓；假手術組只分離血管，不插線栓。術中白熾燈照射，使肛溫保持在（37±0.5）℃。

1.2.4 分組及給藥 將造模成功的大鼠按體質量隨機分為模型組、尼莫地平組（陽性對照，0.012 g／kg，相當于臨床用量的6 倍）、總黃酮組（0.012 4 g／kg，折合為生藥量5.491 g／kg，相當于臨床用量的4 倍）。造模當天開始灌胃給藥，每天1 次，連續(xù)7 d；假手術組和模型組灌胃給予等體積純凈水。

1.2.5 腦梗死面積比例測定 給藥結束后，大鼠斷頭取腦組織，冷鹽水沖洗，于-20 ℃放置10 min，切除嗅球、垂體、低位腦干，由前向后冠狀等分切成5 片。取腦片置于1% TTC 磷酸鹽緩沖液中，37 ℃避光溫育30 min，每5 min翻動1 次，并用4% 多聚甲醛固定。正常腦組織呈玫瑰紅色，梗死組織呈白色，精確剝離梗死組織，電子天平精密稱量梗死組織和全腦的質量并記錄［11］。公式為腦梗死面積比例＝（梗死部位質量／全腦質量） ×100%。

1.2.6 HE 染色觀察腦組織病理變化 取大鼠腦組織，用10%甲醛溶液固定，常規(guī)HE 染色，于顯微鏡下觀察腦組織皮質的形態(tài)學改變。

1.2.7 Western blot 法檢測腦組織INS、VEGFA、TNF-α 蛋白表達 取大鼠腦組織，提取總蛋白，經電泳、轉膜、封閉后，孵育一抗、二抗，顯影發(fā)光后計算目的蛋白相對表達。

1.2.8 統(tǒng)計學分析 通過SPSS 16.0 軟件進行處理，計量資料以（±s） 表示，多組間比較用單因素方差分析。P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 貫葉金絲桃黃酮類活性成分篩選 篩選得到貫葉金絲桃黃酮類成分有5 種，分別為槲皮素、兒茶素、山柰酚、木犀草素和表兒茶素。結合前期檢測結果和文獻報道發(fā)現，貫葉金絲桃中異槲皮苷、金絲桃苷、阿福豆苷、紫云英苷、蘆丁均可進入體內代謝并具有藥理活性，經預測槲皮素-3-O-β-D-吡喃阿拉伯糖苷類藥性評分為0.93，說明其成藥性良好。因此將上述11 種成分作為貫葉金絲桃黃酮類活性成分進行后續(xù)研究，活性成分信息見表1。

表1 貫葉金絲桃黃酮類化學成分

2.2 黃酮類活性成分治療缺血性腦損傷潛在靶點篩選 經數據庫檢索和預測共獲得11 種活性成分的222 個潛在靶標。TTD、DrugBank 數據庫中檢索的疾病靶點去除重復值，共得到539 個缺血性腦損傷靶點。利用VENNY 2.1 平臺構建韋恩圖（圖1） 取交集，最終獲得活性成分治療缺血性腦損傷疾病的76 個潛在靶點。

圖1 成分-疾病靶點韋恩圖

2.3 藥物成分-靶點-疾病網絡構建 “成分-靶點-疾病”網絡如圖2 所示，共有702 個節(jié)點，946 條邊，圖中綠色代表11 種黃酮類成分，黃色表示成分靶點，藍色表示疾病靶點，紅色為76 種成分治療疾病的潛在靶點，其中成分節(jié)點大小按Degree 值的高低進行設定，節(jié)點越大表示其可作用的潛在靶點越多，靶點邊線越多反映與其作用的成分越多，體現了貫葉金絲桃在治療缺血性腦損傷時具有多成分、多靶標的特點。

圖2 成分-靶點-疾病網絡

2.4 潛在靶點PPI 網絡構建與分析 利用SRING 在線分析平臺獲取潛在靶點的PPI，76 個靶點中只有74 個靶點具有相互作用，將具有相互作用的靶點進行可視化分析，獲得最終的PPI 網絡（圖3），節(jié)點越大、顏色越紅表示與該節(jié)點相關作用的靶點越多，其在網絡中的地位越重要。

圖3 PPI 網絡

基于Cytoscape 軟件對PPI 網絡靶點進行包括介度中心性（圖4A）、度中心性（圖4B） 和接近中心性（圖4C）在內的網絡節(jié)點中心性進行計算分析，分別篩選位于前十位的靶點建模；基于網絡模塊計算拓撲參數，建立并選取評分最高的MCODE 模型（圖4D）。綜合2 種方式計算結果，取交集并進行加權評分得到6 個關鍵性靶點INS、VEGFA、TNF、MAPK1、TP53、FOS，其中排名前三位的靶點分別為INS、VEGFA、TNF，推測其為貫葉金絲桃總黃酮治療缺血性腦損傷的關鍵靶點。

圖4 PPI 網絡分析模型

2.5 靶點生物功能和通路分析 GO 分析結果顯示，貫葉金絲桃關鍵靶點主要涉及了細胞質膜微囊、質膜筏和神經元投射細胞質等細胞成分；具有RNA 聚合酶Ⅱ基礎轉錄因子結合、無序結構域特異性結合、組蛋白乙酰轉移酶結合等分子功能；并且參與了缺氧反應中RNA 聚合酶Ⅱ啟動子轉錄的正調控、急性炎癥反應的負調控和神經元投射維持等生物過程，表明貫葉金絲桃黃酮類成分對缺血性腦損傷的治療作用與其對神經調節(jié)和缺氧反應調節(jié)有關，見圖5。

圖5 GO 分析結果

KEGG 通路富集分析發(fā)現，關鍵靶點發(fā)揮作用的主要通路為癌癥通路、卡波西肉瘤相關皰疹病毒感染、PI3KAkt 信號通路、流體剪應力與動脈粥樣硬化、人巨細胞病毒感染等信號通路，表明貫葉金絲桃黃酮類成分對缺血性腦損傷的治療作用與其對這些通路的調控密切相關，見圖6。

圖6 KEGG 通路分析結果

2.6 貫葉金絲桃總黃酮對MCAO 大鼠缺血性腦損傷的影響

2.6.1 貫葉金絲桃總黃酮對MCAO 大鼠腦梗死面積比例的影響 如圖7、表2 所示，與假手術組比較，模型組大鼠腦組織出現明顯的腦缺血損傷現象，腦梗死面積比例增加（P＜0.01）；與模型組比較，陽性藥組和總黃酮組大鼠腦梗死面積比例均減少（P＜0.01）。結果表明貫葉金絲桃總黃酮可以有效改善模型大鼠的腦缺血損傷程度。

圖7 各組大鼠腦組織TTC 染色

表2 貫葉金絲桃總黃酮對MCAO 大鼠腦梗死面積比例的影響（±s，n＝5）

表2 貫葉金絲桃總黃酮對MCAO 大鼠腦梗死面積比例的影響（±s，n＝5）

注：與假手術組比較，**P＜0.01；與模型組比較，＃＃P＜0.01。

組別腦梗死面積比例／%假手術組0模型組26.25±3.56**尼莫地平組7.87±2.53＃?？傸S酮組10.25±2.70＃＃

2.6.2 貫葉金絲桃總黃酮對MCAO 大鼠腦組織病理變化的影響 如圖8 所示，假手術組大鼠大腦皮層神經細胞、膠質細胞及毛細血管形態(tài)正常，結構完整，核仁清晰，胞漿無紅染；模型組大鼠缺血側大腦皮層神經元大片消失，錐體細胞明顯減少，排列紊亂，胞體變小，尼氏小體消失，核固縮深染，胞漿紅染，變性壞死后形成大量空泡，小膠質細胞增生明顯，腦組織水腫，細胞間隙增寬；與模型組比較，陽性藥組和總黃酮組大鼠缺血側大腦皮層病變明顯減輕，壞死神經元減少，錐體細胞數量增多，形態(tài)結構趨于正常，細胞核較規(guī)則，少量神經元胞體變小，偶見膠質細胞或巨噬細胞增生。結果表明貫葉金絲桃總黃酮可改善缺血性腦組織皮層病變，恢復神經元細胞形態(tài)結構。

圖8 各組大鼠腦組織皮層HE 染色（×200）

2.6.3 貫葉金絲桃總黃酮對MCAO 大鼠腦組織INS、VEGFA 和TNF-α 蛋白表達的影響 網絡藥理學研究結果顯示，INS、VEGFA 和TNF-α 為貫葉金絲桃總黃酮治療缺血性腦損傷中評分最高的3 個關鍵靶點。為了驗證網絡分析結果的準確性，本研究對大鼠腦組織INS、VEGFA 和TNFα 蛋白表達進行了檢測，如圖9、表3 所示，與假手術組比較，模型組大鼠腦組織INS、VEGFA 和TNF-α 蛋白表達均升高（P＜0.01）；與模型組比較，總黃酮組大鼠腦組織INS和TNF-α 蛋白表達降低（P＜0.05，P＜0.01），VEGFA 蛋白表達升高（P＜0.05）。

圖9 各組大鼠腦組織INS、VEGFA 和TNF-α 蛋白表達

表3 貫葉金絲桃總黃酮對MCAO 大鼠腦組織INS、VEGFA 和TNF-α 蛋白表達的影響（±s，n＝5）

表3 貫葉金絲桃總黃酮對MCAO 大鼠腦組織INS、VEGFA 和TNF-α 蛋白表達的影響（±s，n＝5）

注：與假手術組比較，**P ＜0.01；與模型組比較，＃P ＜0.05，＃＃P＜0.01。

組別INSVEGFATNF-α假手術組0.14±0.020.08±0.020.20±0.04模型組0.39±0.03**0.27±0.08**0.55±0.08**總黃酮組0.31±0.07＃0.41±0.06＃0.34±0.06＃＃

3 討論

本研究結果顯示，貫葉金絲桃在治療缺血性腦損傷疾病中體現了多成分、多靶點協(xié)同治療的特點，其治療靶點間存在著相互關系，共同發(fā)揮作用，其中INS、VEGFA、TNF、MAPK1、TP53 和FOS 在整個復雜的靶點網絡中具有核心調節(jié)作用，排名前三位的關鍵靶點為INS、VEGFA 和TNF。VEGF 為檢測腦梗死的一個重要指標，參與了血管的滲透性、腦組織水腫及神經功能的調節(jié)［12］。TNF 為重要的炎癥因子，其包含2 個成員TNF-α 和TNF-β，TNF-α 影響腦缺血區(qū)域細胞的壞死及凋亡程度［13］。研究顯示TNF-α 與INS 協(xié)同作用于腦梗死的發(fā)生發(fā)展過程，影響急性腦梗死患者的神經受損狀況及預后，并且TNF-α 可促使VEGF 產生調控障礙，促進腦卒中的形成和發(fā)展［14］。

KEGG 通路富集發(fā)現，貫葉金絲桃黃酮類成分可通過癌癥通路、卡波西肉瘤相關皰疹病毒感染、PI3K-Akt 信號通路、流體剪應力與動脈粥樣硬化、人巨細胞病毒感染等多個通路發(fā)揮作用，表明貫葉金絲桃中黃酮類成分對缺血性腦損傷的治療具有多成分、多靶點、多通路的作用特點，充分體現了中藥整體性、系統(tǒng)性的治病機制。

缺血性腦損傷的形成是由于局部腦血流的突然持續(xù)中斷，導致了大腦處于缺血缺氧狀態(tài)，造成了神經功能障礙等腦組織損傷甚至壞死［15］，因此對缺血缺氧狀態(tài)及恢復神經功能損傷的調節(jié)是治療缺血性腦損傷的重要途徑。經網絡分析發(fā)現貫葉金絲桃黃酮類成分關鍵靶點參與了缺氧反應中RNA 聚合酶Ⅱ啟動子轉錄的正調控、急性炎癥反應的負調控和神經元投射維持等生物過程，表明貫葉金絲桃黃酮類成分可用于神經調節(jié)、缺氧反應調節(jié)和炎性反應調節(jié)，初步印證了貫葉金絲桃黃酮類成分可用于治療缺血性腦損傷，并能減輕缺血性腦損傷引起的神經炎性反應。

為了驗證網絡分析結果，本研究通過動物實驗進一步探討了貫葉金絲桃總黃酮改善缺血性腦損傷的治療作用，結果表明貫葉金絲桃黃酮類成分可減輕大鼠腦缺血損傷程度，改善缺血性腦組織皮層及神經元細胞形態(tài)結構病變，上調缺血腦組織VEGFA 蛋白表達，下調INS 和TNF 蛋白表達，進而使腦缺血狀態(tài)和神經功能得以恢復。

綜上所述，本研究證實了貫葉金絲桃總黃酮對缺血性腦損傷的治療作用，該作用可能是通過調控關鍵靶點INS、VEGFA 和TNF-α 的表達來實現，這與網絡藥理學分析結果一致，說明該研究方法準確可靠，能為貫葉金絲桃總黃酮在缺血性腦損傷治療方面的開發(fā)應用及作用機制深入研究提供科學依據。